Name: visualization of macrophage lytic cell death during mycobacterial infection in zebrafish embryos via intravital microscopy
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy at JoVE.com

Vi takker Dr. Zilong Wen for deling sebrafisk stammer, Dr. Stefan Oehlers og Dr. David Tobin for deling M. marinum relaterte ressurser, Yuepeng han for hjelp i figuren forberedelse. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina (81801977) (B.Y.), fremragende Youth Training program av Shanghai Municipal Health Commission (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai Sailing program (18YF1420400) (B.Y.), og Open Fund of Shanghai nøkkel laboratorium for tuberkulose (2018KF02) (B.Y.).

Sebrafisk ble reist under standard forhold i samsvar med laboratorie dyrs retningslinjer for etisk gjennomgang av dyrevelferd (GB/T 35823-2018). Alle sebrafisk eksperimenter i denne studien ble godkjent (2019-A016-01) og gjennomført ved Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University.
1. M. marinum enkelt celle inokulum forberedelse (figur 1)
<ol><li>Tin Cerulean-fluorescerende M. marinum glyserol lager fra-80 ° c og vaksinere en 7H1...

<ol>
	<li>Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+innate+immunity+by+Mycobacterium+tuberculosis:+is+death+an+exit+strategy.">Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).</li><li>Lamkanfi, M., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+host+cell+death+pathways+during+microbial+infections.">Manipulation of host cell death pathways during microbial infections.</a> Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Apoptosis+and+Necrosis+by+Annexin+V+Binding,+Propidium+Iodide+Uptake,+and+Flow+Cytometry.">Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+DNA+Fragmentation+in+Apoptotic+Cells+by+TUNEL.">Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).</li><li>Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Cell+Viability+with+Single-,+Dual-,+and+Multi-Staining+Methods+Using+Image+Cytometry.">Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).</li><li>Rathkey, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+visualization+of+gasdermin+D-driven+pyroptotic+cell+death.">Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).</li><li>Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+neutrophil+biology.">Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology.</a> Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).</li><li>Harvie, E. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+host+defense:+new+insights+from+zebrafish.">Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).</li><li>Lesley, R., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+early+mycobacterial+pathogenesis+from+the+zebrafish.">Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish.</a> Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).</li><li>Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pathogenesis+of+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis.</a> Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).</li><li>Clay, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomous+role+of+the+macrophage+in+early+Mycobacterium+marinum+infection+of+the+zebrafish.">Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish.</a> Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).</li><li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos.">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).</li><li>Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cells+moderate+inflammatory+progression+and+enhance+bacterial+containment+upon+pulmonary+challenge+with+Mycobacterium+tuberculosis.">cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis.</a> Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+plays+critical+role+during+Edwardsiella+piscicida+immersion+infection+in+zebrafish+larvae.">Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae.</a> Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nlrc3-like+is+required+for+microglia+maintenance+in+zebrafish.">Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Colonization+of+Developing+Zebrafish+Midbrain+Is+Promoted+by+Apoptotic+Neuron+and+Lysophosphatidylcholine.">Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine.</a> Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).</li><li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interception+of+host+angiogenic+signalling+limits+mycobacterial+growth.">Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth.</a> Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).</li><li>Kulms, D., Schwarz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+UV-induced+apoptosis.">Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis.</a> Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).</li><li>van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+apoptotic+cells+in+zebrafish.">Live imaging of apoptotic cells in zebrafish.</a> FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).</li><li>Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+changes+during+programmed+cell+deaths.">Plasma membrane changes during programmed cell deaths.</a> Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).</li><li>Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoplasmin+regulates+chromatin+condensation+during+apoptosis.">Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).</li><li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+infection:+a+double-edged+sword+for+host+and+pathogen+survival.">Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival.</a> Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).</li><li>Traven, A., Naderer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+egress:+a+hitchhiker's+guide+to+freedom.">Microbial egress: a hitchhiker's guide to freedom.</a> PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).</li></ol>

Denne protokollen beskriver visualisering av macrophage død under mykobakterieinfeksjoner infeksjon. Basert på faktorer som integriteten til cellemembranen, kan smitte drevet celle død deles inn i apoptose og lytisk celle død24,25. Lytisk celle død er mer stressende for organismen enn apoptose, fordi det utløser en sterk inflammatorisk respons 24,25. Observasjon av lytisk celle død in vivo er vansk...

Mykobakterieinfeksjoner infeksjon har vist å forårsake vert immun cellen død1. For eksempel vil en svekket belastning utløse apoptose i makrofager og inneholde infeksjonen. Imidlertid vil en ondartet belastning utløse lytisk celle død, forårsaker bakteriell formidling1,2. Betenke innvirkningen disse annerledes typer av cellen død ha opp på vert anti-mykobakterieinfeksjoner svaret, en detaljert observasjon av macrophage cellen død i løpet av mykobakterieinfeksjoner infeksjon inne Vivo er behøvde.
De konvensjonelle metodene for å måle celle død er å bruke døde celle flekker, slik som Annnexin V, TUNEL, eller Akridin Orange/propidium iodide farging3,4,5. Men disse metodene er ikke i stand til å belyse den dynamiske prosessen med celle død in vivo. Observasjon av celle død in vitro har allerede blitt tilrettelagt av Live Imaging6. Men om resultatene nøyaktig etterligne fysiologiske forhold forblir uklart.
Sebrafisk har vært en utmerket modell for å studere Host anti-Mycobacterium svar. Den har en svært bevart immunsystem som ligner på mennesker, en lett manipulert Genova, og tidlig embryo er gjennomsiktige, noe som gjør det mulig for Live Imaging7,8,9. Etter smitte med M. marinum, voksen sebrafisk form typisk modne granulom strukturer, og embryonale sebrafisk form tidlig granulom som strukturer9,10. Den dynamiske prosessen med medfødt immun celle-bakterier interaksjon har vært utforsket tidligere i sebrafisk M. marinum infeksjon modell11,12. Men på grunn av høy romlig-Temporal oppløsning kravet, detaljene rundt død av medfødte immunceller fortsatt i stor grad udefinert.
Her beskriver vi hvordan å visualisere prosessen med macrophage lytisk celle død utløst av mykobakterieinfeksjoner infeksjon in vivo. Denne protokollen kan også anvendes for å visualisere cellulær atferd i vivo under utvikling og inflammasjon.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% OADC</td>
			<td>BD</td>
			<td>211886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;m filter</td>
			<td>Mille X</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#956;l/ml hygromycin</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H10</td>
			<td>BD</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9</td>
			<td>BD</td>
			<td>262310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A glass bottom 35 mm dish</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D35-10-0-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A60015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enviromental Chamber</td>
			<td>Pecon</td>
			<td>temp control 37-2 digital</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>No.5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Bioland Scientific LLC</td>
			<td>7105P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Keelrein</td>
			<td>PH-140(A)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M.marinum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATCC BAA-535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection needle</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>IB100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>msp12:cerulean</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 25470057; 27760340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single concavity glass microscope slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>SCICNTZ</td>
			<td>JY92-IIDN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (OD600)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>22331 Hamburg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>SZX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mfap4:eGFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 30742890</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 31278008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 27424497; 17477879</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of macrophage lytic cell death during mycobacterial infection in zebrafish embryos via intravital microscopy

Sebrafisk er en utmerket modell organisme for å studere medfødt immun celle atferd på grunn av sin gjennomsiktige natur og tillit utelukkende på sin medfødte immunsystem under tidlig utvikling. Den sebrafisk Mycobacterium marinum (M. marinum) infeksjon modellen har vært godt etablert i å studere vert immunrespons mot mykobakterieinfeksjoner infeksjon. Det har blitt antydet at ulike macrophage celle døds typer vil føre til ulike utfall av mykobakterieinfeksjoner infeksjon. Her beskriver vi en protokoll som bruker intravital mikroskopi å observere macrophage celle død i sebrafisk embryo etter M. marinum infeksjon. Sebrafisk transgene linjer som spesielt Label makrofager og nøytrofile er infisert via intramuskulær microinjection av fluorescensmerkete merket M. marinum i enten mellomhjernen eller stammen. Infiserte sebrafisk embryo er senere montert på lavt smelte agarose og observert av konfokalmikroskopi mikroskopi i X-Y-Z-T dimensjoner. Fordi langsiktig Live Imaging krever bruk av lav laser effekt for å unngå photobleaching og Phototoksisitet, er en sterkt uttrykker transgene sterkt anbefalt. Denne protokollen forenkler visualisering av dynamiske prosesser in vivo, inkludert immun celle migrasjon, vert patogen samhandling, og celle død.

Mycobacterium infeksjon kanne avtrekker annerledes vert svar basert på veiene av infeksjon. I denne protokollen, sebrafisk embryo er smittet av intramuskulær microinjection av fluorescensmerkete merket bakterier i mellomhjernen eller trunk (Figur 3) og observert av konfokalmikroskopi Live Imaging. Infeksjon via disse to rutene vil lokalt begrense infeksjonen forårsaker medfødt immun celle rekruttering og påfølgende celle død.
Visualisere detaljene i medfød...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy at JoVE.com

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

Denne protokollen beskriver en teknikk for å visualisere macrophage atferd og død i embryonale sebrafisk under Mycobacterium marinum infeksjon. Trinn for utarbeidelse av bakterier, infeksjon av embryo, og intravital mikroskopi er inkludert. Denne teknikken kan brukes til observasjon av cellulære atferd og død i lignende scenarier som involverer infeksjon eller steril betennelse.

Visualisering av macrophage lytisk Cell Death under Mykobakterieinfeksjoner infeksjon i sebrafisk embryo via Intravital mikroskopi

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...

Denne protokollen kan tydelig skille makrofag celle død moduser under mykobakteriell infeksjon. Ved å observere flere embryoer parallelt, øker det i stor grad sannsynligheten for å fange hele makrofaglytisk celledødsprosess. Denne protokollen kan også brukes til observasjon av celledød og annen cellulær atferd i lignende scenarier som involverer infeksjon eller steril betennelse.Under den utvidede live imaging, Det er svært viktig å holde intensiteten av laseren så lav som mulig for å unngå fotobleaching og toksisitet. Etter inokulasjon i henhold til manuskriptet, sentrifugere kulturen på 3000 ganger G i 10 minutter for å samle Mycobacterium marinum som pellet. Kast alle unntatt 300 mikroliter av supernatanten, og suspender pelleten på igjen.Tilsett tre milliliter 7H9 medium med 10% glyserol for å ytterligere suspendere pelleten, og deretter sonikere suspensjonen i et vannbad på 100 watt, med 15 sekunder på og 15 sekunder av, i totalt to minutter for å oppnå en enkelt celle homogenat. Overfør bakteriesuspensjonen til en 10 milliliter sprøyte, og passere gjennom et fem mikronfilter for å fjerne eventuelle bakterielle klumper. Ved hjelp av et spektrofotometer måler du suspensjonens optiske tetthet og fortynner den med 7H9-medier som inneholder 10 % glyserol til OD 600 ved ett.Del suspensjonen i 10 mikroliter aliquots, og lagre på negative 80 grader Celsius fryser for videre bruk. Først varmer du opp agarose i en 95 graders Celsius varmeblokk til den er helt smeltet. Opprettholde agarose i flytende form ved å plassere den i en 45 grader Celsius varmeblokk.For å montere for intramuskulær infeksjon i bagasjerommet, opprett det nederste agaroselaget ved å helle 0,5 milliliter med 1% vekt ved volum oppsto jevnt på et glasssklie. Plasser lysbildet på en isboks eller kald overflate i tre minutter for å stivne. Etter å ha bedøvet sebrafiskembryoene, legg opptil 60 sebrafiskembryoer på det nederste agaroselaget, og legg dem forsiktig ut i to rader.Fjern eventvist gjenværende vann på det nederste agaroselaget med silkepapir, før du legger til 0,3 milliliter med 0,5% vekt ved volum oppsto for å lage det øvre laget. Sørg for at embryoene er helt innebygd i agarose. Sett glasssklien tilbake til isboksen igjen for å størkne agarose.Hold det øverste laget av agarose fuktig ved å dekke overflaten med ekstra E3 eggvann. Deretter justerer du mikroinjektoren og mikromanipulatoren til riktig posisjon og innstilling for mikroinjeksjon. Overfør tre mikroliter av forberedt bakteriell kultur til den tilberedte nålen ved hjelp av en mikrolaster.Pipetten sakte og forsiktig for å unngå å danne luftbobler. Injiser 100 CFU i bagasjerommet. Etter mikroinjeksjon, skyll forsiktig sebrafiskembryoene i friskt eggvann med en plastpipette.For å montere for midbrain infeksjon, bruk en plastpipette for å overføre de fire til seks trikain-bedøvet embryoer inn i agarose. Plasser hodet på hvert embryo oppover forsiktig med en 10-gauge nål. Når alle embryostillinger er festet, overføre glasset lysbildet til en isboks eller kald overflate for å la agarose stivne.Injiser 500 CFU i midbrain. Etter mikroinjeksjon, skyll sebrafiskembryoene forsiktig i friskt eggvann med en plastpipette. Når agarose har helt størknet, dekk agarose med et lag med eggvann.Etter å ha satt opp miljøkammeret, legg 35 millimeter glassbunnsfat med sebrafisken i miljøkammeret. Åpne 405 diode, argon på 20% strøm, og DPSS 561 nanometer laser. Sett opp riktig lasereffekt i spektruminnstillinger.Velg XYZ sekvensiell skanneanskaffelsesmodus, og sett bildeformatet til 512 x 512 piksler. Bytt til live datamodus, mål posisjonen til den første sebrafisken, og merk start- og slutt Z-posisjonen. Gjenta denne prosessen for hvert av de gjenværende embryoene.Legg til en pause på slutten av programmet. Definer løkken og syklusen til programmet, og lagre filen. I denne studien benyttet vi tidligere rapporterte transgene coro1a:eGFP;lyzDsRed2, og transgen mpeg1loxP;DsRed:loxPeGFP;lyz:eGFP, for å skille mellom makrofagene og nøytrofile in vivo.En makrofag som var sterkt oppslukt av bakterier ble rund og viste redusert motilitet, med eventuell cytoplasmatisk hevelse, rupturing av cellemembranen og rask spredning av cytoplasmatisk innhold. UV-bestrålte makrofager viste typiske apoptotiske cellefenotyper som cellekrymping, kjernefysisk fragmentering og kromatinkondensering. Det ble også observert makrofagene aktivt fagocytosed og formidlet M.merinum.Nøytrofiler hadde imidlertid begrenset fagocytisk evne, og gjennomgikk raskt lytisk celledød uten åpenbar bakteriell engorgement. Kombinert med kraftige genredigeringsverktøy kan denne protokollen gi en effektiv plattform for å ytterligere forstå effekten av en rekke faktorer på vertspatogeninteraksjon in vivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital Mikroskopi av Spleen: Kvantitativ analyse av Parasite Mobilitet og Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Infeksjon av sebrafisk embryo med intracellulære bakterier

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisering av bakteriell Toxin Utførte Responses ved hjelp av Live Cell fluorescensmikroskopi

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Meget Løst Intravital Striped-belysning Mikroskopi av Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Studier av Phagolysosome Biogenesis i Levende Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualisering Non-lytisk eksocytose av<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; Fra Makrofager Bruke Digital Light Mikros

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse av Natural Killer Cell Lytisk aktivitet i humant fullblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisere Macrophage ekstracellulære feller bruker AC Confocal mikroskopi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Mettede fettsyrer indusere celledød Ceramide-assosiert Macrophage

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...