Name: visualization of macrophage lytic cell death during mycobacterial infection in zebrafish embryos via intravital microscopy
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy at JoVE.com

지롱 웬 박사님, 스테판 올러스 박사, 데이비드 토빈 박사님이 M. marinum 관련 자원을 공유해 주신 데 대해 감사드립니다. 이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (81801977) (B.Y.), 상하이 시 보건위원회의 뛰어난 청소년 교육 프로그램 (2018YQ54) (B.Y.), 상하이 항해 프로그램 (18YF1420400) (B.Y.), 그리고 상하이 키 연구소의 오픈 펀드 (B.Y.) (B.Y.) 및 상하이 키 연구소 (B.Y.) (B.Y.) (B.Y.) 및 오픈 펀드 (B.Y.)

제브라피쉬는 동물 복지에 대한 윤리적 검토를 위한 실험실 동물 가이드라인(GB/T 35823-2018)을 준수하여 표준 조건하에서 제기되었습니다. 본 연구에서 모든 제브라피시 실험은 승인(2019-A016-01)을 승인하고 푸단 대학교 상하이 공중 보건 임상 센터에서 실시했습니다.
1. M. 마리넘 단일 세포 접종 준비(그림 1)
<ol><li>-80 °C에서 세룰리안 형광 M. 마?...

<ol>
	<li>Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+innate+immunity+by+Mycobacterium+tuberculosis:+is+death+an+exit+strategy.">Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).</li><li>Lamkanfi, M., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+host+cell+death+pathways+during+microbial+infections.">Manipulation of host cell death pathways during microbial infections.</a> Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. 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A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+host+defense:+new+insights+from+zebrafish.">Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).</li><li>Lesley, R., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+early+mycobacterial+pathogenesis+from+the+zebrafish.">Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish.</a> Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).</li><li>Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pathogenesis+of+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis.</a> Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).</li><li>Clay, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomous+role+of+the+macrophage+in+early+Mycobacterium+marinum+infection+of+the+zebrafish.">Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish.</a> Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).</li><li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos.">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).</li><li>Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cells+moderate+inflammatory+progression+and+enhance+bacterial+containment+upon+pulmonary+challenge+with+Mycobacterium+tuberculosis.">cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis.</a> Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+plays+critical+role+during+Edwardsiella+piscicida+immersion+infection+in+zebrafish+larvae.">Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae.</a> Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nlrc3-like+is+required+for+microglia+maintenance+in+zebrafish.">Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Colonization+of+Developing+Zebrafish+Midbrain+Is+Promoted+by+Apoptotic+Neuron+and+Lysophosphatidylcholine.">Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine.</a> Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).</li><li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interception+of+host+angiogenic+signalling+limits+mycobacterial+growth.">Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth.</a> Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).</li><li>Kulms, D., Schwarz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+UV-induced+apoptosis.">Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis.</a> Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).</li><li>van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+apoptotic+cells+in+zebrafish.">Live imaging of apoptotic cells in zebrafish.</a> FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).</li><li>Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+changes+during+programmed+cell+deaths.">Plasma membrane changes during programmed cell deaths.</a> Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).</li><li>Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoplasmin+regulates+chromatin+condensation+during+apoptosis.">Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).</li><li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+infection:+a+double-edged+sword+for+host+and+pathogen+survival.">Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival.</a> Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).</li><li>Traven, A., Naderer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+egress:+a+hitchhiker's+guide+to+freedom.">Microbial egress: a hitchhiker's guide to freedom.</a> PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).</li></ol>

이 프로토콜은 균균 감염 중 대식세포 죽음의 시각화를 설명합니다. 세포막의 무결성 등의 요인에 기초하여, 감염 구동 세포 사멸은 세포사멸과 사멸세포사멸(24,25)으로나눌 수 있다. 용리세포 사멸은 세포사멸보다 유기체에 더 스트레스가 많으며, 강한 염증 반응을 유발하기 때문에 24,25. 생체 내에서 용액 ?...

마이코박테리아 감염은 숙주 면역세포 사멸을 유발하는 것으로 입증되었다1. 예를 들면, 감쇠한 긴장은 대식세포에 있는 세포자멸을 시작하고 감염을 포함할 것입니다. 그러나, 악성 긴장은 세균성보급을일으키는 원인이 되는 lytic 세포 죽음을 시작할 것입니다1,2. 세포 죽음의 이 다른 모형이 호스트 항 진균 반응에 있는 충격을 고려하면, 생체 내에서 진균 감염 도중 대식세포 세포 죽음의 상세한 관측이 필요합니다.
세포 사멸을 측정하는 종래의 방법은 안네신 V, TUNEL, 또는 아크리딘 오렌지/프로피듐 요오드화물 염색3,4,5와같은 죽은 세포 얼룩을 사용하는 것이다. 그러나, 이러한 방법은 생체 내에서 세포 사멸의 동적 과정에 빛을 비출 수 없습니다. 시험관내 세포 사멸의 관찰은 이미 살아있는 화상 진찰6에의해 촉진되었습니다. 그러나, 결과 정확 하 게 생리 조건을 모방 여부 불분명 남아.
Zebrafish는 호스트 항 진균 반응을 연구하기위한 훌륭한 모델이었습니다. 그것은 인간과 유사한 높게 보존된 면역 계통을, 쉽게 조작한 게놈, 및 초기 태아는 살아있는 화상진찰7,8,9를허용하는 투명합니다. M. marinum에 감염 후, 성인 얼룩말 은 전형적인 성숙한 육아종 구조를 형성하고, 배아 제브라피쉬는 구조9,10과같은 초기 육아종을 형성한다. 선천성 면역세포-박테리아 상호작용의 역동적인 과정은 제브라피쉬 M. 마리눔 감염 모델11,12에서이전에 탐구되었다. 그러나, 높은 공간 시간적 해상도 요구 사항으로 인해, 타고난 면역 세포의 죽음을 둘러싼 세부 사항은 크게 정의되지 않은 남아있다.
여기에서 우리는 생체 내에서 진균 감염에 의해 유발된 대식세포 리선세포 사멸의 과정을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 발달 및 염증 동안 생체 내에서 세포 행동을 시각화에 적용될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% OADC</td>
			<td>BD</td>
			<td>211886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;m filter</td>
			<td>Mille X</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#956;l/ml hygromycin</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H10</td>
			<td>BD</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9</td>
			<td>BD</td>
			<td>262310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A glass bottom 35 mm dish</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D35-10-0-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A60015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enviromental Chamber</td>
			<td>Pecon</td>
			<td>temp control 37-2 digital</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>No.5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Bioland Scientific LLC</td>
			<td>7105P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Keelrein</td>
			<td>PH-140(A)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M.marinum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATCC BAA-535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection needle</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>IB100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>msp12:cerulean</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 25470057; 27760340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single concavity glass microscope slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>SCICNTZ</td>
			<td>JY92-IIDN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (OD600)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>22331 Hamburg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>SZX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mfap4:eGFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 30742890</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 31278008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 27424497; 17477879</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of macrophage lytic cell death during mycobacterial infection in zebrafish embryos via intravital microscopy

Zebrafish는 초기 개발 중에 선천적 면역 체계에 전적으로 의존하여 투명한 자연과 의존성으로 인해 선천적 면역 세포 행동을 연구하기위한 훌륭한 모델 유기체입니다. 제브라피쉬 마이코박테리움 마리눔(M. marinum)감염 모델은 진균 감염에 대한 숙주 면역 반응을 연구하는 데 잘 확립되어 있다. 다른 대식세포 사멸 유형이 진균 감염의 다양한 결과로 이어질 것이라는 것이 제안되었다. 여기에서 우리는 M. marinum 감염 다음 zebrafish 태아에 있는 대식세포 세포 죽음을 관찰하기 위하여 intravital 현미경 검사를 사용하여 프로토콜을 기술합니다. 특히 대식세포와 호중구에 라벨을 붙이는 Zebrafish 형질전환 선은 중뇌 또는 트렁크에 형광으로 표지된 M. marinum의 근육 내 미세 주입을 통해 감염됩니다. 감염된 제브라피시 배아는 이후에 낮은 용융 아가로오스에 장착되고 X-Y-Z-T 치수에서 공초점 현미경 검사법에 의해 관찰됩니다. 장기 라이브 이미징은 광표백 및 광독성을 피하기 위해 낮은 레이저 파워를 사용해야 하기 때문에 형질전환이 강력히 권장됩니다. 이 프로토콜은 면역 세포 이동, 숙주 병원체 상호 작용 및 세포 사멸을 포함하는 생체 내 동적 프로세스의 시각화를 용이하게 합니다.

진균 감염은 감염의 경로에 따라 다른 호스트 반응을 시작할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 제브라피쉬 배아는 형광으로 표지된 박테리아를 중뇌 또는 트렁크내로 근육 내 미세 주입에 의해 감염되고(도3)공초점 라이브 이미징에 의해 관찰된다. 이 2개의 경로를 통해감염은 선천적인 면역 세포 모집 및 후속 세포 죽음을 일으키는 원인이 되는 감염을 현지로 제한할 것입니?...

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Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

이 프로토콜은 마이코박테리움 마리눔 감염 동안 배아 제브라피시의 대식세포 행동 및 사망을 시각화하는 기술을 설명합니다. 박테리아의 준비, 배아감염 및 활력 내 현미경 검사법 에 대한 단계가 포함되어 있습니다. 이 기술은 감염 또는 멸균 염증을 관련시키는 유사한 시나리오에 있는 세포 행동 그리고 죽음의 관측에 적용될 수 있습니다.

제브라피시 배아에서 사체내 현미경 검사를 통해 진균 감염 시 대식세포 리액세포 사멸 시 시각화

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...

이 프로토콜은 균균 감염 중 대식 세포 사멸 모드를 명확하게 구별 할 수 있습니다. 여러 배아를 병렬로 관찰함으로써 전체 대식세포 세포 사멸 과정을 포착할 확률을 크게 증가시킨다. 이 프로토콜은 또한 감염 또는 멸균 염증을 관련시키는 유사한 시나리오에서 세포 사멸 및 그밖 세포 행동의 관찰에 적용될 수 있습니다.확장 된 라이브 이미징 동안, 광표백 및 독성을 피하기 위해 가능한 한 낮은 레이저의 강도를 유지하는 것이 매우 중요합니다. 원고에 따라 접종 후, 원심 분리는 10 분 동안 3000 배 G에서 문화를 원심분리하여 진균 마리넘을 펠릿으로 수집합니다. 상류체의 300 마이크로리터를 제외한 모든 것을 버리고 펠릿을 다시 중단합니다.7H9 배지 3밀리리터를 10%의 글리세롤을 추가하여 펠릿을 다시 정지한 다음 100와트의 수조에서 서스펜션을 초음파 처리하여 15초, 15초 를 끄고 총 2분 동안 단일 세포 균질을 달성합니다. 세균 현탁액을 10 밀리리터 주사기로 옮기고 5미크론 필터를 통과하여 세균 덩어리를 제거합니다. 분광계를 사용하여 서스펜션의 광학 밀도를 측정하고 10% 글리세롤을 함유한 7H9 매체로 희석하여 OD 600에 1을 희석한다.서스펜션을 10마이크로리터 알리쿼트로 나누고, 추가 사용을 위해 섭씨 80도에 보관하십시오. 첫째, 아가로즈를 완전히 녹을 때까지 섭씨 95도 의 가열 블록으로 가열합니다. 아가로즈를 액체 형태로 유지하여 섭씨 45도 의 가열 블록에 배치하십시오.트렁크 부위의 근육 내 감염을 위해 장착하려면, 유리 슬라이드에 균등하게 아가로즈에 의해 1%의 중량 1%의 0.5 밀리리터를 부어 하부 아가로즈 층을 만듭니다. 슬라이드를 얼음 상자 또는 차가운 표면에 3 분 동안 배치하여 고화시합니다. 제브라피시 배아를 마취한 후, 최대 60마리의 제브라피시 배아를 바닥 아가로즈 층에 놓고 두 줄로 조심스럽게 배치합니다.티슈 페이퍼로 바텀 아가로즈 층에 남은 물을 제거하고, 0.3 밀리리터를 부피아가로즈에 추가하여 상층을 생성한다. 배아가 아가로즈에 완전히 내장되어 있는지 확인하십시오. 유리 슬라이드를 얼음 상자에 다시 반환하여 아가로즈를 고화시합니다.여분의 E3 달걀 물로 표면을 덮어 아가로즈 의 상단 층을 촉촉하게 유지합니다. 다음으로, 미세 주입기 및 미세 조작기를 미세 주입에 대한 적절한 위치 및 설정으로 조정합니다. 마이크로 로더를 사용하여 준비된 세균 배양 3개의 마이크로리터를 준비된 바늘로 옮기.파이펫은 기포가 형성되지 않도록 천천히 조심스럽게. 트렁크 영역에 100 CFU를 주입합니다. 미세 주입 후 얼룩말 물고기 배아를 플라스틱 파이펫으로 신선한 달걀 물에 조심스럽게 씻어 넣습니다.중뇌 감염을 위해 마운트하려면 플라스틱 파이펫을 사용하여 4-6개의 트리카인 마취 배아를 아가로즈로 옮겨 넣습니다. 각 배아의 머리를 10 게이지 바늘로 조심스럽게 위쪽으로 놓습니다. 모든 배아 위치가 고정되면 유리 슬라이드를 얼음 상자 또는 차가운 표면으로 옮겨 아가로즈가 고화하게 합니다.중뇌에 500 CFU를 주입하십시오. 미세 주입 후, 조심스럽게 플라스틱 파이펫신선한 계란 물에 제브라 피시 배아를 플러시. 아가로즈가 완전히 굳어지면 아가로즈를 달걀 물 층으로 덮습니다.환경 챔버를 설치 한 후, 환경 챔버에 제브라피시와 35 밀리미터 유리 바닥 접시를 배치합니다. 405 다이오드, 20%의 힘으로 아르곤, DPSS 561 나노미터 레이저를 엽니다. 스펙트럼 설정에서 적절한 레이저 전원을 설정합니다.XYZ 순차 스캔 획득 모드를 선택하고 이미지 형식을 512x 512픽셀로 설정합니다. 라이브 데이터 모드로 전환하고 첫 번째 제브라피시의 위치를 타겟팅하고 시작 및 끝 Z 위치를 표시합니다. 나머지 배아 각각에 대해 이 과정을 반복한다.프로그램 끝에 일시 중지를 추가합니다. 프로그램의 루프 및 주기를 정의하고 파일을 저장합니다. 이 연구에서는, 우리는 이전에 보고된 형질형 coro1a:eGFP;lyzDsRed2, 및 형질형 mpeg1loxP;DsRed:loxPeGFP;lyz:eGFP를 활용하여 생체내 의 대식세포와 호중구를 구별했습니다.박테리아로 무겁게 채지는 대식세포는 둥글게 되었고, 최종 세포질 팽윤, 세포막 파열, 세포질 함량의 빠른 보급과 함께, 감소된 운동성을 표시하였다. UV 조사 대식세포는 세포 수축, 핵 분열 및 크로마티닌 응축과 같은 전형적인 세포 표현형을 보였다. 또한 대식세포가 활발하게 식세포화및 M.메리눔을 전파하는 것을 관찰했다.그러나, 호중구는 식세포 기능을 제한하고, 명백한 세균성 engorgement 없이 빨리 lytic 세포 죽음을 겪었습니다. 강력한 유전자 편집 도구와 결합된 이 프로토콜은 생체 내의 숙주 병원체 상호 작용에 대한 다양한 요인의 효과를 더 잘 이해할 수 있는 효과적인 플랫폼을 제공할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

사타구니 림프 노드의 Intravital 현미경

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

연구

면역학 및 감염병학

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

비장의 Intravital 현미경 : 기생충 이동성 및 혈류의 정량 분석

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

세포내 세균성 병원균과 Zebrafish 태아의 감염

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

라이브 세포 형광 현미경을 사용하여 박테리아 독소 유도 응답의 시각화

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

라이브 식세포에 Phagolysosome 속생의 연구

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

의 비 용해성 세포 외 유출을 시각화<em&gt; 크립토 콕 쿠스 네오 포르</em&gt; 디지털 광학 현미경을 사용하여 대 식세포에서

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 대 식 세포 세포 외 트랩을 시각화

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

포화 지방산은 세 라마 이드 관련 된 대 식 세포 세포 죽음을 유도

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...