Name: visualization of macrophage lytic cell death during mycobacterial infection in zebrafish embryos via intravital microscopy
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy at JoVE.com

Vi tackar Dr Zilong Wen för att dela zebrafiskar stammar, Dr Stefan Oehlers och Dr David Tobin för att dela M. Marinum relaterade resurser, yuepeng han för hjälp i figur förberedelse. Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (81801977) (B.Y.), den utestående ungdom utbildningsprogram för Shanghai Municipal Health Commission (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai segling program (18YF1420400) (B.Y.), och öppen fond av Shanghai Key Laboratory of tuberculosis (2018KF02) (B.Y.).

Zebrafish togs upp under standardbetingelser i enlighet med försöksdjurens riktlinjer för etisk granskning av djurens välbefinnande (GB/T 35823-2018). Alla zebrafiskar experiment i denna studie godkändes (2019-A016-01) och genomfördes på Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University.
1. M. Marinum Encellsinoculum beredning (figur 1)
<ol><li>Tina Cerulean-fluorescerande M. Marinum glycerol lager från-80 ° c och Inokulera en 7...

<ol>
	<li>Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+innate+immunity+by+Mycobacterium+tuberculosis:+is+death+an+exit+strategy.">Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).</li><li>Lamkanfi, M., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+host+cell+death+pathways+during+microbial+infections.">Manipulation of host cell death pathways during microbial infections.</a> Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Apoptosis+and+Necrosis+by+Annexin+V+Binding,+Propidium+Iodide+Uptake,+and+Flow+Cytometry.">Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+DNA+Fragmentation+in+Apoptotic+Cells+by+TUNEL.">Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).</li><li>Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Cell+Viability+with+Single-,+Dual-,+and+Multi-Staining+Methods+Using+Image+Cytometry.">Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).</li><li>Rathkey, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+visualization+of+gasdermin+D-driven+pyroptotic+cell+death.">Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).</li><li>Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+neutrophil+biology.">Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology.</a> Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).</li><li>Harvie, E. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+host+defense:+new+insights+from+zebrafish.">Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).</li><li>Lesley, R., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+early+mycobacterial+pathogenesis+from+the+zebrafish.">Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish.</a> Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).</li><li>Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pathogenesis+of+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis.</a> Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).</li><li>Clay, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomous+role+of+the+macrophage+in+early+Mycobacterium+marinum+infection+of+the+zebrafish.">Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish.</a> Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).</li><li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos.">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).</li><li>Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cells+moderate+inflammatory+progression+and+enhance+bacterial+containment+upon+pulmonary+challenge+with+Mycobacterium+tuberculosis.">cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis.</a> Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+plays+critical+role+during+Edwardsiella+piscicida+immersion+infection+in+zebrafish+larvae.">Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae.</a> Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nlrc3-like+is+required+for+microglia+maintenance+in+zebrafish.">Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Colonization+of+Developing+Zebrafish+Midbrain+Is+Promoted+by+Apoptotic+Neuron+and+Lysophosphatidylcholine.">Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine.</a> Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).</li><li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interception+of+host+angiogenic+signalling+limits+mycobacterial+growth.">Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth.</a> Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).</li><li>Kulms, D., Schwarz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+UV-induced+apoptosis.">Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis.</a> Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).</li><li>van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+apoptotic+cells+in+zebrafish.">Live imaging of apoptotic cells in zebrafish.</a> FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).</li><li>Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+changes+during+programmed+cell+deaths.">Plasma membrane changes during programmed cell deaths.</a> Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).</li><li>Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoplasmin+regulates+chromatin+condensation+during+apoptosis.">Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).</li><li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+infection:+a+double-edged+sword+for+host+and+pathogen+survival.">Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival.</a> Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).</li><li>Traven, A., Naderer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+egress:+a+hitchhiker's+guide+to+freedom.">Microbial egress: a hitchhiker's guide to freedom.</a> PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).</li></ol>

Detta protokoll beskriver visualiseringen av makrofagdöd under mycobakteriell infektion. Baserat på faktorer som integriteten av cellmembranet, infektion driven celldöd kan delas in i apoptos och lytisk celldöd24,25. Lytisk celldöd är mer stressande för organismen än apoptos, eftersom det utlöser en stark inflammatorisk reaktion 24,25. Observation av lytisk celldöd in vivo är svårt, på grund ...

Mycobakteriell infektion har visats orsaka värd immun cells död1. Till exempel, en försvagad stam kommer att utlösa apoptos i makrofager och innehåller infektionen. Emellertid, envirulent stam kommer att utlösa lytisk celldöd, orsakar bakteriespridning1,2. Med tanke på effekterna av dessa olika typer av celldöd har på värd anti-mycobakteriell respons, en detaljerad observation av makrofagcelldöd under mycobakteriell infektion in vivo behövs.
De konventionella metoderna för att mäta celldöd är att använda döda cell fläckar, såsom annnexin V, Tunel, eller akridin orange/propidium jodid färgning3,4,5. Emellertid, dessa metoder är oförmögna att belysa den dynamiska processen av celldöd in vivo. Observation av celldöd in vitro har redan underlättat av Live Imaging6. Men om resultaten exakt efterlikna fysiologiska förhållanden är fortfarande oklart.
Zebrafish har varit en utmärkt modell för att studera Host anti-Mycobacterium svar. Den har ett mycket bevarat immunförsvar som liknar det hos människor, en lätt manipulerad genom, och de tidiga embryona är transparenta, vilket möjliggör levande Imaging7,8,9. Efter infektion med M. Marinum, Adult zebrafiskar form typiska mogna granulom strukturer, och embryonala zebrafisk form tidigt granulom som strukturer9,10. Den dynamiska processen av medfödda immun cell-bakterier interaktion har undersökts tidigare i zebrafiskar M. Marinum infektion modell11,12. Men på grund av hög spatial-temporal upplösning krav, detaljerna kring Döden av de medfödda immuncellerna förblir i stort sett odefinierade.
Här beskriver vi hur man visualiserar processen för makrofaglytisk celldöd som utlöses av mycobakteriell infektion in vivo. Detta protokoll kan också tillämpas för att visualisera cellulära beteende in vivo under utveckling och inflammation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% OADC</td>
			<td>BD</td>
			<td>211886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;m filter</td>
			<td>Mille X</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#956;l/ml hygromycin</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H10</td>
			<td>BD</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9</td>
			<td>BD</td>
			<td>262310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A glass bottom 35 mm dish</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D35-10-0-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A60015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enviromental Chamber</td>
			<td>Pecon</td>
			<td>temp control 37-2 digital</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>No.5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Bioland Scientific LLC</td>
			<td>7105P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Keelrein</td>
			<td>PH-140(A)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M.marinum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATCC BAA-535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection needle</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>IB100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>msp12:cerulean</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 25470057; 27760340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single concavity glass microscope slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>SCICNTZ</td>
			<td>JY92-IIDN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (OD600)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>22331 Hamburg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>SZX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mfap4:eGFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 30742890</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 31278008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 27424497; 17477879</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of macrophage lytic cell death during mycobacterial infection in zebrafish embryos via intravital microscopy

Zebrafish är en utmärkt modellorganism för att studera medfödda immun cells beteenden på grund av dess transparenta natur och förlitar sig enbart på dess medfödda immunsystem under tidig utveckling. Den Zebrafish Mycobacterium Marinum (M. Marinum) infektion modell har varit väl etablerad i att studera värd immunsvar mot mycobakteriell infektion. Det har föreslagits att olika makrofage celldöd typer kommer att leda till de olika resultaten av mycobakteriell infektion. Här beskriver vi ett protokoll med intravital mikroskopi att iaktta makrofagcelldöd i zebrafiskar embryon efter M. Marinum infektion. Zebrafish transgena linjer som specifikt etikett makrofager och neutrofiler är infekterade via intramuskulär mikroinjektion av överföras märkt M. Marinum i antingen mellanhjärnan eller stammen. Infekterade zebrafiskar embryon därefter monteras på låg smältning Agreste och observeras av konfokalmikroskopi i X-Y-Z-T dimensioner. Eftersom långsiktig levande avbildning kräver användning av låg lasereffekt för att undvika foto blekning och fototoxicitet, en starkt uttryckt transgena rekommenderas starkt. Detta protokoll underlättar visualisering av de dynamiska processerna in vivo, inklusive immun cell migration, värd patogen interaktion, och celldöd.

Mycobacterium infektion kan utlösa olika värd svar baserat på vägarna av infektion. I detta protokoll är zebrafiskar embryon smittade av intramuskulär mikroinjektion av överföras märkta bakterier i mellanhjärnan eller bålen (figur 3) och observeras av konfokala Live Imaging. Infektion via dessa två vägar kommer att lokalt begränsa infektionen orsakar medfödda immunceller rekrytering och efterföljande celldöd.
Visualisera detaljerna i medfödda imm...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy at JoVE.com

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

Detta protokoll beskriver en teknik för att visualisera makrofagbeteende och död i embryonal zebrafisk under Mycobacterium Marinum infektion. Steg för beredning av bakterier, infektion av embryon, och intravital mikroskopi ingår. Denna teknik kan tillämpas på observation av cellulära beteende och dödsfall i liknande scenarier som involverar infektion eller steril inflammation.

Visualisering av makrofagen lytisk celldöd under Mycobakteriell infektion hos Zebrafish embryon via Intravital mikroskopi

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...

Detta protokoll kan tydligt skilja makrofag cell död lägen under mycobacterial infektion. Genom att observera flera embryon parallellt ökar det kraftigt sannolikheten för att fånga hela makrofaglytisk celldödsprocess. Detta protokoll kan också tillämpas på observation av celldöd och andra cellulära beteende i liknande scenarier som involverar infektion eller steril inflammation.Under den utökade liveavbildningen är det mycket viktigt att hålla laserns intensitet så låg som möjligt för att undvika fotoblekning och toxicitet. Efter inokulering enligt manuskriptet centrifuger kulturen vid 3000 gånger G i 10 minuter för att samla in Mycobacterium marinum som en pellet. Kasta alla utom 300 mikroliter av supernatanten och dra in pelleten igen.Tillsätt tre milliliter 7H9 medium med 10%glycerol för att ytterligare åter upphäva pelleten, och sedan sonikera suspensionen i ett vattenbad på 100 watt, med 15 sekunder på och 15 sekunder av, för totalt två minuter för att uppnå en enda cell homogenat. Överför bakteriedpensionen till en 10 milliliter spruta, och passera genom en fem mikron filter för att ta bort eventuella bakteriella klumpar. Med hjälp av en spektrofotometer, mäta den optiska densiteten av suspensionen, och späd den med 7H9 media som innehåller 10%glycerol till OD 600 vid ett.Dela upphängningen i 10 microliter alikvoter, och förvara vid negativ 80 grader Celsius frys för vidare användning. Värm först upp uppstod i ett 95 grader Celsius värmeblock tills det är helt smält. Underhåll agarosen i flytande form genom att placera den i ett 45 grader Celsius värmeblock.För att montera för intramuskulär infektion i bålen regionen, skapa botten agaros lagret genom att hälla 0,5 milliliter av 1%vikt i volym uppstod jämnt på ett glas slide. Placera bilden på en islåda eller kall yta i tre minuter för att stelna. Efter att ha sövt zebrafiskembryonen, placera upp till 60 zebrafiskembryon på botten agarosskiktet, och lägg ut dem försiktigt i två rader.Ta bort eventuellt återstående vatten på botten agarosskiktet med mjukpapper, innan du lägger till 0,3 milliliter på 0,5% volymvikt för att skapa det övre lagret. Se till att embryona är helt inbäddade i agaros. Återgå glaset glida till icebox igen för att stelna agaros.Håll det översta lagret av agaros fuktig genom att täcka ytan med extra E3 äggvatten. Därefter justera microinjector och micromanipulator till rätt läge och inställning för mikroinjektion. Överför tre mikroliter av beredd bakteriekultur i den förberedda nålen med hjälp av en mikroladdare.Pipett långsamt och försiktigt för att undvika att bilda luftbubblor. Injicera 100 CFU i stamregionen. Efter mikroinjektion spola försiktigt zebrafiskens embryona i färskt äggvatten med en plastpipett.För att montera för midbrain infektion, använd en plastpipett för att överföra de fyra till sex trikain-sövda embryon i agaros. Placera huvudet på varje embryo uppåt försiktigt med en 10-gauge nål. När alla embryon positioner är fast, överföra glaset glida till en islåda eller kall yta för att låta agaros stelna.Injicera 500 CFU i mellanhjärnan. Efter mikroinjektion spola försiktigt zebrafisk embryona i färskt äggvatten med en plastpipett. När agarosen har stelnat helt, täck agaros med ett lager av äggvatten.Efter att du har satt upp miljökammaren placerar du den 35 millimeters glasbottenskålen med zebrafisken i miljökammaren. Öppna 405 dioden, argon vid 20%power, och DPSS 561 nanometerlaser. Ställ in lämplig lasereffekt i spektruminställningar.Välj XYZ sekventiell scan förvärvsläge, och ange bilder format till 512 med 512 pixlar. Växla till livedataläge, rikta positionen för den första zebrafisken och markera positionen för begin och end Z. Upprepa denna process för vart och ett av de återstående embryona.Lägg till en paus i slutet av programmet. Definiera programmets loop och cykel, och spara filen. I denna studie, Vi utnyttjade tidigare rapporterade transgenic coro1a:eGFP;lyzDsRed2, och transgena mpeg1loxP;DsRed:loxPeGFP;lyz:eGFP, att skilja makrofager och neutrofiler i vivo.En macrophage kraftigt engorged med bakterier blev runda och visas nedsatt motilitet, med eventuella cytoplasmatisk svullnad, sprängning av cellmembranet och snabb spridning av cytoplasmatiska innehållet. UV-bestrålade makrofager visade typiska apoptotiska cell fenotyper såsom cell krympning, nukleära fragmentering och kromatin kondensation. Det observerades också de makrofager aktivt phagocytosed och spridas M.merinum.Neutrophils hade dock begränsad phagocytic förmåga, och snabbt genomgick lytic cell död utan uppenbara bakteriell engorgement. Kombinerat med kraftfulla genredigeringsverktyg kan detta protokoll ge en effektiv plattform för att ytterligare förstå effekten av en mängd faktorer på värd-patogen interaktion in vivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Intravital mikroskopi av inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital Mikroskopi av mjälte: Kvantitativ analys av Parasit Rörlighet och blodflöde

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Infektion av zebrafiskembryon med intracellulära mängden sjukdomsalstrande bakterier

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisering av bakterietoxin Inducerade svar Använda Live Mikroskopi Cell Fluorescens

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Mycket Lösta Intravital Randig-belysning Mikroskopi germinalcenter

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Studie av Phagolysosome biogenes i Live Makrofager

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualisera Icke lytisk Exocytos av<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; Från Makrofager Använda Digital Light mikroskopi

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flödescytometrisk analys av Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant helblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisera makrofag extracellulära fällor med konfokalmikroskopi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Mättade fettsyror inducerar Ceramide-associerade makrofag celldöd

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...