Name: visualization of macrophage lytic cell death during mycobacterial infection in zebrafish embryos via intravital microscopy
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy at JoVE.com

Biz zebra balığı suşları paylaşımı için Dr Zilong Wen teşekkür, Dr Stefan Oehlers ve Dr David Tobin M. marinum ilgili kaynakları paylaşmak için, Yuepeng He şekil hazırlanmasında yardım için. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81801977) (B.Y.), Şangay Belediye Sağlık Komisyonu Üstün Gençlik Eğitim Programı (2018YQ54) (B.Y.), Şangay Yelken Programı (18YF1420400) (B.Y.) ve Şangay Verem Anahtar Laboratuvarı Açık Fonu (2018KF02) (B.Y.Y.) tarafından desteklenmiştir.

Zebra balıkları, hayvan refahının etik olarak gözden geçirilmesi için laboratuvar hayvanı yönergelerine uygun olarak standart koşullar altında yetiştirilmiştir (GB/T 35823-2018). Bu çalışmadaki tüm zebra balığı deneyleri onaylandı (2019-A016-01) ve Fudan Üniversitesi Şangay Halk Sağlığı Klinik Merkezi'nde gerçekleştirildi.
1. M. marinum Tek Hücreli Inokül Hazırlama (Şekil 1)
<ol><li>-80 °C'den gelen eritme Cerulean-flor...

<ol>
	<li>Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+innate+immunity+by+Mycobacterium+tuberculosis:+is+death+an+exit+strategy.">Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).</li><li>Lamkanfi, M., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+host+cell+death+pathways+during+microbial+infections.">Manipulation of host cell death pathways during microbial infections.</a> Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Apoptosis+and+Necrosis+by+Annexin+V+Binding,+Propidium+Iodide+Uptake,+and+Flow+Cytometry.">Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+DNA+Fragmentation+in+Apoptotic+Cells+by+TUNEL.">Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).</li><li>Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Cell+Viability+with+Single-,+Dual-,+and+Multi-Staining+Methods+Using+Image+Cytometry.">Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).</li><li>Rathkey, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+visualization+of+gasdermin+D-driven+pyroptotic+cell+death.">Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).</li><li>Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+neutrophil+biology.">Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology.</a> Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).</li><li>Harvie, E. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+host+defense:+new+insights+from+zebrafish.">Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).</li><li>Lesley, R., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+early+mycobacterial+pathogenesis+from+the+zebrafish.">Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish.</a> Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).</li><li>Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pathogenesis+of+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis.</a> Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).</li><li>Clay, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomous+role+of+the+macrophage+in+early+Mycobacterium+marinum+infection+of+the+zebrafish.">Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish.</a> Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).</li><li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos.">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).</li><li>Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cells+moderate+inflammatory+progression+and+enhance+bacterial+containment+upon+pulmonary+challenge+with+Mycobacterium+tuberculosis.">cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis.</a> Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+plays+critical+role+during+Edwardsiella+piscicida+immersion+infection+in+zebrafish+larvae.">Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae.</a> Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nlrc3-like+is+required+for+microglia+maintenance+in+zebrafish.">Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Colonization+of+Developing+Zebrafish+Midbrain+Is+Promoted+by+Apoptotic+Neuron+and+Lysophosphatidylcholine.">Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine.</a> Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).</li><li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interception+of+host+angiogenic+signalling+limits+mycobacterial+growth.">Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth.</a> Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).</li><li>Kulms, D., Schwarz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+UV-induced+apoptosis.">Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis.</a> Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).</li><li>van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+apoptotic+cells+in+zebrafish.">Live imaging of apoptotic cells in zebrafish.</a> FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).</li><li>Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+changes+during+programmed+cell+deaths.">Plasma membrane changes during programmed cell deaths.</a> Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).</li><li>Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoplasmin+regulates+chromatin+condensation+during+apoptosis.">Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).</li><li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+infection:+a+double-edged+sword+for+host+and+pathogen+survival.">Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival.</a> Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).</li><li>Traven, A., Naderer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+egress:+a+hitchhiker's+guide+to+freedom.">Microbial egress: a hitchhiker's guide to freedom.</a> PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).</li></ol>

Bu protokol, mikobakteriyel enfeksiyon sırasında makrofaj ölüm görselleştirme açıklar. Hücre zarının bütünlüğü gibi faktörlere bağlı olarak, enfeksiyon apoptosis ve litik hücre ölümü24,25ayrılabilir. Litik hücre ölümü apoptoz daha organizma için daha stresli, güçlü bir inflamatuar yanıt tetikler çünkü 24,25. Yüksek mekansal-temporal çözünürlük, uygun konfokal mikr...

Mikobakteriyel enfeksiyon konak bağışıklık hücresi ölümüne neden olduğu gösterilmiştir1. Örneğin, zayıflatılmış bir suş makrofajlarda apoptosis tetikler ve enfeksiyon içerir. Ancak, öldürücü bir suş litik hücre ölümü tetikleyecek, bakteriyel yayılmasına neden1,2. Bu farklı hücre ölümü türlerinin konak anti-mikobakteriyel yanıt üzerindeki etkisi göz önüne alındığında, in vivo mikobakteriyel enfeksiyon sırasında makrofaj hücre ölümünün ayrıntılı bir gözlemine ihtiyaç vardır.
Hücre ölümünü ölçmek için geleneksel yöntemler ölü hücre lekeleri kullanmak için, Annnexin V gibi, TUNEL, veya acridine turuncu / propidium iyodür boyama3,4,5. Ancak, bu yöntemler in vivo hücre ölümü dinamik sürecine ışık tutmak mümkün değildir. Hücre ölümünün in vitro gözlemi zaten canlı görüntüleme6ile kolaylaştırılmıştır. Ancak, sonuçların fizyolojik koşulları doğru bir şekilde taklit edip etmediği belirsizliğini koruyor.
Zebra balığı konak anti-micobacterium yanıtları incelemek için mükemmel bir model olmuştur. Bu insanların benzer bir son derece korunmuş bağışıklık sistemi vardır, kolayca manipüle genom, ve erken embriyolar şeffaf, hangi canlı görüntüleme sağlar7,8,9. M. marinum enfeksiyonu ndan sonra, yetişkin zebra balıkları tipik olgun granülom yapıları oluşturur, ve embriyonik zebrabalık yapıları gibi erken granülom formu9,10. Doğuştan gelen bağışıklık hücre-bakteri etkileşiminin dinamik süreci daha önce zebra balığı M. marinum enfeksiyonu modeli11,12araştırılmıştır. Ancak, yüksek mekansal-zamansal çözünürlük gereksinimi nedeniyle, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin ölümü çevreleyen ayrıntılar büyük ölçüde tanımsız kalır.
Burada in vivo mikobakteriyel enfeksiyonun tetiklediği makrofaj litik hücre ölümü sürecini nasıl görselleştirebileceğimizi anlatıyoruz. Bu protokol aynı zamanda geliştirme ve inflamasyon sırasında in vivo hücresel davranışı görselleştirmek için de uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% OADC</td>
			<td>BD</td>
			<td>211886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;m filter</td>
			<td>Mille X</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#956;l/ml hygromycin</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H10</td>
			<td>BD</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9</td>
			<td>BD</td>
			<td>262310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A glass bottom 35 mm dish</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D35-10-0-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A60015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enviromental Chamber</td>
			<td>Pecon</td>
			<td>temp control 37-2 digital</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>No.5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Bioland Scientific LLC</td>
			<td>7105P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Keelrein</td>
			<td>PH-140(A)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M.marinum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATCC BAA-535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection needle</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>IB100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>msp12:cerulean</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 25470057; 27760340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single concavity glass microscope slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>SCICNTZ</td>
			<td>JY92-IIDN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (OD600)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>22331 Hamburg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>SZX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mfap4:eGFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 30742890</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 31278008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 27424497; 17477879</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of macrophage lytic cell death during mycobacterial infection in zebrafish embryos via intravital microscopy

Zebrabalığı, şeffaf doğası ve erken gelişim sırasında sadece doğuştan gelen bağışıklık sistemine güvenilmesi nedeniyle doğuştan gelen bağışıklık hücresi davranışını incelemek için mükemmel bir model organizmadır. Zebrafish Mycobacterium marinum (M. marinum)enfeksiyon modeli mikobakteriyel enfeksiyona karşı konak bağışıklık yanıtı çalışmada iyi kurulmuştur. Farklı makrofaj hücre ölüm türlerinin mikobakteriyel enfeksiyonun çeşitli sonuçlarına yol açacağı ileri sürülmüştür. Burada M. marinum enfeksiyonu sonrası zebra balığı embriyolarında makrofaj hücre ölümünü gözlemlemek için intravital mikroskopi kullanılarak yapılan bir protokolü açıklıyoruz. Özellikle makrofajlar ve nötrofiller etiket zebra balığı transgenik çizgiler orta beyin veya gövde de floresan M. marinum etiketli intramüsküler mikroenjeksiyon yoluyla enfekte. Enfekte zebra balığı embriyoları daha sonra düşük eriyen agarose üzerine monte edilir ve X-Y-Z-T boyutlarında konfokal mikroskopi ile gözlenir. Uzun süreli canlı görüntüleme fotobeyazrlama ve fototoksisite önlemek için düşük lazer gücü kullanarak gerektirir çünkü, güçlü bir transgenik ifade şiddetle tavsiye edilir. Bu protokol, immün hücre göçü, konak patojen etkileşimi ve hücre ölümü de dahil olmak üzere in vivo dinamik süreçlerin görselleştirilmesini kolaylaştırır.

Mycobacterium enfeksiyonu enfeksiyon yollarına göre farklı konak yanıtları tetikleyebilir. Bu protokolde zebra balığı embriyoları orta beyne veya gövdeye floresan etiketli bakterilerin intramüsküler mikroenjeksiyonuileenfekte olmuş ve konfokal canlı görüntüleme ile gözlenmiştir. Bu iki yol üzerinden enfeksiyon yerel doğuştan gelen bağışıklık hücresi işe ve sonraki hücre ölümüne neden enfeksiyon kısıtlar.
Doğuştan gelen bağış...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy at JoVE.com

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

Bu protokol, Mycobacterium marinum enfeksiyonu sırasında embriyonik zebra balığında makrofaj davranışını ve ölümü görselleştirmek için bir tekniği açıklamaktadır. Bakterilerin hazırlanması, embriyoların enfeksiyonu ve intravital mikroskopi için adımlar dahildir. Bu teknik, enfeksiyon veya steril inflamasyon içeren benzer senaryolarda hücresel davranış ve ölüm gözlem uygulanabilir.

İntravital Mikroskopi ile Zebrabalığı Embriyolarında Mikobakteriyel Enfeksiyon Sırasında Makrofaj Litik Hücre Ölümünün Görüntülenmesi

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...

Bu protokol, mikobakteriyel enfeksiyon sırasında makrofaj hücre ölüm modlarını açıkça ayırt edebilir. Paralel olarak birden fazla embriyo gözlemleyerek, büyük ölçüde tüm makrofaj litik hücre ölüm sürecinin yakalama olasılığını artırır. Bu protokol aynı zamanda enfeksiyon veya steril inflamasyon içeren benzer senaryolarda hücre ölümü ve diğer hücresel davranış gözlem uygulanabilir.Genişletilmiş canlı görüntüleme sırasında, fotobeyazrlama ve toksisite önlemek için mümkün olduğunca düşük lazer yoğunluğunu tutmak için çok önemlidir. El yazmasına göre aşılamadan sonra, mycobacterium marinum'u pelet olarak toplamak için kültürü 3000 kat G'de 10 dakika santrifüj edin. Supernatant'ın 300 mikrolitresi hariç hepsini atın ve peleti yeniden askıya alın.Pelet daha fazla yeniden askıya almak için% 10 gliserol ile 7H9 orta üç mililitre ekleyin, ve sonra 100 watt bir su banyosunda süspansiyon sonicate, ile 15 saniye ve 15 saniye kapalı, tek bir hücre homojen elde etmek için toplam iki dakika. Bakteriyel süspansiyonu 10 mililitrelik şırıngaya aktarın ve bakteri kümelerini çıkarmak için beş mikronluk bir filtreden geçirin. Bir spektrofotometre kullanarak, süspansiyon optik yoğunluğunu ölçmek ve 7H9 medya içeren seyreltmek 10% gliserol ile OD 600 bir.Süspansiyonu 10 mikrolitrelik aliquots'a bölün ve daha fazla kullanım için negatif 80 santigrat derecelik dondurucuda saklayın. İlk olarak, tamamen eriyene kadar 95 derece santigrat ısı blok agarose ısıtın. Agarose'u 45 santigrat derecelik bir ısıtma bloğuna yerleştirerek sıvı halde muhafaza edin.Gövde bölgesinde kas içi enfeksiyon için monte etmek için, bir cam slayt üzerine eşit hacim agarose hacim tarafından% 1 ağırlık 0,5 mililitre dökerek alt agarose tabakası oluşturun. Katılaşmak için kaydırağı bir buzluk veya soğuk yüzeye üç dakika yerleştirin. Zebra balığı embriyolarını uyuşturdıktan sonra, alt agarose tabakasına 60 zebra balığı embriyosu yerleştirin ve iki sıra halinde dikkatlice yerleştirin.Üst tabaka oluşturmak için hacim agarose tarafından 0.3% mililitre eklemeden önce, doku kağıt ile alt agarose tabakası üzerinde kalan su çıkarın. Embriyoların agarose'a tamamen gömülü olduğundan emin olun. Agarose katılaşmak için tekrar buzluk için cam slayt dönün.Ekstra E3 yumurta suyu ile yüzeyi kaplayarak agarose üst tabakası nemli tutun. Daha sonra, mikroenjektör ve mikromanipülörü uygun konuma ve mikroenjeksiyon için ayara ayarlayın. Hazırlanan bakteri kültürünün üç mikrolitresini mikroloader kullanarak hazırlanan iğneye aktarın.Pipet yavaş ve dikkatli hava kabarcıkları oluşturan önlemek için. Gövde bölgesine 100 CFU enjekte edin. Mikroenjeksiyondan sonra zebra balık embriyolarını plastik bir pipetle temiz yumurta suyuna dikkatlice temizleyin.Orta beyin enfeksiyonu için monte etmek için, agarose içine dört ila altı tricaine-anestezili embriyolar aktarmak için plastik bir pipet kullanın. Her embriyonun başını 10 kalibrelik bir iğneyle dikkatlice yukarı doğru yerleştirin. Tüm embriyo pozisyonları sabit olduktan sonra, agarose katılaşmak için bir buzkutusu veya soğuk yüzey için cam slayt aktarın.Orta beyne 500 CFU enjekte edin. Mikroenjeksiyondan sonra zebra balığı embriyolarını plastik bir pipetle temiz yumurta suyuna dikkatlice yıkayın. Bir kez agarose tamamen katılaşmış, yumurta suyu bir tabaka ile agarose kapağı.Çevre odası kurduktan sonra, çevre odasına zebra balığı ile 35 milimetrelik cam alt çanak yerleştirin. Açık 405 diyot, argon 20% güç, ve DPSS 561 nanometre lazer. Spektrum ayarlarında uygun lazer gücünü ayarlayın.XYZ sıralı tetkik edinme modunu seçin ve görüntü biçimini 512 x 512 piksel olarak ayarlayın. Canlı veri moduna geçin, ilk zebra balığının konumunu hedefleyin ve Z'nin başlangıç ve bitiş konumunu işaretleyin. Kalan embriyoların her biri için bu işlemi tekrarlayın.Programın sonuna bir duraklama ekleyin. Programın döngü ve döngüsünü tanımlayın ve dosyayı kaydedin. Bu çalışmada, makrofajları ve nötrofilleri vivo olarak ayırt etmek için daha önce rapor edilen transgenik coro1a:eGFP;lyzDsRed2 ve transgenik mpeg1loxP;DsRed:loxPeGFP;lyz:eGFP kullanılmıştır.Bir makrofaj ağır bakteri ile tıkanmış yuvarlak oldu ve azaltılmış hareketlilik görüntülenen, nihai sitoplazmik şişme ile, hücre zarının yırtılması, ve sitoplazmik içeriğin hızlı yayılması. UV ışınlanmış makrofajlar hücre büzülmesi, nükleer parçalanma ve kromatin yoğuşması gibi tipik apoptotik hücre fenotiplerini gösterdi. Ayrıca makrofajların aktif olarak fagositosi ve m.merinum yayıldığı gözlendi.Ancak, nötrofiller sınırlı fagositik yeteneği vardı, ve hızlı bir şekilde belirgin bakteriyel endolerde olmadan litik hücre ölümü yapıldı. Güçlü gen düzenleme araçları ile birlikte, bu protokol daha fazla vivo konak-patojen etkileşimi üzerinde çeşitli faktörlerin etkisini anlamak için etkili bir platform sağlayabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Kasık lenf düğüm intravital Mikroskopi

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Dalak intravital Mikroskopi: Parazit Mobilite ve Kan Akımının Kantitatif Analiz

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Canlı Hücre Floresan Mikroskopi kullanma Bakteriyel Toksin İsteyerek Yanıtların Görselleştirme

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Germinal Merkezleri derece Çözülmüş Intravital Çizgili-aydınlatma Mikroskopi

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Canlı Makrofagların içinde Phagolysosome Biogenesis&#39;den Çalışması

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Sigara litik Ekzositoz görselleştirme<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; Dijital Işık mikroskopi ile Makrofagların gelen

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Makrofaj hücre dışı tuzaklar Confocal mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Doymuş yağ asitleri Ceramide ilişkili makrofaj hücre ölümüne neden

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...