Name: visualization of macrophage lytic cell death during mycobacterial infection in zebrafish embryos via intravital microscopy
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy at JoVE.com

We bedanken Dr. zilong Wen voor het delen van zebravis stammen, Dr. Stefan oehlers en Dr. David Tobin voor het delen van M. de gerelateerde middelen, yuepeng hij voor hulp in de voorbereiding van de figuur. Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (81801977) (B.Y.), het uitstekende opleidingsprogramma voor jongeren van Shanghai Municipal Health Commission (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai Sailing Program (18YF1420400) (B.Y.) en het open fonds van Shanghai Key Laboratory of tuberculose (2018KF02) (B.Y.).

Zebravis werd onder standaardomstandigheden opgevoed in overeenstemming met de richtlijnen van het laboratorium dier voor ethische toetsing van dierenwelzijn (GB/T 35823-2018). Alle zebravis experimenten in deze studie werden goedgekeurd (2019-A016-01) en uitgevoerd bij Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University.
1. M. de -inoculum-voorbereiding met één cel (Figuur 1)
<ol><li>Ontdooien Cerulean-fluorescerende M. de glycerol voor...

<ol>
	<li>Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+innate+immunity+by+Mycobacterium+tuberculosis:+is+death+an+exit+strategy.">Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).</li><li>Lamkanfi, M., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+host+cell+death+pathways+during+microbial+infections.">Manipulation of host cell death pathways during microbial infections.</a> Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Apoptosis+and+Necrosis+by+Annexin+V+Binding,+Propidium+Iodide+Uptake,+and+Flow+Cytometry.">Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+DNA+Fragmentation+in+Apoptotic+Cells+by+TUNEL.">Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).</li><li>Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Cell+Viability+with+Single-,+Dual-,+and+Multi-Staining+Methods+Using+Image+Cytometry.">Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).</li><li>Rathkey, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+visualization+of+gasdermin+D-driven+pyroptotic+cell+death.">Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).</li><li>Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+neutrophil+biology.">Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology.</a> Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).</li><li>Harvie, E. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+host+defense:+new+insights+from+zebrafish.">Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).</li><li>Lesley, R., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+early+mycobacterial+pathogenesis+from+the+zebrafish.">Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish.</a> Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).</li><li>Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pathogenesis+of+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis.</a> Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).</li><li>Clay, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomous+role+of+the+macrophage+in+early+Mycobacterium+marinum+infection+of+the+zebrafish.">Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish.</a> Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).</li><li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos.">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).</li><li>Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cells+moderate+inflammatory+progression+and+enhance+bacterial+containment+upon+pulmonary+challenge+with+Mycobacterium+tuberculosis.">cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis.</a> Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+plays+critical+role+during+Edwardsiella+piscicida+immersion+infection+in+zebrafish+larvae.">Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae.</a> Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nlrc3-like+is+required+for+microglia+maintenance+in+zebrafish.">Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Colonization+of+Developing+Zebrafish+Midbrain+Is+Promoted+by+Apoptotic+Neuron+and+Lysophosphatidylcholine.">Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine.</a> Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).</li><li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interception+of+host+angiogenic+signalling+limits+mycobacterial+growth.">Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth.</a> Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).</li><li>Kulms, D., Schwarz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+UV-induced+apoptosis.">Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis.</a> Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).</li><li>van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+apoptotic+cells+in+zebrafish.">Live imaging of apoptotic cells in zebrafish.</a> FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).</li><li>Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+changes+during+programmed+cell+deaths.">Plasma membrane changes during programmed cell deaths.</a> Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).</li><li>Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoplasmin+regulates+chromatin+condensation+during+apoptosis.">Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).</li><li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+infection:+a+double-edged+sword+for+host+and+pathogen+survival.">Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival.</a> Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).</li><li>Traven, A., Naderer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+egress:+a+hitchhiker's+guide+to+freedom.">Microbial egress: a hitchhiker's guide to freedom.</a> PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).</li></ol>

Dit protocol beschrijft de visualisatie van macrofaag sterfte tijdens mycobacteriële infectie. Op basis van factoren zoals de integriteit van het celmembraan, kan infectie gedreven celdood worden onderverdeeld in apoptosis en lytische celdood24,25. Lytic Cell Death is meer stressvol voor het organisme dan apoptosis, omdat het een sterke ontstekingsreactie veroorzaakt, 24,25. Observatie van lytische celdo...

Mycobacteriële infectie is aangetoond dat gastheer immuuncel overlijden1. Bijvoorbeeld, een verzwakte stam zal leiden tot apoptosis in macrofagen en de infectie bevatten. Een virulente stam zal echter leiden tot lytische celdood, waardoorbacteriële verspreiding1,2. Gezien de impact van deze verschillende soorten celdood op host anti-mycobacteriële respons, is een gedetailleerde observatie van macrofaag celdood tijdens mycobacteriële infectie in vivo nodig.
De conventionele methoden voor het meten van celdood zijn het gebruik van dode celvlekken, zoals annnexin V, Tunel of acridine Orange/propidium jodide kleuring3,4,5. Deze methoden kunnen echter geen licht werpen op het dynamische proces van celdood in vivo. De waarneming van celdood in vitro is al vergemakkelijkt door Live Imaging6. Echter, of de resultaten nauwkeurig nabootsen van fysiologische omstandigheden blijft onduidelijk.
Zebrafish zijn een uitstekend model voor het bestuderen van host anti-Mycobacterium reacties. Het heeft een sterk bewaard immuunsysteem vergelijkbaar met dat van mensen, een gemakkelijk gemanipuleerd genoom, en de vroege embryo's zijn transparant, waardoor Live beeldvorming7,8,9mogelijk wordt. Na infectie met M. marinum vormen volwassen zebravis typische rijpe granuloom structuren, en embryonale zebravis vorm vroeg granuloom zoals structuren9,10. Het dynamische proces van aangeboren immuuncelbacteriën interactie is eerder onderzocht in de zebravis M. de infectie model11,12. Echter, als gevolg van hoge ruimtelijke-temporele resolutie eis, de details rond de dood van de aangeboren immuuncellen blijven grotendeels ongedefinieerd.
Hier beschrijven we hoe het proces van macrofaag lytische celdood, veroorzaakt door mycobacteriële infectie in vivo, te visualiseren. Dit protocol kan ook worden toegepast voor het visualiseren van cellulaire gedrag in vivo tijdens de ontwikkeling en ontsteking.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% OADC</td>
			<td>BD</td>
			<td>211886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;m filter</td>
			<td>Mille X</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#956;l/ml hygromycin</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H10</td>
			<td>BD</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9</td>
			<td>BD</td>
			<td>262310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A glass bottom 35 mm dish</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D35-10-0-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A60015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enviromental Chamber</td>
			<td>Pecon</td>
			<td>temp control 37-2 digital</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>No.5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Bioland Scientific LLC</td>
			<td>7105P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Keelrein</td>
			<td>PH-140(A)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M.marinum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATCC BAA-535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection needle</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>IB100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>msp12:cerulean</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 25470057; 27760340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single concavity glass microscope slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>SCICNTZ</td>
			<td>JY92-IIDN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (OD600)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>22331 Hamburg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>SZX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mfap4:eGFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 30742890</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 31278008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 27424497; 17477879</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of macrophage lytic cell death during mycobacterial infection in zebrafish embryos via intravital microscopy

Zebravis is een uitstekend modelorganisme voor het bestuderen van aangeboren immuun Celgedrag als gevolg van de transparante aard en het vertrouwen uitsluitend op zijn aangeboren immuunsysteem tijdens de vroege ontwikkeling. De zebravis Mycobacterium de (M. de) infectie model is goed opgericht in het bestuderen van gastheer immuunrespons tegen mycobacteriële infectie. Er is gesuggereerd dat verschillende macrofaag celdood types zal leiden tot de diverse uitkomsten van mycobacteriële infectie. Hier beschrijven we een protocol met behulp van intravital microscopie te observeren macrofaag celdood in zebravis embryo's na M. de infectie. Zebravis transgene lijnen die specifiek labelen macrofagen en neutrofielen zijn geïnfecteerd via intramusculaire micro injectie van fluorescently gelabelde M. de in ofwel de veroorzaakt of de romp. Besmette zebravis embryo's worden vervolgens op laag smelt agarose gemonteerd en waargenomen door confocale microscopie in X-Y-Z-T afmetingen. Omdat langdurig Live beeldvorming een laag Laser vermogen vereist om fotobleaching en fototoxiciteit te voorkomen, wordt een sterk uitgesproken transgene aanbevolen. Dit protocol vergemakkelijkt de visualisatie van de dynamische processen in vivo, met inbegrip van immuuncelmigratie, gastheer pathogeen interactie, en celdood.

Mycobacterium infectie kan leiden tot verschillende gastheer reacties op basis van de routes van de infectie. In dit protocol worden zebravis-embryo's geïnfecteerd door intramusculaire micro injectie van fluorescently gelabelde bacteriën in de midhersenen of romp (Figuur 3) en waargenomen door confocale Live beeldvorming. Infectie via deze twee routes zal lokaal de infectie waardoor aangeboren immuuncelwerving en daaropvolgende celdood beperken.
Het visualiseren...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy at JoVE.com

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

Dit protocol beschrijft een techniek voor het visualiseren van macrofaag gedrag en overlijden in embryonale zebravis tijdens infectie met Mycobacterium de . Stappen voor de bereiding van bacteriën, infectie van de embryo's, en intravital microscopie zijn opgenomen. Deze techniek kan worden toegepast op de observatie van cellulaire gedrag en overlijden in soortgelijke scenario's met betrekking tot infectie of steriele ontsteking.

Visualisatie van macrofaag lytische celdood tijdens mycobacteriële infectie in zebravis-embryo's via Intravital microscopie

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...

Dit protocol kan duidelijk onderscheid maken tussen macrofaagceldood tijdens mycobacteriële infectie. Door meerdere embryo's parallel te observeren, vergroot het de kans op het vastleggen van het gehele macrofaagceldoodproces aanzienlijk. Dit protocol kan ook worden toegepast op de observatie van celdood en ander cellulair gedrag in vergelijkbare scenario's met infectie of steriele ontsteking.Tijdens de uitgebreide live beeldvorming is het erg belangrijk om de intensiteit van de laser zo laag mogelijk te houden om fotobleaching en toxiciteit te voorkomen. Na inenting volgens het manuscript, centrifuge de cultuur op 3000 keer G gedurende 10 minuten om de Mycobacterium marinum te verzamelen als een pellet. Gooi alle, maar 300 microliters van de supernatant, en opnieuw op te schorten de pellet.Voeg drie milliliter 7H9 medium met 10%glycerol toe om de pellet verder op te schorten en vervolgens de suspensie in een waterbad op 100 watt te soniceren, met 15 seconden aan en 15 seconden uit, gedurende een totaal van twee minuten om een eencellig homogenaat te bereiken. Breng de bacteriële suspensie naar een 10 milliliter spuit, en ga door een vijf micron filter om eventuele bacteriële klonten te verwijderen. Met behulp van een spectrofotometer meet u de optische dichtheid van de ophanging en verdun deze met 7H9-media met 10%glycerol tot OD 600 bij één.Verdeel de suspensie in 10 microliter aliquots, en bewaar op negatieve 80 graden Celsius vriezer voor verder gebruik. Verwarm eerst de agarose in een 95 graden Celsius verwarmingsblok totdat het volledig gesmolten is. Houd de agarose in vloeibare vorm door het in een 45 graden Celsius verwarmingsblok te plaatsen.Om te monteren voor intramusculaire infectie in de stam regio, maak de onderste agarose laag door het gieten van 0,5 milliliter van 1%-gewicht in volume gelijkmatig op een glazen glijbaan. Plaats de glijbaan drie minuten op een koelbox of koud oppervlak om te stollen. Na het verdoven van de zebravis embryo's, plaats tot 60 zebravis embryo's op de bodem agarose laag, en leg ze zorgvuldig in twee rijen.Verwijder het resterende water op de bodem agarose laag met tissue papier, voordat het toevoegen van 0,3 milliliter van 0,5%gewichts toe aan de bovenste laag te creëren. Zorg ervoor dat de embryo's volledig zijn ingebed in de agarose. Breng de glazen schuif terug naar de ijskast om de agarose te stollen.Houd de toplaag van de agarose vochtig door het oppervlak te bedekken met extra E3-eiwater. Pas vervolgens de microinjector en micromanipulator aan de juiste positie en instelling voor microinjectie. Breng drie microliter van voorbereide bacteriële cultuur in de voorbereide naald met behulp van een microloader.Pipet langzaam en voorzichtig om te voorkomen dat de vorming van luchtbellen. Injecteer 100 CFU in het koffergebied. Spoel na microinjectie de embryo's van zebravissen voorzichtig door in zoet eiwater met een plastic pipet.Om te monteren voor de midbrain infectie, gebruik maken van een plastic pipet om de vier tot zes tricaine-verdoofde embryo's over te brengen in de agarose. Plaats het hoofd van elk embryo voorzichtig naar boven met een naald van 10 meter. Zodra alle embryo's posities zijn vastgesteld, breng de glazen glijbaan naar een ijskast of koud oppervlak om de agarose te laten stollen.Injecteer 500 CFU in het middenbrein. Spoel na microinjectie de embryo's van zebravissen voorzichtig door in zoet eiwater met een plastic pipet. Zodra de agarose volledig gestold is, bedek de agarose met een laagje eiwater.Na het opzetten van de milieukamer, plaats de 35 millimeter glazen bodem schotel met de zebravis in de milieukamer. Open de 405 diode, argon op 20% vermogen, en DPSS 561 nanometer laser. Stel de juiste laserkracht in in spectruminstellingen.Kies de xyz-sequentiële scanacquisitiemodus en stel de indeling afbeeldingen in op 512 bij 512 pixels. Schakel over naar de live data-modus, target de positie van de eerste zebravis en markeer de begin- en eindpositie Z. Herhaal dit proces voor elk van de resterende embryo's.Voeg een pauze toe aan het einde van het programma. Definieer de lus en cyclus van het programma en sla het bestand op. In deze studie gebruikten we eerder gerapporteerde transgene coro1a:eGFP;lyzDsRed2 en transgene mpeg1loxP;DsRed:loxPeGFP;lyz:eGFP, om de macrofagen en de neutrofielen in vivo te onderscheiden.Een macrofaag zwaar opgeslokt met bacteriën werd rond en weergegeven verminderde beweeglijkheid, met uiteindelijke cytoplasmatische zwelling, scheuren van het celmembraan, en snelle verspreiding van de cytoplasmatische inhoud. UV-bestraalde macrofagen toonden typische apoptotische cel fenotypes zoals celkrimp, nucleaire fragmentatie en chromatinecondensatie. Het werd ook waargenomen de macrofagen actief fagocytosed en verspreid M.merinum.Echter, neutrofielen hadden beperkte fagocytische vermogen, en snel onderging lytische celdood zonder duidelijke bacteriële engorgement. In combinatie met krachtige genbewerkingstools kan dit protocol een effectief platform bieden om het effect van een verscheidenheid aan factoren op de interactie tussen gastheer en ziekteverwekker in vivo verder te begrijpen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Intravitale Microscopie van de lies lymfkliertest

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravitale Microscopie van de milt: Kwantitatieve Analyse van Parasite Mobiliteit en Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Infectie van zebravis embryo&#39;s met intracellulaire bacteriële pathogenen

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisatie van bacteriële toxine geïnduceerde responsen met Live Cell Fluorescentie Microscopie

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Hoogst vastbesloten Intravitale Striped-verlichting Microscopie van Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Studie van fagolysosoom Biogenesis Live macrofagen

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualiseren Non-lytische Exocytosis van<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; Van Macrofagen behulp Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flow cytometrische analyse van de NK-cel lytische activiteit in humaan volbloed

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualiseren van extracellulaire Traps Macrophage met behulp van de Confocal Microscopie

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Verzadigde vetzuren induceren Ceramide-geassocieerde Macrophage celdood

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...