Name: visualization of macrophage lytic cell death during mycobacterial infection in zebrafish embryos via intravital microscopy
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy at JoVE.com

אנו מודים לד ר זילונג ון על שיתוף זנים הדגים, ד ר. סטפן Oehlers וד ר. דוד טובין על שיתוף M. marinum משאבים קשורים הקשורות, Yuepeng הוא לסיוע בהכנת הדמות. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81801977) (B.Y.), תוכנית ההדרכה לנוער מצטיינים של הנציבות העירונית של שנגחאי (2018yq54) (B.Y.), תוכנית השייט של שנגחאי (18yf1420400) (B.Y.), והקרן הפתוחה של המעבדה מפתח שנגחאי של שחפת (2018

Zebrafish גדלו תחת תנאים סטנדרטיים בהתאם הנחיות בעלי חיים מעבדה לסקירה אתית של בעלי חיים רווחה (GB/T 35823-2018). כל ניסוי דג זברה במחקר זה אושרו (2019-A016-01) וניהל ב שנגחאי הציבור בריאות קלינית המרכז, אוניברסיטת fudan.
1. M. מרנום תא יחיד הכנה לרשת (איור 1)
<ol><li>הפשרת Cerulean-פל?...

<ol>
	<li>Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+innate+immunity+by+Mycobacterium+tuberculosis:+is+death+an+exit+strategy.">Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).</li><li>Lamkanfi, M., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+host+cell+death+pathways+during+microbial+infections.">Manipulation of host cell death pathways during microbial infections.</a> Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Apoptosis+and+Necrosis+by+Annexin+V+Binding,+Propidium+Iodide+Uptake,+and+Flow+Cytometry.">Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+DNA+Fragmentation+in+Apoptotic+Cells+by+TUNEL.">Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).</li><li>Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Cell+Viability+with+Single-,+Dual-,+and+Multi-Staining+Methods+Using+Image+Cytometry.">Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).</li><li>Rathkey, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+visualization+of+gasdermin+D-driven+pyroptotic+cell+death.">Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).</li><li>Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+neutrophil+biology.">Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology.</a> Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).</li><li>Harvie, E. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+host+defense:+new+insights+from+zebrafish.">Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).</li><li>Lesley, R., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+early+mycobacterial+pathogenesis+from+the+zebrafish.">Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish.</a> Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).</li><li>Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pathogenesis+of+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis.</a> Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).</li><li>Clay, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomous+role+of+the+macrophage+in+early+Mycobacterium+marinum+infection+of+the+zebrafish.">Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish.</a> Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).</li><li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos.">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).</li><li>Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cells+moderate+inflammatory+progression+and+enhance+bacterial+containment+upon+pulmonary+challenge+with+Mycobacterium+tuberculosis.">cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis.</a> Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+plays+critical+role+during+Edwardsiella+piscicida+immersion+infection+in+zebrafish+larvae.">Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae.</a> Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nlrc3-like+is+required+for+microglia+maintenance+in+zebrafish.">Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Colonization+of+Developing+Zebrafish+Midbrain+Is+Promoted+by+Apoptotic+Neuron+and+Lysophosphatidylcholine.">Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine.</a> Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).</li><li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interception+of+host+angiogenic+signalling+limits+mycobacterial+growth.">Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth.</a> Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).</li><li>Kulms, D., Schwarz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+UV-induced+apoptosis.">Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis.</a> Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).</li><li>van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+apoptotic+cells+in+zebrafish.">Live imaging of apoptotic cells in zebrafish.</a> FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).</li><li>Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+changes+during+programmed+cell+deaths.">Plasma membrane changes during programmed cell deaths.</a> Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).</li><li>Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoplasmin+regulates+chromatin+condensation+during+apoptosis.">Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).</li><li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+infection:+a+double-edged+sword+for+host+and+pathogen+survival.">Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival.</a> Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).</li><li>Traven, A., Naderer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+egress:+a+hitchhiker's+guide+to+freedom.">Microbial egress: a hitchhiker's guide to freedom.</a> PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר את ההדמיה של מוות מקרופאג במהלך זיהום פטרת. מבוסס על גורמים כגון שלמות קרום התא, זיהום מונחה תאים מוות יכול להיות מחולק אפופטוזיס ו-lytic מוות התא24,25. המוות התאי lytic הוא מלחיץ יותר עבור האורגניזם מאשר אפופטוזיס, כי זה מפעיל תגובה דלקתית חזקה <sup c...

זיהום פטרת הוכח לגרום למוות תא החיסון מארח1. למשל, זן מחליש יהיה להפעיל אפופטוזיס במקרופאגים ולהכיל את הזיהום. עם זאת, זן המוני יהיה להפעיל את המוות התא lytic, גרימת הפצת חיידקים1,2. בהתחשב ההשפעה האלה סוגים שונים של מוות תאים יש על מארח התגובה נגד פטרת, התבוננות מפורטת של מקרופאג cell מוות במהלך זיהום פטרת ב vivo הוא צורך.
השיטות הקונבנציונליות למדידת מוות תאי הן להשתמש בכתמי תאים מתים, כגון V, tunel, או אקרידיין אורנג '/propidium יודידה כתמים3,4,5. עם זאת, שיטות אלה אינן מסוגלים לשפוך אור על התהליך הדינמי של מוות התאים בvivo. האבחנה של מוות תאים בתוך מבחנה כבר הונחה על ידי הדמיה חיה6. עם זאת, האם התוצאות מחקות במדויק את התנאים הפיסיולוגיים נותרים ברורים.
Zebrafish כבר מודל מצוין עבור לימוד מארח נגד פטרת תגובות. יש מערכת חיסונית שימור מאוד דומה לזה של בני אדם, הגנום מניפולציות בקלות, והעוברים המוקדמים הם שקופים, אשר מאפשר הדמיה חיה7,8,9. לאחר ההדבקה עם מ. מרנום, בוגרים מסוג זברפיש מבנים טיפוסיים של גרגירומת מבוגרים, ויוצריםבצורת מבנה שכגרגירומה מוקדםמבנים 9,10. התהליך הדינמי של האינטראקציה הטבועה תא החיסונית בקטריה כבר נחקרו בעבר במודל דג זברה M. מרנום מודל11,12. עם זאת, בשל הדרישה גבוהה מרחבית ברזולוציה הזמנית, הפרטים המקיפים את מותם של תאים חיסוניים מולדים להישאר במידה מוגדרת ברובו.
כאן אנו מתארים כיצד להמחיש את התהליך של מוות תא מקרופאג lytic המופעל על ידי זיהום פטרת בvivo. פרוטוקול זה עשוי להיות גם להחיל על התנהגות תאית הvivo במהלך פיתוח ודלקת.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% OADC</td>
			<td>BD</td>
			<td>211886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;m filter</td>
			<td>Mille X</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#956;l/ml hygromycin</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H10</td>
			<td>BD</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9</td>
			<td>BD</td>
			<td>262310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A glass bottom 35 mm dish</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D35-10-0-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A60015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enviromental Chamber</td>
			<td>Pecon</td>
			<td>temp control 37-2 digital</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>No.5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Bioland Scientific LLC</td>
			<td>7105P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Keelrein</td>
			<td>PH-140(A)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M.marinum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATCC BAA-535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection needle</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>IB100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>msp12:cerulean</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 25470057; 27760340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single concavity glass microscope slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>SCICNTZ</td>
			<td>JY92-IIDN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (OD600)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>22331 Hamburg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>SZX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mfap4:eGFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 30742890</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 31278008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 27424497; 17477879</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of macrophage lytic cell death during mycobacterial infection in zebrafish embryos via intravital microscopy

Zebrafish הוא אורגניזם מודל מעולה לחקר התנהגות התא החיסונית מולדת בשל טבעו שקוף הסתמכות אך ורק על מערכת החיסון שלה מולדת במהלך ההתפתחות המוקדמת. Zebrafish מריחיידק מארנום (מ. מרנום) מודל זיהום כבר הוקמה היטב ללמוד תגובה חיסונית מארחים נגד זיהום פטרת. יש כבר הציע כי שונים סוגי מוות מקרופאג cell יוביל לתוצאות מגוונות של זיהום בקטריאלי. כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות מיקרוסקופ המקרופאג להתבונן במוות התאים בתוך עוברי דגים בעקבות זיהום מ. מרנום . Zebrafish הקווים הטרנסגניים במיוחד בתוויות מקרופאגים ו נויטרופילים נגועים באמצעות מיקרוהזרקה שרירית של fluorescently אופן שכותרתו M. marinum באמצע המוח או המטען. עוברים מזוהמים העוברי דגים הם רכוב לאחר מכן על התכה נמוכה ההיתוך ונצפתה על ידי המיקרוסקופיה בממדים X-Y-Z-T. מכיוון שהדמיה לטווח ארוך מחייבת שימוש בכוח לייזר נמוך כדי למנוע הלבנת ופוטורעילות, מומלץ לבטא מאוד את הביטוי. פרוטוקול זה מאפשר ויזואליזציה של התהליכים הדינאמיים ב vivo, כולל העברת תאים חיסוניים, אינטראקציה עם הפתוגן מארח, ומוות תאים.

זיהום פטרת יכול להפעיל תגובות מארח שונים מבוסס על נתיבי זיהום. בפרוטוקול זה, עוברי דג דג זברה נגועים על ידי הזרקת מיקרותוך שרירית של חיידקים המסומנים fluorescently לתוך המוח האמצע או המטען (איור 3) ונצפתה על ידי הדמיה מוקד חי. זיהום באמצעות שני המסלולים הללו יהיה באופן מקומי להגבי?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy at JoVE.com

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

פרוטוקול זה מתאר טכניקה להמחיש התנהגות מקרופאג ומוות העובריים מתחלקים במהלך הזיהום של מריחיידק של פטרת . צעדים להכנת חיידקים, זיהום העוברים, ומיקרוסקופ ה, כלולים. טכניקה זו עשויה להיות מיושמת על התבוננות של התנהגות תאית ומוות בתרחישים דומים הכרוכים זיהום או דלקת סטרילית.

ויזואליזציה של מקרופאג Lytic תא המוות במהלך זיהום פטרת העוברים באמצעות מיקרוסקופ אינטרטל

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...

פרוטוקול זה יכול להבדיל בבירור מצבי מוות של תאי מקרופאג במהלך זיהום mycobacterial. על ידי התבוננות בעוברים מרובים במקביל, זה מגדיל מאוד את ההסתברות ללכוד את כל תהליך המוות של תאים ליטיק מקרופאגים. פרוטוקול זה עשוי להיות מיושם גם על תצפית של מוות תאי והתנהגות תאית אחרת בתרחישים דומים מעורבים זיהום או דלקת סטרילית.במהלך ההדמיה החיה המורחבת, חשוב מאוד לשמור על עוצמת הלייזר נמוכה ככל האפשר, כדי למנוע פוטובלאצ'ים ורעילות. לאחר החיסון על פי כתב היד, צנטריפוגה התרבות ב 3000 פעמים G במשך 10 דקות כדי לאסוף את Marinum Mycobacterium כמו גלולה. השלך את כל המיקרוליטרים מלבד 300 של העל-טבעי, והשהה מחדש את גלולת הכדור.הוסף שלושה מיליליטר של מדיום 7H9 עם 10% גליצרול כדי להשעות מחדש את גלולה, ולאחר מכן sonicate ההשעיה באמבט מים ב 100 וואט, עם 15 שניות על ו 15 שניות, במשך סך של שתי דקות כדי להשיג הומוגניאט תא אחד. מעבירים את ההשעיה החיידקית למזרק 10 מיליליטר, ועוברים דרך מסנן חמישה מיקרון כדי להסיר גושים חיידקיים. באמצעות ספקטרופוטומטר, למדוד את הצפיפות האופטית של ההשעיה, ולדלל אותו עם מדיה 7H9 המכיל 10%גליצרול כדי OD 600 בבת אחת.מחלקים את ההשעיה ל-10 מיליקוטים מיקרוליטרים, ומאחסנים במקפיא שלילי של 80 מעלות למשך שימוש נוסף. ראשית, מחממים את ההתעוררות בבלוק חימום של 95 מעלות צלזיוס עד שהוא נמס לחלוטין. לשמור על agarose בצורה נוזלית על ידי הצבת אותו בלוק חימום 45 מעלות צלזיוס.כדי לעלות על זיהום תוך שרירי באזור תא המטען, ליצור את שכבת אגרוז התחתון על ידי שפיכת 0.5 מיליליטר של 1% משקל לפי נפח התעורר באופן שווה על מגלשת זכוכית. מניחים את השקופית על קופסת קרח או משטח קר במשך שלוש דקות כדי לחזק. לאחר הרדמה של עוברי הזברה, מניחים עד 60 עוברי זברה על שכבת אגרוז התחתונה, ומניחים אותם בזהירות בשתי שורות.הסר את כל המים הנותרים על שכבת אגרוז התחתונה עם נייר טישו, לפני הוספת 0.3 מיליליטר של 0.5% משקל לפי נפח התעוררה כדי ליצור את השכבה העליונה. ודא כי העוברים מוטבעים לחלוטין אגרוז. החזירו שוב את מגלשת הזכוכית לארגז הקרח כדי לחזק את ההתעוררות.שמור על השכבה העליונה של אגרוז לח על ידי כיסוי פני השטח עם מי ביצה E3 נוספים. לאחר מכן, להתאים את microinjector ו micromanipulator למיקום הנכון והגדרה עבור microinjection. מעבירים שלושה מיקרוליטרים של תרבות חיידקים מוכנה לתוך המחט המוכנה באמצעות מיקרו-מטען.פיפטה לאט ובזהירות כדי למנוע יצירת בועות אוויר. להזריק 100 CFU לאזור תא המטען. לאחר microinjection, בזהירות לשטוף את העוברים דג זברה לתוך מי ביצה טריים עם פיפטה פלסטיק.כדי לעלות על זיהום midbrain, להשתמש פיפטה פלסטיק להעביר את ארבעה עד שישה עוברים הרדמה tricaine לתוך אגרוז. מקם את הראש של כל עובר כלפי מעלה בזהירות עם מחט 10-מד. לאחר שכל תנוחות העוברים קבועות, מעבירים את מגלשת הזכוכית לארגז קרח או למשטח קר כדי לאפשר לאפרוז להתגבש.להזריק 500 CFU לתוך האמצע. לאחר microinjection, בזהירות לשטוף את העוברים זברהפיש לתוך מי ביצה טריים עם פיפטה פלסטיק. לאחר שהתעוררות התגבשה לחלוטין, מכסים את ההתעוררות בשכבה של מי ביצה.לאחר הקמת התא הסביבתי, מניחים את המנה התחתונה זכוכית 35 מילימטר עם דג הזברה בתא הסביבתי. פתח את הדיודה 405, ארגון ב 20% כוח, ו DPSS 561 לייזר ננומטר. הגדר את כוח הלייזר המתאים בהגדרות הספקטרום.בחרו במצב רכישת סריקה רציפה של XYZ והגדירו את תבנית התמונות ל-512 על 512 פיקסלים. עבור למצב נתונים חיים, כוון למיקום של דג הזברה הראשון וסמן את מיקום התחלה וסיום Z. חזור על תהליך זה עבור כל אחד מהעוברים הנותרים.הוסף השהיה בסוף התוכנית. הגדר את הלולאה והמחזור של התוכנית ושמור את הקובץ. במחקר זה, השתמשנו בעבר דיווחו coro1a מהונדס:eGFP;lyzDsRed2, ו mpeg1loxP מהונדס;DsRed:loxPeGFP;lyz:eGFP, כדי להבחין מקרופאגים ואת נויטרופילים במבחנה.מקרופאג' שקוע בכבדות בחיידקים הפך עגול והפגין תנועתיות מופחתת, עם נפיחות ציטופלסמית בסופו של דבר, קרע של קרום התא, והפצה מהירה של התוכן הציטופלסמי. מקרופאגים מוקרנים UV הראו פנוטיפים אופייניים לתאי אפטומטיים כגון התכווצות תאים, פיצול גרעיני ועיבוי כרומטין. הוא גם נצפה המקרופאגים פעילים phagocytosed והפיץ M.merinum.עם זאת, נויטרופילים היו בעלי יכולת phagocytic מוגבלת, ועבר במהירות מוות תאי ליטיק ללא engorgement חיידקי ברור. בשילוב עם כלים רבי עוצמה לעריכת גנים, פרוטוקול זה יכול לספק פלטפורמה יעילה להבנה נוספת של ההשפעה של מגוון גורמים על אינטראקציה בין מארח לפתוגן ב- vivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

מיקרוסקופית Intravital של הצומת לימפה מפשעתי

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

מיקרוסקופית Intravital של הטחול: ניתוח כמותי של ניידות טפיל ואת זרימת הדם

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

זיהום של עוברים דג הזברה עם פתוגנים חיידקיים תאיים

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

ויזואליזציה של תגובות מושרות רעלן של חיידקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תא החי

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז&#39;רמינל

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

חקר Phagolysosome Biogenesis בהמקרופאגים בשידור חי

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

חזותי exocytosis ללא ממס של<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em&gt; מהמקרופאגים שימוש דיגיטלי אור מיקרוסקופית

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

חומצות שומן רוויות לגרום מוות תאי מקרופאג Ceramide-הקשורים

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...