Name: visualization of macrophage lytic cell death during mycobacterial infection in zebrafish embryos via intravital microscopy
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy at JoVE.com

Agradecemos al Dr. Zilong Wen por compartir cepas de peces cebra, el Dr. Stefan Oehlers y el Dr. David Tobin por compartir los recursos relacionados con M. marinum, Yuepeng He por su asistencia en la preparación de figuras. Este trabajo fue apoyado por la National Natural Science Foundation of China (81801977) (B.Y.), el Programa de Formación Juvenil Sobresaliente de la Comisión Municipal de Salud de Shanghái (2018YQ54) (B.Y.), el Programa de Vela de Shanghái (18YF1420400) (B.Y.), y el Fondo Abierto de Shanghai Key Laboratory of Tuberculosis (2018KF02) (B.Y.).

El pez cebra se crió en condiciones estándar de acuerdo con las directrices de animales de laboratorio para la revisión ética del bienestar animal (GB/T 35823-2018). Todos los experimentos de pez cebra en este estudio fueron aprobados (2019-A016-01) y llevados a cabo en el Centro Clínico de Salud Pública de Shanghai, Universidad de Fudan.
1. Preparación del inóculo de célulaúnica M. marinum (Figura 1)
<ol><li>Descongelar el material de Glicero...

<ol>
	<li>Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+innate+immunity+by+Mycobacterium+tuberculosis:+is+death+an+exit+strategy.">Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).</li><li>Lamkanfi, M., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+host+cell+death+pathways+during+microbial+infections.">Manipulation of host cell death pathways during microbial infections.</a> Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. 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A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+host+defense:+new+insights+from+zebrafish.">Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).</li><li>Lesley, R., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+early+mycobacterial+pathogenesis+from+the+zebrafish.">Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish.</a> Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).</li><li>Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pathogenesis+of+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis.</a> Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).</li><li>Clay, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomous+role+of+the+macrophage+in+early+Mycobacterium+marinum+infection+of+the+zebrafish.">Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish.</a> Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).</li><li>Davis, J. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interception+of+host+angiogenic+signalling+limits+mycobacterial+growth.">Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth.</a> Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).</li><li>Kulms, D., Schwarz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+UV-induced+apoptosis.">Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis.</a> Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).</li><li>van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. 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A. 102 (8), 2778-2783 (2005).</li><li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+infection:+a+double-edged+sword+for+host+and+pathogen+survival.">Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival.</a> Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).</li><li>Traven, A., Naderer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+egress:+a+hitchhiker's+guide+to+freedom.">Microbial egress: a hitchhiker's guide to freedom.</a> PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).</li></ol>

Este protocolo describe la visualización de la muerte de macrófagos durante la infección micobacteriana. Basado en factores como la integridad de la membrana celular, la muerte celular impulsada por la infección se puede dividir en apoptosis y muerte celular lítica24,25. La muerte celular lítica es más estresante para el organismo que la apoptosis, porque desencadena una fuerte respuesta inflamatoria 24,...

Se ha demostrado que la infección micobacteriana causa la muerte de células inmunitarias del huésped1. Por ejemplo, una tensión atenuada desencadenará apoptosis en los macrófagos y contendrá la infección. Sin embargo, una cepa virulenta desencadenará la muerte de células líticas, causando diseminación bacteriana1,2. Teniendo en cuenta el impacto que estos diferentes tipos de muerte celular tienen en la respuesta antimicobacteriana del huésped, se necesita una observación detallada de la muerte de las células de macrófagos durante la infección micobacteriana in vivo.
Los métodos convencionales para medir la muerte celular son utilizar manchas de células muertas, como Annnexin V, TUNEL o acridina naranja/yoduro propidium manchado3,4,5. Sin embargo, estos métodos son incapaces de arrojar luz sobre el proceso dinámico de muerte celular in vivo. La observación de la muerte celular in vitro ya ha sido facilitada por imágenes en vivo6. Sin embargo, si los resultados imitan con precisión las condiciones fisiológicas sigue sin estar claro.
El pez cebra ha sido un excelente modelo para estudiar las respuestas anti-mycobacterium del huésped. Tiene un sistema inmunológico altamente conservado similar al de los seres humanos, un genoma fácilmente manipulado, y los embriones tempranos son transparentes, lo que permite imágenes en vivo7,8,9. Después de la infección con M. marinum, peces cebra adultos forman estructuras típicas de granuloma maduro, y peces cebra embrionarios forman granuloma temprano como estructuras9,10. El proceso dinámico de interacción inmune innata de células-bacterias ha sido explorado previamente en el pez cebra M. marinum infección modelo11,12. Sin embargo, debido al alto requisito de resolución espacio-temporal, los detalles que rodean la muerte de las células inmunitarias innatas permanecen en gran medida indefinidos.
Aquí describimos cómo visualizar el proceso de muerte celular lítica de macrófagos desencadenada por la infección micobacteriana in vivo. Este protocolo también se puede aplicar a la visualización del comportamiento celular in vivo durante el desarrollo y la inflamación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% OADC</td>
			<td>BD</td>
			<td>211886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;m filter</td>
			<td>Mille X</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#956;l/ml hygromycin</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H10</td>
			<td>BD</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9</td>
			<td>BD</td>
			<td>262310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A glass bottom 35 mm dish</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D35-10-0-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A60015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enviromental Chamber</td>
			<td>Pecon</td>
			<td>temp control 37-2 digital</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>No.5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Bioland Scientific LLC</td>
			<td>7105P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Keelrein</td>
			<td>PH-140(A)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M.marinum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATCC BAA-535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection needle</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>IB100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>msp12:cerulean</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 25470057; 27760340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single concavity glass microscope slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>SCICNTZ</td>
			<td>JY92-IIDN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (OD600)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>22331 Hamburg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>SZX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mfap4:eGFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 30742890</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 31278008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 27424497; 17477879</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of macrophage lytic cell death during mycobacterial infection in zebrafish embryos via intravital microscopy

Zebrafish es un excelente organismo modelo para estudiar el comportamiento innato de las células inmunitarias debido a su naturaleza transparente y la dependencia únicamente de su sistema inmunológico innato durante el desarrollo temprano. El modelo de infección de Zebrafish Mycobacterium marinum (M. marinum) ha estado bien establecido en el estudio de la respuesta inmune del huésped contra la infección micobacteriana. Se ha sugerido que diferentes tipos de muerte de células macróforas conducirán a los diversos resultados de la infección micobacteriana. Aquí describimos un protocolo que utiliza la microscopía intravital para observar la muerte celular de los macrófagos en embriones de pez cebra después de la infección por M. marinum. Las líneas transgénicas de pez cebra que etiquetan específicamente macrófagos y neutrófilos se infectan mediante microinyección intramuscular de M. marinum etiquetado fluorescentemente en el cerebro medio o en el tronco. Los embriones de pez cebra infectados se montan posteriormente en agarosa de baja fusión y se observan mediante microscopía confocal en dimensiones X-Y-Z-T. Debido a que las imágenes en vivo a largo plazo requieren el uso de baja potencia láser para evitar el fotoblanqueo y la fototoxicidad, se recomienda encarecidamente un transgénico que exprese fuertemente. Este protocolo facilita la visualización de los procesos dinámicos in vivo, incluyendo la migración de células inmunitarias, la interacción con patógenos del huésped y la muerte celular.

La infección por Mycobacterium puede desencadenar diferentes respuestas del huésped en función de las vías de la infección. En este protocolo, los embriones de pez cebra se infectan por microinyección intramuscular de bacterias etiquetadas fluorescentes en el cerebro medio o el tronco(Figura 3)y se observan mediante imágenes en vivo confocales. La infección a través de estas dos vías restringirá localmente la infección que causa el reclutamiento innato de células inmunitarias y ...

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Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

Este protocolo describe una técnica para visualizar el comportamiento de los macrófagos y la muerte en peces cebra embrionarios durante la infección por Mycobacterium marinum. Se incluyen medidas para la preparación de bacterias, infección de embriones y microscopía intravital. Esta técnica se puede aplicar a la observación del comportamiento celular y la muerte en escenarios similares que implican infección o inflamación estéril.

Visualización de la muerte de células líticas de macrófagos durante la infección micobacteriana en embriones de pez cebra a través de la microscopía intravital

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...

Este protocolo puede diferenciar claramente los modos de muerte celular de macrófagos durante la infección micobacteriana. Al observar múltiples embriones en paralelo, aumenta en gran medida la probabilidad de capturar todo el proceso de muerte celular lítica de macrófagos. Este protocolo también se puede aplicar a la observación de la muerte celular y otros comportamientos celulares en escenarios similares que implican infección o inflamación estéril.Durante la toma de imágenes en vivo extendida, es muy importante mantener la intensidad del láser lo más baja posible para evitar el fotoblanqueo y la toxicidad. Después de la inoculación según el manuscrito, centrifugar la cultura a 3000 veces G durante 10 minutos para recoger el Mycobacterium marinum como un pellet. Deseche todos los microlitros del sobrenadante y vuelva a suspender el pellet.Añadir tres mililitros de medio 7H9 con 10%glicerol para volver a suspender aún más el pellet, y luego sonicar la suspensión en un baño de agua a 100 vatios, con 15 segundos encendido y 15 segundos de descuento, durante un total de dos minutos para lograr un homogeneización de una sola célula. Transfiera la suspensión bacteriana a una jeringa de 10 mililitros y pase a través de un filtro de cinco micras para eliminar cualquier gruma bacteriana. Usando un espectrofotómetro, mida la densidad óptica de la suspensión y diluya con medios 7H9 que contengan 10% de glicerol a OD 600 a la vez.Divida la suspensión en 10 alícuotas de microlitros y guárdela en un congelador negativo de 80 grados Centígrados para su uso posterior. En primer lugar, calentar la agarosa en un bloque de calentamiento de 95 grados Celsius hasta que se derrita por completo. Mantener la agarosa en forma líquida colocándola en un bloque de calentamiento de 45 grados Celsius.Para montar para la infección intramuscular en la región del tronco, cree la capa de agarosa inferior vertiendo 0,5 mililitros de 1% de peso en volumen agarrose uniformemente en un portaobjetos de vidrio. Coloque la diapositiva sobre una nevera o una superficie fría durante tres minutos para solidificarse. Después de anestesiar los embriones de pez cebra, coloque hasta 60 embriones de pez cebra en la capa de agarosa inferior, y los coloque cuidadosamente en dos filas.Retire el agua restante en la capa de agarosa inferior con papel tisú, antes de agregar 0,3 mililitros de 0,5% de peso por volumen de agarosa para crear la capa superior. Asegúrese de que los embriones estén completamente incrustados en la agarosa. Vuelva a colocar el portaobjetos de vidrio en la nevera para solidificar la agarosa.Mantenga húmeda la capa superior de la agarosa cubriendo la superficie con agua de huevo E3 adicional. A continuación, ajuste el microinyector y el micromaniprógrafo a la posición y ajuste adecuados para la microinyección. Transfiera tres microlitros de cultivo bacteriano preparado a la aguja preparada utilizando un microcargador.Pipetear lentamente y cuidadosamente para evitar la formación de burbujas de aire. Inyecte 100 UFC en la región troncal. Después de la microinyección, enjuague cuidadosamente los embriones de peces cebra en agua fresca de óvulo con una pipeta de plástico.Para montar para la infección de cerebro medio, utilice una pipeta de plástico para transferir los cuatro a seis embriones anesthetizados con tricaína a la agarosa. Coloque la cabeza de cada embrión hacia arriba cuidadosamente con una aguja de calibre 10. Una vez que todas las posiciones de los embriones estén fijas, transfiera el portaobjetos de vidrio a una nevera o superficie fría para dejar que la agarosa se solidifique.Inyectar 500 UFC en el cerebro medio. Después de la microinyección, enjuague cuidadosamente los embriones de pez cebra en agua de huevo fresco con una pipeta de plástico. Una vez que la agarosa se haya solidificado por completo, cubra la agarosa con una capa de agua de huevo.Después de configurar la cámara ambiental, coloque el plato inferior de cristal de 35 milímetros con el pez cebra en la cámara ambiental. Abra el diodo 405, el argón a una potencia del 20% y el láser de nanómetro DPSS 561. Configure la potencia láser adecuada en los ajustes de espectro.Elija el modo de adquisición de escaneo secuencial XYZ y establezca el formato de imágenes en 512 por 512 píxeles. Cambie al modo de datos en vivo, apunte a la posición del primer pez cebra y marque la posición Z de inicio y fin. Repita este proceso para cada uno de los embriones restantes.Agregue una pausa al final del programa. Defina el bucle y el ciclo del programa y guarde el archivo. En este estudio, utilizamos previamente coro1a transgénica:eGFP;lyzDsRed2, y mpeg1loxP transgénico;DsRed:loxPeGFP;lyz:eGFP, para distinguir los macrófagos y los neutrófilos in vivo.Un macrófago fuertemente engordado con bacterias se volvió redondo y mostró una motilidad reducida, con hinchazón citoplasmática eventual, ruptura de la membrana celular y rápida diseminación del contenido citoplasmático. Los macrófagos irradiados por UV mostraron fenotipos típicos de células apoptóticas como la contracción celular, la fragmentación nuclear y la condensación de cromatina. También se observaron los macrófagos activamente fagocitosos y diseminados M.merinum.Sin embargo, los neutrófilos tenían una capacidad fagocítica limitada, y rápidamente se sometieron a muerte celular lítica sin engorgemento bacteriano obvio. Combinado con potentes herramientas de edición génica, este protocolo puede proporcionar una plataforma eficaz para comprender mejor el efecto de una variedad de factores en la interacción huésped-patógeno in vivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Microscopia intravital de los ganglios linfáticos inguinales

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Investigación

Inmunología e Infección

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Microscopia intravital del bazo: Análisis cuantitativo de la movilidad del parásito y el flujo sanguíneo

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

La infección de embriones de pez cebra con patógenos bacterianos intracelulares

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

La visualización de las respuestas inducidas por toxinas bacterianas mediante microscopía de fluorescencia de células en vivo

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Estudio de fagolisosoma Biogénesis en macrófagos en directo

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

La visualización no lítico exocitosis de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; De macrófagos Usando microscopía de luz digital

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Análisis de citometría de flujo de las células asesinas naturales lítico Actividad en sangre entera humana

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualización de macrófagos trampas extracelular mediante Microscopía Confocal

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Ácidos grasos saturados inducir muerte celular de macrófago asociado de ceramida

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...