Name: combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales
Uploaded: 2020-11-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales at JoVE.com

نحن نعترف بمساعدة أنطوان فيدر مع إعداد موزع الروبوتية وسيناريو dispenser.py.

1. ظروف الثقافة البكتيرية
<ol><li>العمل تحت غطاء محرك تدفق لارينار، استخدم 100 ميكرولتر من مخزون من اليوزيموموناس الموسومة GFP KT2440 (1 × 107 مل-1،المخزنة في -80 درجة مئوية) لتطعيم 5 مل من لوريا-بيرتاني (LB) المتوسطة. احتضان في 30 درجة مئوية في حين تهتز في 250 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.<...

<ol>
	<li>Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+and+removal+of+pathogenic+bacteria+in+wastewater+percolating+through+porous+media:+a+review.">Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review.</a> Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).</li><li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues.">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li><li>Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processes+in+microbial+transport+in+the+natural+subsurface.">Processes in microbial transport in the natural subsurface.</a> Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).</li><li>Tufenkji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+microbial+transport+in+porous+media:+Traditional+approaches+and+recent+developments.">Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments.</a> Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).</li><li>Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+modelling+straining+of+Escherichia+coli+in+saturated+porous+media.">Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media.</a> Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).</li><li>Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+and+biogeochemistry+of+stream+biofilms.">The ecology and biogeochemistry of stream biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).</li><li>Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+biophysical+underpinnings+to+the+success+of+multispecies+biofilms+in+porous+environments.">Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments.</a> The ISME Journal. 1, (2019).</li><li>Carrel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+in+3D+porous+media:+Delineating+the+influence+of+the+pore+network+geometry,+flow+and+mass+transfer+on+biofilm+development.">Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development.</a> Water Research. 134, 280-291 (2018).</li><li>Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+hopping+and+trapping+in+porous+media.">Bacterial hopping and trapping in porous media.</a> Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).</li><li>Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trait-specific+dispersal+of+bacteria+in+heterogeneous+porous+environments:+from+pore+to+porous+medium+scale.">Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale.</a> Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).</li><li>Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+preferential+flow+paths+perpetuated+by+microbial+activity+in+the+soil+matrix?+A+review.">Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review.</a> Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).</li><li>Creppy, A., Cl&#233;ment, E., Douarche, C., D'Angelo, M. V., Auradou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+motility+on+the+transport+of+bacteria+populations+through+a+porous+medium.">Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium.</a> Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).</li><li>Camesano, T. A., Logan, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Fluid+Velocity+and+Cell+Concentration+on+the+Transport+of+Motile+and+Nonmotile+Bacteria+in+Porous+Media.">Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media.</a> Environmental Science &amp; Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).</li><li>Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+surface+characteristics+on+the+transport+of+multiple+Escherichia+coli+isolates+in+large+scale+columns+of+quartz+sand.">The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand.</a> Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).</li><li>Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+biofilm+on+bacterial+transport+and+deposition+in+porous+media.">Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media.</a> Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).</li><li>Long, T., Ford, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Transverse+Migration+of+Bacteria+by+Chemotaxis+in+a+Porous+T-Sensor.">Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor.</a> Environmental Science &amp; Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).</li><li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+Expanding+the+Frontiers+of+Microbial+Ecology.">Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology.</a> Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Digital+Video+Microscopy+for+Colloidal+Studies.">Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+determination+of+bacterial+abundance+in+lake+plankton+with+the+green+nucleic+acid+stain+SYTO+13.">Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13.</a> Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).</li></ol>

هنا نقترح طريقتين لدراسة نقل الميكروبات من خلال نظم مسامية على مستوى الخلية الواحدة والسكان. وفي حين أن دراسة ظواهر النقل باستخدام نمّام BTC قد وفرت رؤى قيّمة حول انتشار مسببات الأمراض أو الملوثات على نطاقات النظام الإيكولوجي، فإن الصعوبات التي تعترض المدى من التجارب المختبرية إلى الظروف ...

وقد دفعت أساسا الدراسات التي تهدف إلى فهم نقل الميكروبات عبر وسائل مسامية من المخاوف من التلوث1, انتقال المرض2 والعلاج الحيوي3. وفي هذا الصدد، تم التعامل مع البكتيريا في الغالب كجزيئات في نماذج النقل4، وقد تم تحديد عمليات مثل الترشيح أو الإجهاد أو تسوية الجاذبية أو إعادة التعبئة من الأغشية الحيوية كمحركات للاحتفاظ بالميكروبات أو نقلها5. ومع ذلك، فإن دراسة نقل البكتيريا عبر المناظر الطبيعية المسامية يمكن أن تطلعنا أيضًا على الاستراتيجيات البيئية التي تدعم نجاحها في هذه البيئات المعقدة. ومع ذلك، يتطلب هذا تجارب جديدة ونماذج رياضية تعمل على مستوى الخلية المفردة أو السكان أو المجتمع المحلي الميكروبي.
البيئات الطبيعية المسامية، مثل تلك الموجودة في منطقة ما هوة تحت الأرض من الجداول والأنهار، هي مستعمرة بكثافة من قبل مجتمعات متنوعة من الميكروبات التي تشكل بيو فيلم6. الأغشية الحيوية تشكل هياكل تعديل تدفق وبالتالي نقل وتشتت البكتيريا في المرحلة السائلة7,8. ويتوقف نقل البكتيريا على مقياس المسام على محدودية توافر المساحة في المصفوفة المسامية والتشتت المرتبط بالحركية، وقد يكون وسيلة فعالة لزيادة اللياقة البدنية الفردية من خلال تقليل المنافسة على الموارد في المناطق الأقل كثافة سكانية. ومن ناحية أخرى، يمكن أن تصل بكتيريا الضباب أيضا إلى مناطق أكثر عزلة من المصفوفة المسامية، وقد يوفر الاستكشاف الموسع لهذه المناطق فرصا إيكولوجية للسكان من الأراضي المُخرَسة10. في نطاقات مكانية أكبر، يحول نمو الغشاء الحيوي مسارات التدفق المؤدية أيضاً إلى انسداد (جزئي) للمسام، وبالتالي، إلى إنشاء ظروف تدفق أكثر قناة وغير متجانسة11. وهذا له عواقب على إمدادات المغذيات والقدرة على التشتت والتردد والمسافة. التدفق التفضيلي، على سبيل المثال، يمكن أن تولد ما يسمى "المسارات السريعة" والبكتيريا المتحركة يمكن أن تحقق سرعات أعلى من التدفق المحلي على طول هذه المسارات12. وهذه طريقة فعالة لزيادة استكشاف الموائل الجديدة.
مجموعة متنوعة من الأدوات الاستفادة من لدراسة نقل البكتيريا المتحركة وغير المتحركة (والجسيمات) في وسائل الإعلام المسامية. النماذج العددية لديها قدرات تنبؤية كبيرة مهمة للتطبيقات ، ولكن غالبا ما تكون محدودة من الافتراضات المتأصلة4. وقد قدمت التجارب على نطاق مختبر13،14 جنبا إلى جنب مع منحنى اختراق (BTC) النمذجة رؤى هامة في أهمية خصائص سطح الخلايا البكتيرية للكفاءة الشائكة15. وعادة ما يتم الحصول على الـ BTCs (أي سلسلة مرات تركيز الجسيمات في موقع ثابت) عن طريق إطلاقات ثابتة وقياس أرقام الخلايا عند تدفق الجهاز التجريبي. وفي هذا السياق، تعكس الـ BTCs ديناميات تشتت البكتيريا في المصفوفة المسامية ويمكن تمديدها بواسطة مصطلح بالوعة حسابي للمرفق. غير أن نمـي نمـيـة الـ BTCs وحدها لا تحل دور التنظيم المكاني للركيزة المسامية أو البيوفيلم لعمليات النقل. وقد ثبت أن أدوات المراقبة العيانية الأخرى مثل التشتت أو الترسبات تقدم معلومات هامة عن التوزيع المكاني أو الجسيمات المحتفظ بها أو المجتمعات المتنامية. Microfluidics هي التكنولوجيا التي تسمح لدراسة النقل في وسائل الإعلام المسامية عن طريق التحقيق المجهري9،12،16، وباستثناء العمل الأخير10، وعادة ما تكون مقيدة النظم التجريبية لمقياس طول واحد من القرار ، وهذا هو ، مقياس المسام أو مقياس الجهاز السائل بأكمله.
هنا، نقدم مجموعة من الطرق المشتركة لدراسة نقل البكتيريا المتحركة وغير المتحركة في المناظر الطبيعية المسامية على موازين مختلفة. نحن نجمع بين ملاحظات النقل البكتيري على مقياس المسام مع المعلومات على نطاق أوسع، عن طريق تحليل BTC. الأجهزة Microfluidic بنيت من الطباعة الحجرية لينة باستخدام polydimethylsiloxane (PDMS) هي متوافقة بيولوجيا، ومقاومة لمجموعة من المواد الكيميائية، والسماح للتكرار بتكلفة منخفضة وتوفير شفافية بصرية ممتازة، فضلا عن ضعف الفلوروسكينية الحيوية للمراقبة المجهرية. Microfluidics استنادا إلى PDMS وقد سبق استخدامها لدراسة نقل الميكروبات في قنوات بسيطة17 أو في هندستها أكثر تعقيدا12. ومع ذلك، تركز تجارب ميكروفليديس عادة على الآفاق قصيرة الأجل، وعادة ما تقتصر المراقبة المجهرية للغلاية الفلورية على السلالات المعدلة وراثيا (مثل السلالات الموسومة بـ GFP). هنا نقدم أدوات لدراسة النقل البكتيري باستخدام أجهزة microfluidic المستندة إلى PDMS في تركيبة مع أجهزة المجهر وأكبر ملفقة من بولي (ميثيل ميتكريلات) (PMMA، المعروف أيضا باسم زجاج شبكي) في تركيبة مع تدفق cytometry. يختلف نظام إدارة المواد البكترية (PDMS) وMMA في نفاذية الغاز وخصائص السطح، مما يوفر فرصًا تكميلية لدراسة النقل البكتيري. في حين أن الجهاز microfluidic يوفر بيئة أكثر سيطرة ، فإن الجهاز الأكبر يسمح بالتجارب على مدى فترات طويلة من الزمن أو باستخدام المجتمعات البكتيرية الطبيعية. يتم استخدام العد المجهري بدقة زمنية عالية في منطقة مخصصة للحصول على BTC في جهاز microfluidic المستند إلى PDMS. للحصول على عدد الخلايا لـ BTC النمذجة من الجهاز القائم على PMMA، ونحن نقدم موزع السائل الآلي الذاتي شيدت في تركيبة مع عملية استئصال الخلايا تدفق. في هذا الإعداد، تمر الخلايا الجهاز المائع ويتم الاستغناء عنها على التوالي في 96 لوحة جيدا. يتم تقييد دقة الوقت بواسطة الحد الأدنى من حجم التي يمكن الاستغناء عنها بدقة وبالتالي معدل التدفق المتوسط من خلال الجهاز fluidic. المثبت في الآبار يمنع النمو ويسهل تلطيخ الحمض النووي لتعداد تدفق التقلبات الخلوية في المصب. لمنع النمو البكتيري أثناء تجارب النقل نستخدم الحد الأدنى من المتوسط (يطلق عليه حاجز الحركة).
وبما أن البروتوكولات لإعداد الأجهزة المائعة على مختلف المقاييس متاحة بسهولة، فإننا لا نقدم سوى بإيجاز تقنيات إنتاج هذه الأجهزة والتركيز بدلاً من ذلك على الإجراءات التجريبية لتسجيل BTCs. وبالمثل، توجد إجراءات روتينية مختلفة للعدّة السيتومترية لتدفق الميكروبات، ويتطلب المستخدمون معرفة الخبراء لتفسير النتائج التي يتم الحصول عليها عن طريق عملية استئصال الانسياب. نحن الإبلاغ عن استخدام رواية الأجهزة microfluidic في تركيبة مع التصوير المجهري لتسجيل BTCs من الخلايا الموسومة الفلورسنت. وعند مقياس المسام، يتم الحصول على السرعات والمسارات المحلية عن طريق معالجة الصور. علاوة على ذلك، نبرهن على استخدام جهاز سائل قائم على PMMA بالاقتران مع العد السيتري للتدفق لمراقبة النقل البكتيري للخلايا الضغيرية وغير المتحركة في بيئات مسامية مستعمر من قبل بيو فيلم حيوي أصلي.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastomer Sylgard 184</td>
			<td>Dowsil</td>
			<td>101697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer NovoCyte</td>
			<td>Acea</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit</td>
			<td>makeblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axio Imager</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope AxioZoom v16</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 75 mm &#215; 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 3 peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma bonder Corona SB</td>
			<td>BlackHole Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump New Era NE 4000</td>
			<td>New Era</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF31SA universal milling machine</td>
			<td>Mikron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales

إن فهم نقل الكائنات الدقيقة وتشتتها وترسبها في وسائل الإعلام المسامية مهمة علمية معقدة تضم مواضيع متنوعة مثل الديناميكا المائية والإيكولوجيا والهندسة البيئية. إن نميجة النقل البكتيري في بيئات مسامية على نطاقات مكانية مختلفة أمر بالغ الأهمية للتنبؤ بشكل أفضل بعواقب النقل البكتيري، ومع ذلك فإن النماذج الحالية غالباً ما تفشل في الارتقاء من المختبر إلى الظروف الميدانية. هنا، نقدم أدوات تجريبية لدراسة النقل البكتيري في وسائل الإعلام المسامية على مقياسين مكانيين. والهدف من هذه الأدوات هو الحصول على الملاحظة العيانية (مثل منحنيات الاختراق أو ملامح الترسب) من البكتيريا المحقونة في مصفوفات مسامية شفافة. على نطاق صغير (10-1000 ميكرومتر)، يتم الجمع بين الأجهزة microfluidic مع البصرية البصرية مجهرية الفيديو ومعالجة الصور للحصول على منحنيات اختراق، وفي الوقت نفسه، لتتبع الخلايا البكتيرية الفردية على مقياس المسام. على نطاق أوسع، يتم الجمع بين قياس التدفق مع موزع الروبوتية عصامي للحصول على منحنيات اختراق. نحن نوضح فائدة هذه الأدوات لفهم أفضل لكيفية نقل البكتيريا في وسائل الإعلام المسامية المعقدة مثل منطقة hyporheic من تيارات. وبما أن هذه الأدوات توفر قياسات متزامنة عبر المقاييس، فإنها تمهد الطريق لنماذج قائمة على الآلية، وهي ذات أهمية حاسمة للارتقاء. وتطبيق هذه الأدوات قد لا يسهم في تطوير تطبيقات جديدة في مجال الإصلاح البيولوجي فحسب، بل قد يلقي أيضاً ضوءاً جديداً على الاستراتيجيات الإيكولوجية للكائنات المجهرية التي تستعمر الركائز المسامية.

لتوضيح وظيفة سير العمل المعروضة، قمنا بإجراء تجارب باستخدام الـ Pseudomonas المعدلة وراثياً، وهي بكتيريا الغرام المتحركة السلبية المهمة للعلاج الحيوي والتكنولوجيا الحيوية. وتتوافر تجاريا نسخ معدلة وراثيا من هذه السلالة التي تعبر عن إنتاج GFP. سلالة غير motile من P. putida K...

Watch this Scientific Journal Video about Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales at JoVE.com

Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

تعد منحنيات الاختراق (BTCs) أدوات فعالة لدراسة نقل البكتيريا في وسائل الإعلام المسامية. هنا نقدم الأدوات القائمة على الأجهزة المائعة في تركيبة مع المجهر والفرز تدفق cytometric للحصول على BTCs.

الجمع بين الأجهزة Fluidic مع المجهر والتدفق cytometry لدراسة النقل الميكروبي في وسائل الإعلام المسامية عبر المقاييس المكانية

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

دراسة نقل البكتيريا في نظم مسامية مهم فيما يتعلق بالتلوث، وانتشار الأمراض، والعلاج الحيوي. بالنسبة لهذه التجارب في النماذج الرياضية العاملة في الخلية الواحدة، يجب أن يكون السكان ومستوى المجتمع الميكروبي ضروريين. هنا نقدم أدوات لدراسة النقل البكتيري باستخدام الأجهزة المجهرية والمجهرية ، وكذلك الأجهزة الأكبر في تركيبة مع عملية استئصال الهواء.يوفر الجمع بين الأجهزة الدقيقة ذات القياس المجهري والتدفقية مجموعة من الإمكانيات لدراسة ظواهر النقل البكتيرية على نطاقات مكانية مختلفة. من أجل استكشاف هذا البروتوكول بشكل كامل ، يقترح أن يكون لديك خبرة سابقة في المجهر ، ومعالجة الصور الأساسية ، وتصميم الأجهزة microfluidic ، واتقان قياس التدفق. يصف هذا الفيديو طريقتين لدراسة النقل البكتيري على نطاقات مكانية مختلفة.تعتمد الطريقة الأولى ، القائمة على الأجهزة الدقيقة ، على المجهر لحساب الخلايا الفردية. ويمكن استخدام هذا النظام لدراسة النقل البكتيري عبر مقاييس مكانية متعددة من المسام إلى مقياس النظام المسامي بأكمله. أما الطريقة الثانية، التي تستخدم أجهزة سائلة أكبر حجماً مقرونة بالموزع الآلي وقياس التدفق، فيمكن استخدامها لدراسة ظاهرة النقل البكتيرية على نطاق نظم مسامية بالكامل.ويمكن أيضاً استخدام هذه الأساليب في دراسات العمود على نطاق المختبرات، فضلاً عن الدراسات الاستقصائية الميدانية الصغيرة. للبدء ، تصميم الهندسة المسامية المطلوبة التي تتكون من مصفوفة من الدوائر. بناء على الهندسة المختارة، وإعداد قالب باستخدام معيار SU-8 التصوير الضوئي.إعداد 50 غراما من PDMS عن طريق إضافة 90٪ من الداستومر إلى 10٪ من عامل علاج إلى 90٪ من الداستومر بالوزن في وعاء نظيف المتاح وخلط الكواشف اثنين مع أداة نظيفة. تطبيق فراغ 100 ملليبار لمدة 30 دقيقة لإزالة الهواء المذاب والفقاعات. ضع القالب في طبق بيتري وسكب PDMS على القالب إلى الارتفاع المطلوب بين اثنين وخمسة ملليمترات.غطي طبق بيتري بغطاء وأبقيه على حرارة 60 درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل. بعد ذلك، السماح للجهاز microfluidic لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. بمجرد تبريده ، قم بإزالة الجزء المطلوب من PDMS بعناية باستخدام مشرط.ختم مؤقتا الجزء السفلي من قناة PDMS مع الشريط. مع 0.5 ملليمتر قطرها اللكم، قنوات بيرس لإنشاء مدخل ومنفذ. قم بإزالة الشريط من قناة PDMS ووضع القناة مع الجانب المسامية التي تواجه لأعلى.علاج الشريحة الزجاجية وأسطح PDMS مع البلازما لمدة 45 ثانية لكل من درجة حرارة الغرفة. ضع قناة PDMS المعالجة مسبقًا على الشريحة الزجاجية المعالجة مسبقًا واسخني الحرارة عند 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على لوحة ساخنة ، ثم قم بإزالة الجهاز microfluidic من اللوحة الساخنة وتبريده إلى درجة حرارة الغرفة. تطبيق فراغ لمدة 30 دقيقة لإزالة الهواء من PDMS.لإنتاج قاعدة تحتوي على حجرة المسام، استخدم طحن دقيق عالي الدقة لإزالة 0.5 ملليمتر من طبقة PMMA الأساسية وطحن أخدود بحجم 1.1 في 1.1 ملليمتر للحلقة O المطاطية. حفر اثنين من الثقوب مترابطة لمدخل ومنفذ في الجزء العلوي من الجهاز fluidic و 12 ثقوب للمسامير. هذا بمثابة غطاء الجهاز السائل.بعد تنظيف الجهاز fluidic، المسمار القاعدة وغطاء معا باستخدام 12 الثقوب مترابطة. إزالة microfluidic من فراغ ووضعها على مرحلة المجهر. استخدام مضخة حقنة لتشبع مع العازلة الحركة.باستخدام المجهر برايتفيلد أو النقيض المرحلة، وضبط التكبير لتصور الخلايا البكتيرية الفردية والتركيز على مركز قناة المراقبة. قم بتبديل إعدادات مسار الضوء إلى المجهر الفلوري. اضبط التركيز من خلال الإزاحة ووقت تعرض الكاميرا لحل الخلايا البكتيرية الفردية.في هذه الحالة، 100 ميلي ثانية. بعد ذلك، أدخل أنابيب المدخل في أنبوب ملليلتر يحتوي على التعليق البكتيري. عكس اتجاه المضخة والبدء في سحب التعليق بمعدل تدفق من ميكرولتر واحد في الدقيقة الواحدة.مسح المقطع المقطع من قناة المراقبة بأكملها، وتسجيل صورة كل دقيقة. استيراد الصور إلى منصة البرمجيات المطلوبة. تسجيل الخلفية كمتوسط للصور الأولى عندما لم يتم تسجيل أي جسيمات.طرح الخلفية من كل صورة لإزالة الضوضاء الكاميرا والانحراف البصري. احصد الصور إلى منطقة ذات أهمية. تحديد قيمة عتبة تساوي كثافة بكسل الفلورانس الخلية بحيث تتضمن القيم الأكبر من العتبة الخلايا البكتيرية.استخدم معالجة الصور لطرح قيمة العتبة من كل صورة. Binarize الصورة الناتجة بحيث تأخذ الخلايا البكتيرية قيمة واحدة ، في حين أن الخلفية تأخذ قيمة صفر. إزالة مجموعات من بكسل مع مساحة أصغر من أصغر حجم الخلية البكتيرية في بكسل.جمع الصورة binarized للحصول على العدد الإجمالي للبكسل الكتل المتبقية. تقسيم عدد وحدات البكسل على متوسط حجم الخلية البكتيرية بالبكسل للحصول على تقدير لعدد الخلايا. تحويل العد إلى تركيز في الجسيمات لكل ملليلتر.لتحديد تركيز التعليق البكتيري المحقون ، قم بحقن التعليق البكتيري في قناة المراقبة لجهاز دقيق نظيف مع حقنة. سجل الصورة وحساب تركيز البكتيريا المؤثرة كما هو مبين سابقا. تصور اختراق المنحنيات عن طريق تطبيع تركيز البكتيريا السائلة C مع تركيز البكتيريا المؤثرة C0 والتآمر C على C0 مقابل الوقت.من أجل تحليل السرعات المحلية ومسارات البكتيريا المنقولة من خلال مصفوفة مسامية، نقل مرحلة المجهر إلى منطقة ذات أهمية وضبط التركيز على مركز الجهاز microfluidic. تعيين التكوين البصري على النقيض من المرحلة أو المجهر الفلوري. سجل الصور الفاصل الزمني ووقت التعرض قصيرة بما يكفي لالتقاط النزوح البكتيري.في هذه الحالة، 50 ميلي ثانية. تسجيل الصور على مدى فترة كافية من الوقت، على سبيل المثال ثلاث دقائق. لإزالة الضوضاء من كل صورة، اطرح الخلفية، والتي هي متوسط مجموع جميع الصور المسجلة.تحديد معامل التدرج العددي وتطبيعه بقيمته القصوى. البحث عن وتسجيل الإحداثيات البكتيرية ووقت الحصول على الصورة في ملف من ثلاثة أعمدة. إجراء تحليل تتبع الجسيمات لمعالجة البيانات المسجلة وحساب المسارات.للحصول على ملامح ترسب، تسجيل صورة مركبة للقناة كامل مسامية من قبل، وهذا هو الخلفية، وبعد حقن تعليق بكتيرية من خلال الجهاز microfluidic. إزالة الخلفية من الصور المسجلة بعد الحقن البكتيري. حساب ملف تعريف الترسب D كمجموع إشارة الفلورسينس البكتيرية على طول الأجزاء العرضية من طول x من القناة المسامية.تصور ملف تعريف الترسب كإشارة الفلورسنسي المحلية مقابل طول القناة المسامية. لإعداد موزع الآلي، ضع موزع الروبوتية على مقربة من الجهاز المائع. قم بتوصيل موزع الروبوتية بالكمبيوتر الذي يعمل على BCNC وحدد منفذ com الصحيح.في BCNC، انقر فوق زر الصفحة الرئيسية لإرجاع موزع الروبوتية إلى موضع المنزل. توصيل مضخة ال peristaltic مع مدخل باستخدام 50 سنتيمترا طويلة، واحد ملليمتر أنابيب القطر الداخلي، وتدفق مع موزع الآلي باستخدام نفس الأنابيب. ضخ المتوسطة زراعة من خلال الجهاز سائل.لاحظ وصول المتوسطة في أنابيب منفذ ثابت إلى موزع الروبوتية ووضع لوحة 96-well التي سوف تجمع تدفق. في الوقت نفسه، قم بتنشيط موزع الروبوتية وحقن التعليق البكتيري من خلال جهاز PMMA السائل بمعدل تدفق 0.2 ملليلتر في الدقيقة. حقن تعليق بكتيري يعادل عدة وحدات التخزين المسام.على سبيل المثال، 30 ضعف حجم الجهاز المائع. بعد الحقن ، والتحول إلى زراعة وسيطة معقم حتى نهاية التجربة. بمجرد الانتهاء من لوحة 96-well، قم بتغطية اللوحة وتخزينها عند أربع درجات مئوية حتى تحليل قياس تدفق التحاليل.تحليل العينات مع تدفق cytometry وتصور منحنيات اختراق عن طريق تطبيع تركيز البكتيريا السائلة C مع تركيز البكتيريا المؤثرة C0 والتآمر C على C0 مقابل الوقت. في هذه الدراسة، باستخدام كل من الكودين غير المتحركة الزائفة KT2440، أجريت تجارب متسلسلة في أجهزة microfluidic PDMS مع مجموعة عشوائية من الأعمدة. تظهر هنا منحنيات الاختراق التي تم تطبيعها إلى تركيز الخلايا المحقونة، وكذلك المسارات البكتيرية على مقياس المسام.كما أجريت تجارب على أجهزة سائلة واسعة النطاق مُضروب من PMMA. تم حقن الـ (موتيل) و(Pseudomonas) غير المتحركة (البيدا KT2440) في مصفوفة مسامية متباعدة بانتظام. ومن اللافت للنظر، في بيئة مسامية خالية من بيو فيلم، كشفي وغير مويل Pseudomonas وضعية KT2440 أظهرت سلوك النقل مختلفة بشكل ملحوظ على أساس منحنيات اختراق.في مصفوفة مسامية مستعمرة لمدة 48 ساعة مع مجتمع بيو فيلم تيار معقدة، اختفت هذه الاختلافات في منحنيات اختراق بين الضباب وغير موتي بسودوموناس putida KT2440. نحن نستخدم هذا النظام لدراسة النقل البكتيري في الجداول ، ولكن يمكن تعديل هذه الأدوات بسهولة لدراسة ظواهر النقل البكتيري في أنظمة أخرى هندسية وبيئية. ينقل البكتيريا عبر وسائل الإعلام المرطبة المسامية عمليات تغليف على نطاقات مكانية متعددة.تسمح المنهجية المقدمة هنا بربط النزوح المحلي للبكتيريا على مقياس المسام بالنقل المجهري في الوسط المسامي بأكمله.

Research

JoVE Journal

Environment

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Biochips فلويديك مع خلايا RTgill-W1 لرابيد تقييم عينات مياه الشرب لسمية إعداد واختبار المقاومة المستندة إلى

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

استخراج وتحليل الميكروبية الفوسفوليبيدية الأحماض الدهنية في التربة

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems (PEMS) for the Real-driving Emissions (RDE) Regulation in Europe

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems PEMS for the Real-driving Emissions RDE Regulation in Europe

تنفيذ الانبعاثات محمولة أجهزة القياس (PEMS) لتنظيم انبعاثات يقود ريال مدريد (RDE) في أوروبا

Vehicles are tested in controlled and relatively narrow laboratory conditions to determine their official emission values and reference fuel consumption. ...

Using Pharmacological Manipulation and High-precision Radio Telemetry to Study the Spatial Cognition in Free-ranging Animals

عن طريق التلاعب الدوائية وعالية الدقة راديو القياس عن بعد لدراسة الإدراك المكاني في الحيوانات الطليقة،

An animal&#39;s ability to perceive and learn about its environment plays a key role in many behavioral processes, including navigation, migration, ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

تشتت من المواد النانوية في الوسط المائي: نحو التحسين البروتوكول

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Microfluidic Devices for Characterizing Pore-scale Event Processes in Porous Media for Oil Recovery Applications

أجهزة موائع جزيئية لوصف العمليات المسام على نطاق الحدث في وسائل الإعلام المسامية لطلبات استرداد النفط

Microfluidic devices are versatile tools for studying transport processes at a microscopic scale. A demand exists for microfluidic devices that are ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

توصيف الأغشية الحيوية المائية مع التدفق الخلوي

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Metal Corrosion and the Efficiency of Corrosion Inhibitors in Less Conductive Media

تآكل المعادن وكفاءة مثبطات التآكل في وسائل الإعلام أقل موصلة

Material corrosion can be a limiting factor for different materials in many applications. Thus, it is necessary to better understand corrosion processes, ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

عزل وتحليل المجتمعات الميكروبية في التربة، رهيزوسفيري، وجذور في تجارب الأعشاب المعمرة

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Characterizing Microbiome Dynamics ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œ Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

تميز ميكروبيومي ديناميات – التدفق الخلوي على أساس مهام سير العمل من ثقافات نقية للمجتمعات الطبيعية

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...