Name: visualization of macrophage lytic cell death during mycobacterial infection in zebrafish embryos via intravital microscopy
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy at JoVE.com

Agradecemos ao Dr. Zilong Wen por compartilhar cepas de zebrafish, Dr. Stefan Oehlers e Dr. David Tobin por compartilhar recursos relacionados a M. marinum, Yuepeng Ele para assistência na preparação de figuras. Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (81801977) (B.Y.), pelo Outstanding Youth Training Program of Shanghai Municipal Health Commission (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai Sailing Program (18YF1420400) (B.Y.) e Open Fund of Shanghai Key Laboratory of Tuberculosis (2018KF02) (B.Y.).

Zebrafish foram levantados condições padrão em conformidade com as diretrizes de laboratório animal para revisão ética do bem-estar animal (GB /T 35823-2018). Todos os experimentos com zebrafish neste estudo foram aprovados (2019-A016-01) e realizados no Centro Clínico de Saúde Pública de Xangai, Universidade de Fudan.
1. M. Marinum Single Cell Inoculum Preparação (Figura 1)
<ol><li>Descongele o estoque de glicerol M. marinum fluores...

<ol>
	<li>Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+innate+immunity+by+Mycobacterium+tuberculosis:+is+death+an+exit+strategy.">Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).</li><li>Lamkanfi, M., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+host+cell+death+pathways+during+microbial+infections.">Manipulation of host cell death pathways during microbial infections.</a> Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Apoptosis+and+Necrosis+by+Annexin+V+Binding,+Propidium+Iodide+Uptake,+and+Flow+Cytometry.">Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+DNA+Fragmentation+in+Apoptotic+Cells+by+TUNEL.">Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).</li><li>Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Cell+Viability+with+Single-,+Dual-,+and+Multi-Staining+Methods+Using+Image+Cytometry.">Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).</li><li>Rathkey, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+visualization+of+gasdermin+D-driven+pyroptotic+cell+death.">Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).</li><li>Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+neutrophil+biology.">Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology.</a> Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).</li><li>Harvie, E. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+host+defense:+new+insights+from+zebrafish.">Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).</li><li>Lesley, R., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+early+mycobacterial+pathogenesis+from+the+zebrafish.">Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish.</a> Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).</li><li>Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pathogenesis+of+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis.</a> Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).</li><li>Clay, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomous+role+of+the+macrophage+in+early+Mycobacterium+marinum+infection+of+the+zebrafish.">Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish.</a> Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).</li><li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos.">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).</li><li>Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cells+moderate+inflammatory+progression+and+enhance+bacterial+containment+upon+pulmonary+challenge+with+Mycobacterium+tuberculosis.">cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis.</a> Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+plays+critical+role+during+Edwardsiella+piscicida+immersion+infection+in+zebrafish+larvae.">Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae.</a> Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nlrc3-like+is+required+for+microglia+maintenance+in+zebrafish.">Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Colonization+of+Developing+Zebrafish+Midbrain+Is+Promoted+by+Apoptotic+Neuron+and+Lysophosphatidylcholine.">Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine.</a> Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).</li><li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interception+of+host+angiogenic+signalling+limits+mycobacterial+growth.">Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth.</a> Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).</li><li>Kulms, D., Schwarz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+UV-induced+apoptosis.">Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis.</a> Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).</li><li>van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+apoptotic+cells+in+zebrafish.">Live imaging of apoptotic cells in zebrafish.</a> FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).</li><li>Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+changes+during+programmed+cell+deaths.">Plasma membrane changes during programmed cell deaths.</a> Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).</li><li>Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoplasmin+regulates+chromatin+condensation+during+apoptosis.">Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).</li><li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+infection:+a+double-edged+sword+for+host+and+pathogen+survival.">Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival.</a> Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).</li><li>Traven, A., Naderer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+egress:+a+hitchhiker's+guide+to+freedom.">Microbial egress: a hitchhiker's guide to freedom.</a> PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).</li></ol>

Este protocolo descreve a visualização da morte do macrófago durante a infecção mycobacterial. Com base em fatores como a integridade da membrana celular, a morte celular impulsionada por infecção pode ser dividida em apoptose e morte de células líticas24,25. A morte das células líticas é mais estressante para o organismo do que a apoptose, pois desencadeia uma forte resposta inflamatória 24,25.</s...

Infecção micobacteriana tem sido demonstrado para causar morte de células imunes hospedeiras1. Por exemplo, uma cepa atenuada irá desencadear apoptose em macrófagos e conter a infecção. No entanto, uma cepa virulenta irá desencadear a morte de células líticas, causando disseminação bacteriana1,2. Considerando o impacto que esses diferentes tipos de morte celular têm na resposta anti-micobacteriana do hospedeiro, é necessária uma observação detalhada da morte de células de macrófago durante a infecção micobacteriana in vivo.
Os métodos convencionais para medir a morte celular são usar manchas de células mortas, como Annnexin V, TUNEL, ou acridina laranja / propidium iodeto manchando3,4,5. No entanto, esses métodos são incapazes de lançar luz sobre o processo dinâmico de morte celular in vivo. A observação da morte celular in vitro já foi facilitada por imagens vivas6. No entanto, se os resultados imitam com precisão as condições fisiológicas ainda não está claro.
Zebrafish tem sido um excelente modelo para estudar host respostas anti-mycobacterium. Tem um sistema imunológico altamente conservado semelhante ao dos seres humanos, um genoma facilmente manipulado, e os embriões iniciais são transparentes, o que permite imagens vivas7,8,9. Após a infecção por M. marinum, zebrafish adulto formam estruturas típicas de granuloma maduro, e zebrafish embrionário formam granuloma precoce como estruturas9,10. O processo dinâmico de interação célula-bactéria imune inata tem sido explorado anteriormente no modelo de infecção por marinum m. marinum 11,12. No entanto, devido à alta exigência de resolução espacial-temporal, os detalhes em torno da morte das células imunes inatas permanecem em grande parte indefinidos.
Aqui descrevemos como visualizar o processo de morte celular lítica de macrófago desencadeada pela infecção micobacteriana in vivo. Este protocolo também pode ser aplicado à visualização do comportamento celular in vivo durante o desenvolvimento e inflamação.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% OADC</td>
			<td>BD</td>
			<td>211886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;m filter</td>
			<td>Mille X</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#956;l/ml hygromycin</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H10</td>
			<td>BD</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9</td>
			<td>BD</td>
			<td>262310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A glass bottom 35 mm dish</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D35-10-0-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A60015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enviromental Chamber</td>
			<td>Pecon</td>
			<td>temp control 37-2 digital</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>No.5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Bioland Scientific LLC</td>
			<td>7105P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Keelrein</td>
			<td>PH-140(A)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M.marinum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATCC BAA-535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection needle</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>IB100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>msp12:cerulean</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 25470057; 27760340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single concavity glass microscope slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>SCICNTZ</td>
			<td>JY92-IIDN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (OD600)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>22331 Hamburg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>SZX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mfap4:eGFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 30742890</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 31278008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 27424497; 17477879</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of macrophage lytic cell death during mycobacterial infection in zebrafish embryos via intravital microscopy

Zebrafish é um excelente organismo modelo para estudar o comportamento inato das células imunes devido à sua natureza transparente e dependência exclusivamente em seu sistema imunológico inato durante o desenvolvimento precoce. O modelo de infecção por Zebrafish Mycobacterium marinum (M. marinum)foi bem estabelecido no estudo da resposta imune do hospedeiro contra a infecção micobacteriana. Tem sido sugerido que diferentes tipos de morte de células de macrófago levará aos diversos resultados da infecção micobacteriana. Aqui descrevemos um protocolo usando microscopia intravital para observar a morte celular de macrófagos em embriões de zebrafish após a infecção por M. marinum. Linhas transgênicas de zebrafish que rotulam especificamente macrófagos e neutrófilos estão infectadas por meio de microinjeção intramuscular de M. marinum com rótulo fluorescente no meio do cérebro ou no tronco. Embriões de zebrafish infectados são posteriormente montados em baixa agarose de fusão e observados pela microscopia confocal nas dimensões X-Y-Z-T. Como a imagem ao vivo a longo prazo requer o uso de baixa potência a laser para evitar o fotobranqueamento e a fototoxicidade, um transgênico fortemente expressor é altamente recomendado. Este protocolo facilita a visualização dos processos dinâmicos in vivo, incluindo a migração de células imunes, interação de patógenos hospedeiros e morte celular.

A infecção por micobactéria pode desencadear diferentes respostas do hospedeiro com base nas rotas da infecção. Neste protocolo, os embriões de zebrafish são infectados por microinjeção intramuscular de bactérias fluorescentemente rotuladas no meio do cérebro ou tronco (Figura 3)e observadas por imagens confocais ao vivo. Infecção através destas duas rotas irá restringir localmente a infecção causando recrutamento de células imunes inatas e subsequente morte celular.
<p...

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Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

Este protocolo descreve uma técnica para visualizar o comportamento do macrófago e a morte no zebrafish embrionário durante a infecção do marinum de Mycobacterium. Etapas para a preparação de bactérias, infecção dos embriões e microscopia intravital estão incluídas. Esta técnica pode ser aplicada à observação do comportamento celular e da morte em cenários semelhantes envolvendo infecção ou inflamação estéril.

Visualização da morte de células ticas de macrófago durante infecção micobacteriana em embriões de zebrafish via microscopia intravital

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...

Este protocolo pode claramente diferenciar os modos de morte celular macrófago durante a infecção micobacteriana. Observando múltiplos embriões em paralelo, aumenta muito a probabilidade de capturar todo o processo de morte celular macfago. Este protocolo também pode ser aplicado à observação da morte celular e outros comportamentos celulares em cenários semelhantes envolvendo infecção ou inflamação estéril.Durante a imagem ao vivo estendida, é muito importante manter a intensidade do laser o mais baixo possível para evitar fotobleaching e toxicidade. Após a inoculação de acordo com o manuscrito, centrifugar a cultura a 3000 vezes G por 10 minutos para coletar o Mycobacterium marinum como uma pelota. Descarte todos, exceto 300 microliters do supernante, e suspenda a pelota.Adicione três mililitros de meio 7H9 com 10% de glicerol para suspender ainda mais a pelota e, em seguida, sonicar a suspensão em um banho de água a 100 watts, com 15 segundos ligados e 15 segundos de desconto, por um total de dois minutos para conseguir uma única célula homogeneate. Transfira a suspensão bacteriana para uma seringa de 10 mililitros e passe por um filtro de cinco mícrons para remover qualquer aglomerado bacteriano. Usando um espectótmetro, meça a densidade óptica da suspensão e dilui-a com mídia 7H9 contendo 10% de glicerol a OD 600 em um.Divida a suspensão em 10 alíquotas de microliter e armazene no congelador negativo de 80 graus Celsius para uso posterior. Primeiro, aqueça a ága em um bloco de aquecimento de 95 graus Celsius até que esteja completamente derretido. Mantenha a agarose em forma líquida colocando-a em um bloco de aquecimento de 45 graus Celsius.Para montar para infecção intramuscular na região do tronco, crie a camada inferior de agarose derramando 0,5 mililitros de 1% de peso em volume agarose uniformemente em um escorregador de vidro. Coloque o slide em uma geladeira ou superfície fria por três minutos para solidificar. Depois de anestesiar os embriões de zebrafish, coloque até 60 embriões de zebrafish na camada inferior de agarose, e coloque-os cuidadosamente em duas linhas.Remova qualquer água restante na camada inferior de agarose com papel de tecido, antes de adicionar 0,3 mililitros de 0,5% de peso por volume agarose para criar a camada superior. Certifique-se de que os embriões estão completamente incorporados na agarose. Devolva o deslizamento de vidro para a geladeira novamente para solidificar a agarose.Mantenha a camada superior da agarose úmida cobrindo a superfície com água extra de ovo E3. Em seguida, ajuste o microinjetor e o micromanipulador à posição adequada e configuração para microinjeção. Transfira três microliters de cultura bacteriana preparada para a agulha preparada usando um microcarregador.Pipeta devagar e cuidadosamente para evitar formar bolhas de ar. Injete 100 UFC na região do tronco. Após a microinjeção, lave cuidadosamente os embriões de peixes-zebra em água de ovo fresco com uma pipeta plástica.Para montar para a infecção do cérebro médio, use uma pipeta plástica para transferir os quatro para seis embriões tricaine-anesthetizados para a ágarose. Posicione a cabeça de cada embrião para cima cuidadosamente com uma agulha de calibre 10. Uma vez que todas as posições dos embriões sejam fixas, transfira o deslizamento de vidro para uma geladeira ou superfície fria para deixar a agarose solidificar.Injete 500 UFC no cérebro médio. Após a microinjeção, lave cuidadosamente os embriões de zebrafish em água de ovo fresco com uma pipeta plástica. Uma vez que a agarose tenha se solidificado completamente, cubra a agarose com uma camada de água de ovo.Após a instalação da câmara ambiental, coloque o prato de fundo de vidro de 35 milímetros com o zebrafish na câmara ambiental. Abra o diodo 405, o argônio com 20% de potência e o laser DPSS 561 nanômetro. Configure a potência laser apropriada nas configurações do espectro.Escolha o modo de aquisição de varredura sequencial XYZ e defina o formato de imagens para 512 por 512 pixels. Mude para o modo de dados ao vivo, direja a posição do primeiro zebrafish e marque a posição Z de início e fim. Repita este processo para cada um dos embriões restantes.Adicione uma pausa no final do programa. Defina o loop e o ciclo do programa e salve o arquivo. Neste estudo, utilizamos coro1a transgênico relatado anteriormente:eGFP;lyzDsRed2, e mpeg1loxP transgênico;DsRed:loxPeGFP;lyz:eGFP, para distinguir os macrófagos e os neutrófilos in vivo.Um macrófago fortemente engorgado com bactérias tornou-se redondo e exibiu motilidade reduzida, com eventual inchaço citoplasmado, ruptura da membrana celular e rápida disseminação do conteúdo citoplasmado. Macrófagos irradiados por UV mostraram fenótipos típicos de células apoptóticas, como encolhimento celular, fragmentação nuclear e condensação de cromatina. Observou-se também que os macrófagos phacytos ativamente phagocytosed e disseminado M.merinum.No entanto, os neutrófilos tinham capacidade fagocítica limitada, e rapidamente sofreram morte celular lítica sem engorgement bacteriano óbvio. Combinado com poderosas ferramentas de edição de genes, este protocolo pode fornecer uma plataforma eficaz para entender melhor o efeito de uma variedade de fatores na interação host-pathogen in vivo.

Research

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Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

A visualização não-lítica exocitose de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; De macrófagos Usando Digital Microscopia de Luz

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualizando o macrófago armadilhas extracelular usando microscopia Confocal

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Ácidos graxos saturados induzir a morte celular de macrófagos associada a ceramida

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...