Name: visualization of macrophage lytic cell death during mycobacterial infection in zebrafish embryos via intravital microscopy
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy at JoVE.com

ゼブラフィッシュ株を共有してくれたジロン・ウェン博士、ステファン・オーラーズ博士、デビッド・トビン博士がM.マリナム関連の資源を共有してくれたことに感謝します。この作品は、中国国立自然科学財団(81801977)(B.Y.)、上海市保健委員会優秀青少年研修プログラム(2018YQ54)(B.Y.)、上海セーリングプログラム(18YF1420400)、上海キー研究所オープンファンド(2018年)によって支援されました。

ゼブラフィッシュは、動物福祉の倫理的見直しのための実験動物ガイドラインに準拠して標準的な条件下で飼育されました (GB/T 35823-2018).本研究におけるゼブラフィッシュ実験は全て承認され(2019-A016-01)、復旦大学上海公衆衛生臨床センターで実施されました。
1. M. マリナム単細胞接種準備 (図 1)
<ol><li>セルリアン蛍光M.マリナムグリ?...

<ol>
	<li>Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+innate+immunity+by+Mycobacterium+tuberculosis:+is+death+an+exit+strategy.">Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).</li><li>Lamkanfi, M., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+host+cell+death+pathways+during+microbial+infections.">Manipulation of host cell death pathways during microbial infections.</a> Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. 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A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+host+defense:+new+insights+from+zebrafish.">Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).</li><li>Lesley, R., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+early+mycobacterial+pathogenesis+from+the+zebrafish.">Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish.</a> Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).</li><li>Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pathogenesis+of+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis.</a> Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).</li><li>Clay, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomous+role+of+the+macrophage+in+early+Mycobacterium+marinum+infection+of+the+zebrafish.">Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish.</a> Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).</li><li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos.">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).</li><li>Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. 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V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Colonization+of+Developing+Zebrafish+Midbrain+Is+Promoted+by+Apoptotic+Neuron+and+Lysophosphatidylcholine.">Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine.</a> Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).</li><li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interception+of+host+angiogenic+signalling+limits+mycobacterial+growth.">Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth.</a> Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).</li><li>Kulms, D., Schwarz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+UV-induced+apoptosis.">Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis.</a> Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).</li><li>van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. 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A. 102 (8), 2778-2783 (2005).</li><li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+infection:+a+double-edged+sword+for+host+and+pathogen+survival.">Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival.</a> Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).</li><li>Traven, A., Naderer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+egress:+a+hitchhiker's+guide+to+freedom.">Microbial egress: a hitchhiker's guide to freedom.</a> PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).</li></ol>

このプロトコルは、マイコバクテリア感染時のマクロファージ死の可視化を記述する。細胞膜の完全性などの因子に基づいて、感染駆動細胞死は、アポトーシスおよび溶解細胞死24、25に分けることができる。溶解細胞死は、アポトーシスよりも生物にとってストレスであり、強い炎症反応を引き起こすので24、25<sup class="x...

マイコバクテリア感染は、宿主免疫細胞死1を引き起こすことが実証されている。例えば、減衰した株はマクロファージ中のアポトーシスを引き起こし、感染を含む。しかし、毒性株は、溶解細胞死を引き起こし、細菌の播種を引き起こす1、2.これらの異なるタイプの細胞死が宿主抗抗抗抗抗抗細菌応答に及ぼす影響を考慮すると、生体内でのマイコバクテリア感染時のマクロファージ細胞死の詳細な観察が必要である。
細胞死を測定する従来の方法は、Annnexin V、TUNEL、またはアクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム染色3、4、5などの死細胞染色を使用することです。しかし、これらの方法は、生体内での細胞死の動的過程に光を当てることができません。インビトロでの細胞死の観察は、すでに生イメージング6によって促進されている。しかしながら、結果が生理学的条件を正確に模倣するかどうかは不明のままである。
ゼブラフィッシュは、宿主抗抗抗抗抗抗抗菌応答を研究するための優れたモデルである。それは人間と同様に高度に保存された免疫系を有し、容易に操作されるゲノム、および初期胚は透明であり、生きたイメージングを可能にする7、8、9を可能にする。M.マリナムとの感染後、成人ゼブラフィッシュは典型的な成熟肉芽腫構造を形成し、胚性ゼブラフィッシュは構造9、10のような早期肉芽腫を形成する。自然免疫細胞間細菌相互作用の動的過程は、ゼブラフィッシュM.マリナム感染モデル11、12において以前に検討されている。しかし、空間的な時間分解能の要件が高いため、自然免疫細胞の死を取り巻く詳細はほとんど未定義のままである。
ここでは、生体内のマイコバクテリア感染によって引き起こされるマクロファージ溶解細胞死のプロセスを可視化する方法について説明する。このプロトコルはまた、発達および炎症の間に生体内の細胞行動を視覚化するために適用され得る。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% OADC</td>
			<td>BD</td>
			<td>211886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;m filter</td>
			<td>Mille X</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#956;l/ml hygromycin</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H10</td>
			<td>BD</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9</td>
			<td>BD</td>
			<td>262310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A glass bottom 35 mm dish</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D35-10-0-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A60015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enviromental Chamber</td>
			<td>Pecon</td>
			<td>temp control 37-2 digital</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>No.5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Bioland Scientific LLC</td>
			<td>7105P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Keelrein</td>
			<td>PH-140(A)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M.marinum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATCC BAA-535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection needle</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>IB100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>msp12:cerulean</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 25470057; 27760340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single concavity glass microscope slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>SCICNTZ</td>
			<td>JY92-IIDN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (OD600)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>22331 Hamburg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>SZX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mfap4:eGFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 30742890</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 31278008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 27424497; 17477879</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of macrophage lytic cell death during mycobacterial infection in zebrafish embryos via intravital microscopy

ゼブラフィッシュは、その透明な性質と初期の発達中の自然免疫系のみに依存しているため、自然免疫細胞の挙動を研究するための優れたモデル生物です。ゼブラフィッシュマイコバクテリウム・マリナム(M.マリナム)感染モデルは、マイコバクテリア感染に対する宿主免疫応答の研究において十分に確立されている。異なるマクロファージ細胞死の種類は、マイコバクテリア感染の多様な結果につながることが示唆されている。ここでは、M.マリナム感染後のゼブラフィッシュ胚におけるマクロファージ細胞死を観察するために、生内顕微鏡を用いたプロトコルについて説明する。マクロファージと好中球を特異的に標識するゼブラフィッシュトランスジェニックラインは、中脳または幹のいずれかで蛍光標識M.marinumの筋肉内マイクロインジェクションを介して感染する。感染したゼブラフィッシュ胚は、その後、低融解アガロースに取り付けられ、X-Y-Z-T次元の共焦点顕微鏡によって観察される。長期ライブイメージングでは、光漂白や光毒性を避けるために低いレーザーパワーを使用する必要があるため、トランスジェニックを強く表現することを強くお勧めします。このプロトコルは、免疫細胞遊走、宿主病原体相互作用、および細胞死を含む生体内の動的プロセスの可視化を容易にする。

マイコバクテリウム感染は、感染経路に基づいて異なる宿主応答を引き起こす可能性があります。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚は、蛍光標識細菌を中脳または幹に筋肉内マイクロインジェクションによって感染させ、共焦点生イメージングによって観察される。これら2つの経路を介した感染は、自然免疫細胞の募集とその後の細胞死を引き起こす感染を局...

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Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

このプロトコルは、マイコバクテリウム・マリナム感染時の胚性ゼブラフィッシュにおけるマクロファージ挙動および死を可視化する技術を記述する。細菌の調製、胚の感染、およびバイタル内顕微鏡検査のステップが含まれています。この技術は、感染または無菌炎症を伴う同様のシナリオにおける細胞行動および死亡の観察に適用され得る。

バイタル顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚におけるマイコバクテリア感染時のマクロファージ溶解細胞死の可視化

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...

このプロトコルは、マイコバクテリア感染時のマクロファージ細胞死モードを明確に区別することができる。複数の胚を並列に観察することで、マクロファージの細胞死過程全体を捕捉する確率が大幅に高まります。このプロトコルは、感染または無菌炎症を伴う同様のシナリオにおける細胞死および他の細胞行動の観察にも適用され得る。拡張ライブイメージングの間、光の漂白や毒性を避けるために、レーザーの強度をできるだけ低く保つことが非常に重要です。原稿による接種後、培養物を10分間Gの3000倍にして、マイコバクテリウムマリナムをペレットとして採取する。上清の300マイクロリットルを除くすべてを捨て、ペレットを再中断します。さらに10%グリセロールで7H9培地の3ミリリットルを追加し、ペレットをさらに再中断し、15秒オンと15秒オフで100ワットのウォーターバスで懸濁液を超音波処理し、合計2分間、単一のセルホモジネートを達成します。細菌懸濁液を10ミリリットルのシリンジに移し、5ミクロンのフィルターを通過して細菌の塊を取り除く。分光光度計を用いて、懸濁液の光学濃度を測定し、10%グリセロールを含有する7H9培地で1枚でOD600に希釈する。懸濁液を10マイクロリットルのアリコートに分け、さらに使用するためにマイナス80°Cの冷凍庫で保管します。まず、アガロースを95°Cの加熱ブロックで完全に溶けるまで加熱します。45°Cの加熱ブロックに置くことによって液体の形でアガロースを維持します。幹領域の筋肉内感染のためにマウントするには、ガラススライド上に均一に体積アガロースによって1%重量の0.5ミリリットルを注ぐことによって底アガロース層を作成します。スライドを氷箱または冷たい表面に3分間置いて固めます。ゼブラフィッシュの胚を麻酔した後、最大60個のゼブラフィッシュ胚を下アガロース層に配置し、2列に慎重にレイアウトします。下部アガロース層に残った水をティッシュペーパーで取り除き、0.5%重量の0.3ミリリットルを体積アガロースで添加して上層を作ります。胚がアガロースに完全に埋め込まれていることを確認します。グラススライドを再びアイスボックスに戻してアガロースを固める。余分なE3卵水で表面を覆うことによって、アガロースの最上層を湿らせておいてください。次に、マイクロインジェクターとマイクロマニピュレータを適切な位置に調整し、マイクロインジェクションを行います。マイクロローダーを使用して、調製した細菌培養物の3マイクロリットルを調製された針に移す。気泡を形成しないようにゆっくりと慎重にピペット。トランク領域に 100 CFU を注入します。マイクロインジェクションの後、シマウマの魚の胚をプラスチックピペットで淡い卵水に慎重に洗い流します。中脳感染症のためにマウントするには、プラスチックピペットを使用して、4〜6トリセン麻酔化胚をアガロースに移します。各胚の頭部を10ゲージの針で慎重に上方に置きます。すべての胚の位置が固定されたら、ガラススライドを氷箱または冷たい表面に移してアガロースを固めます。中脳に500 CFUを注入します。マイクロインジェクションの後、ゼブラフィッシュの胚をプラスチックピペットで淡い卵水に慎重に洗い流します。アガロースが完全に固まったら、アガロースを卵水の層で覆います。環境室を設置した後、環境室にゼブラフィッシュと35ミリメートルガラス底皿を置きます。405ダイオード、アルゴンを20%パワーで開き、DPSS 561ナノメートルレーザーを開きます。スペクトラム設定で適切なレーザーパワーを設定します。XYZ シーケンシャル スキャン取得モードを選択し、画像形式を 512 x 512 ピクセルに設定します。ライブデータモードに切り替え、最初のゼブラフィッシュの位置をターゲットにし、開始位置と終了Z位置をマークします。残りの胚ごとにこのプロセスを繰り返します。プログラムの最後に一時停止を追加します。プログラムのループとサイクルを定義し、ファイルを保存します。本研究では、以前に報告されたトランスジェニックコロ1a:eGFP;lyzDsRed2、およびトランスジェニックmpeg1loxP;DsRed:loxPeGFP;lyz:eGFPを利用して、マクロファージおよび生体内の好中球を区別した。細菌を大量に包み込んだマクロファージは丸くなり、運動性が低下し、最終的には細胞質の腫脹、細胞膜の破裂、細胞質含有量の迅速な普及が見られた。UV照射マクロファージは、細胞収縮、核断片化、クロマチン縮合などの典型的なアポトーシス細胞表現型を示した。また、マクロファージが積極的に食細胞化し、M.メリナムを普及させたことも観察された。しかし、好中球は食作用能力が限られており、明らかな細菌のエンゴテージなしにすぐに溶菌細胞死を受けた。強力な遺伝子編集ツールと組み合わせることで、このプロトコルは、生体内の宿主と病原体の相互作用に対する様々な要因の影響をさらに理解するための効果的なプラットフォームを提供することができます。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

ライブマクロファージにおけるファゴリソソーム生合成の研究

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Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

の非溶解性エキソサイトーシスの可視化<em&gt;クリプトコッカス·ネオフォルマンス</em&gt;デジタル光学顕微鏡を使用したマクロファージから

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

共焦点顕微鏡を用いた可視化マクロファージ細胞外トラップ

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

飽和脂肪酸は、セラミド関連マクロファージの細胞死を誘導します。

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...