Name: combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales
Uploaded: 2020-11-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales at JoVE.com

Vi anerkender hjælp fra Antoine Wiedmer med opsætningen af robotdispenseren og dispenser.py scriptet.

1. Bakterielle kultur betingelser
<ol><li>Ved arbejde under laminarflowhætte skal du bruge 100 μL glycerol-beholdning af GFP-mærket Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 ml-1, opbevares ved -80 °C) til at inokulere 5 ml Luria-Bertani (LB) medium. Inkuberes ved 30 °C, mens der rystes ved 250 omdrejningstal natten over.</li>
	<li>Den næste dag, resuspend 100 μL af natten kultur i 5 ml LB medium og inkuberes under de samme betingelser for 5h (eksponentiel fase). Prøve en 1 ml aliquot i...

<ol>
	<li>Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+and+removal+of+pathogenic+bacteria+in+wastewater+percolating+through+porous+media:+a+review.">Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review.</a> Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).</li><li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues.">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li><li>Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processes+in+microbial+transport+in+the+natural+subsurface.">Processes in microbial transport in the natural subsurface.</a> Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).</li><li>Tufenkji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+microbial+transport+in+porous+media:+Traditional+approaches+and+recent+developments.">Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments.</a> Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).</li><li>Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+modelling+straining+of+Escherichia+coli+in+saturated+porous+media.">Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media.</a> Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).</li><li>Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+and+biogeochemistry+of+stream+biofilms.">The ecology and biogeochemistry of stream biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).</li><li>Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+biophysical+underpinnings+to+the+success+of+multispecies+biofilms+in+porous+environments.">Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments.</a> The ISME Journal. 1, (2019).</li><li>Carrel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+in+3D+porous+media:+Delineating+the+influence+of+the+pore+network+geometry,+flow+and+mass+transfer+on+biofilm+development.">Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development.</a> Water Research. 134, 280-291 (2018).</li><li>Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+hopping+and+trapping+in+porous+media.">Bacterial hopping and trapping in porous media.</a> Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).</li><li>Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trait-specific+dispersal+of+bacteria+in+heterogeneous+porous+environments:+from+pore+to+porous+medium+scale.">Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale.</a> Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).</li><li>Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+preferential+flow+paths+perpetuated+by+microbial+activity+in+the+soil+matrix?+A+review.">Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review.</a> Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).</li><li>Creppy, A., Cl&#233;ment, E., Douarche, C., D'Angelo, M. V., Auradou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+motility+on+the+transport+of+bacteria+populations+through+a+porous+medium.">Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium.</a> Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).</li><li>Camesano, T. A., Logan, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Fluid+Velocity+and+Cell+Concentration+on+the+Transport+of+Motile+and+Nonmotile+Bacteria+in+Porous+Media.">Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media.</a> Environmental Science &amp; Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).</li><li>Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+surface+characteristics+on+the+transport+of+multiple+Escherichia+coli+isolates+in+large+scale+columns+of+quartz+sand.">The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand.</a> Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).</li><li>Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+biofilm+on+bacterial+transport+and+deposition+in+porous+media.">Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media.</a> Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).</li><li>Long, T., Ford, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Transverse+Migration+of+Bacteria+by+Chemotaxis+in+a+Porous+T-Sensor.">Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor.</a> Environmental Science &amp; Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).</li><li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+Expanding+the+Frontiers+of+Microbial+Ecology.">Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology.</a> Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Digital+Video+Microscopy+for+Colloidal+Studies.">Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+determination+of+bacterial+abundance+in+lake+plankton+with+the+green+nucleic+acid+stain+SYTO+13.">Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13.</a> Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).</li></ol>

Her foreslår vi to midler til at studere transport af mikrober gennem porøse systemer på encelle- og befolkningsniveau. Mens undersøgelsen af transportfænomener ved hjælp af BTC-modellering har givet værdifuld indsigt i spredningen af patogener eller forurenende stoffer i økosystemskalaerne, er der stadig vanskeligheder med at skalere fra laboratorieforsøg til feltforhold. De værktøjer, der er beskrevet her, gør det muligt for forskere at forsøge at løse de rumlige og tidsmæssige skalaer for bedre at forst...

Undersøgelser , der har til formål at forstå transport af mikrober gennem porøse medier , har hovedsagelig været drevet af bekymringerom forurening 1, overførsel af sygdom2 og bioremediering3. I denne forbindelse er bakterier for det meste blevet behandlet som partikler i transportmodeller4, og processer som filtrering, belastning, gravitationel bundfældning eller remobilisering fra biofilm er blevet identificeret som drivkræfter bag retention eller transport af mikrober5. Men at studere transport af bakterier gennem porøse landskaber kan også informere os om de økologiske strategier, der ligger til grund for deres succes i disse komplekse miljøer. Men dette kræver nye eksperimenter og matematiske modeller, der opererer på enkelt celle, befolkning eller mikrobielle samfund niveau.
Naturlige porøse miljøer, som dem, der findes i hyporheic zone af vandløb og floder, er tæt koloniseret af forskellige samfund af biofilm-dannende mikrober6. Biofilm danner strukturer, der ændrer strømmen og dermed transport og spredning af bakterier ivæskefasen 7,8. Transport af bakterier på pore skala afhænger af den begrænsede plads tilgængelighed i porøse matrix og motilitet-relaterede spredning kan være en effektiv måde at øge den individuelle fitness gennem reduceret konkurrence om ressourcer i mindre tæt befolkede områder. På den anden side kan motile bakterier også nå mere isolerede områder af den porøse matrix og den udvidede udforskning af sådanne områder kan give økologiske muligheder for at motile befolkninger10. På større rumlige skalaer, biofilm vækst afleder flow stier også fører til (delvis) tilstopning af porer og dermed til etablering af endnu mere kanaliseret og heterogene flow betingelser11. Dette har konsekvenser for næringsstofforsyningen og spredningskapaciteten, hyppigheden og afstanden. Præferenceflow, for eksempel, kan generere såkaldte "fast-tracks" og motile bakterier kan opnå endnu højere hastigheder end det lokale flow langs disse spor12. Dette er en effektiv måde at øge udforskningen af nye levesteder på.
En række værktøjer benytter sig til undersøgelse af transport af motile og ikke-motile bakterier (og partikler) i porøse medier. Numeriske modeller har stor prædiktiv kapacitet, der er vigtig for anvendelser, men er ofte begrænset af iboende antagelser4. Laboratorieskalaforsøg13,14 kombineretmed btc-modellering (Breakthrough Curve) har givet vigtig indsigt i vigtigheden af bakteriecelleoverfladeegenskaber for at sætte effektivitet15. Typisk opnås BPC'er (dvs. tidsserier af partikelkoncentration på et fast sted) via konstant hastighedsudsætninger og måling af cellenumre ved udstrømningen af forsøgsanordningen. I denne sammenhæng afspejler BFC'erne bakterienes advection-dispersiondynamik i den porøse matrix og kan forlænges med en vask, der tegner sig for vedhæftet fil. Modellering af BFC alene løser imidlertid ikke den rolle, som den porøse substrat eller biofilm spiller for transportprocesser. Andre makroskopiske observerbare som dispersivitet eller deposition profiler har vist sig at give vigtige oplysninger om den rumlige fordeling eller de tilbageholdte partikler eller voksende samfund. Microfluidics er en teknologi, der gør det muligt at studere transport i porøse medier ved mikroskopi undersøgelse9,12,16, og bortset fra en nylig arbejde10, eksperimentelle systemer er typisk begrænset til en enkelt længde skala af opløsning, det vil sige pore skala eller hele flydende enhed skala.
Her introducerer vi en række kombinerede metoder til at studere transport af motile og ikke-motile bakterier i porøse landskaber i forskellige skalaer. Vi kombinerer observationer af bakterietransport i poreskalaen med oplysninger i større skala ved hjælp af BTC-analyse. Mikrofluidiske enheder, der er bygget af blød litografi ved hjælp af polydimethylsiloxan (PDMS), er biokompatible, modstandsdygtige over for en række kemikalier, tillader replicerbarhed med lave omkostninger og giver fremragende optisk gennemsigtighed samt lav autofluorescens, der er kritisk for mikroskopisk observation. Mikrofluidics baseret på PDMS er tidligere blevet brugt til at studere transport af mikrober i simplekanaler 17 eller i mere komplekse geometrier12. Men typisk microfluidcs eksperimenter fokuserer på kortsigtede horisonter og epi-fluorescens mikroskopisk observation af levende celler er almindeligvis begrænset til genetisk modificerede stammer (f.eks GFP-mærkede stammer). Her præsenterer vi værktøjer til at studere bakteriel transport ved hjælp af PDMS-baserede mikrofluidiske enheder i kombination med mikroskopi og større enheder fremstillet af poly (methyl methacrylat) (PMMA, også kendt som plexiglas) i kombination med flowcytometri. PDMS og PMMA adskiller sig med hensyn til gaspermeabilitet og overfladeegenskaber, hvilket giver komplementære muligheder for at studere bakterietransport. Mens den mikrofluidiske enhed giver et mere kontrolleret miljø, giver den større enhed mulighed for eksperimenter over længere tid eller ved hjælp af naturlige bakteriesamfund. Mikroskopitælling ved høj tidsopløsning i et dedikeret område bruges til at opnå BTC i den PDMS-baserede mikrofluidiske enhed. For at opnå celletal for BTC-modellering fra den PMMA-baserede enhed introducerer vi en selvkonstrueret automatiseret væskedispenser i kombination med flowcytometri. I denne opsætning passerer celler den flydende enhed og udleveres fortløbende i 96 brøndplader. Den tidsmæssige opløsning begrænses af den mindste volumen, der præcist kan dispenseres og dermed den mellemstore strømningshastighed gennem den flydende enhed. Fiksativ i brøndene forhindrer vækst og letter DNA farvning for downstream flow-cytometrisk optælling. For at forhindre bakterievækst under transportforsøg bruger vi en minimal medium (termed motility buffer).
Da protokoller til fremstilling af flydende anordninger i forskellige skalaer er let tilgængelige, introducerer vi kun kortvarigt teknikkerne til fremstilling af sådanne anordninger og fokuserer snarere på de eksperimentelle procedurer for registrering af BPC'er. Tilsvarende findes der forskellige rutiner for flow cytometrisk optælling af mikrober, og brugerne kræver ekspertviden til at fortolke resultater opnået ved flowcytometri. Vi rapporterer den nye brug af mikrofluidiske enheder i kombination med mikroskopisk billeddannelse til at registrere BTC'er af fluorescerende mærkede celler. På poreskalaen opnås lokale hastigheder og baner ved hjælp af billedbehandling. Desuden demonstrerer vi brugen af en PMMA-baseret fluidic enhed i kombination med flow-cytometrisk optælling for at observere bakteriel transport af motile og ikke-motile celler i porøse miljøer koloniseret af en indfødt stream biofilm.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastomer Sylgard 184</td>
			<td>Dowsil</td>
			<td>101697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer NovoCyte</td>
			<td>Acea</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit</td>
			<td>makeblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axio Imager</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope AxioZoom v16</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 75 mm &#215; 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 3 peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma bonder Corona SB</td>
			<td>BlackHole Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump New Era NE 4000</td>
			<td>New Era</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF31SA universal milling machine</td>
			<td>Mikron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales

Forståelse af transport, spredning og deposition af mikroorganismer i porøse medier er en kompleks videnskabelig opgave, der omfatter emner så forskellige som hydrodynamik, økologi og miljøteknik. Modellering bakteriel transport i porøse miljøer på forskellige rumlige skalaer er afgørende for bedre at forudsige konsekvenserne af bakteriel transport, men nuværende modeller ofte undlader at op-skala fra laboratorium til feltbetingelser. Her introducerer vi eksperimentelle værktøjer til at studere bakteriel transport i porøse medier på to rumlige skalaer. Formålet med disse værktøjer er at opnå makroskopiske observerbare stoffer (såsom gennembrud kurver eller deposition profiler) af bakterier injiceres i gennemsigtige porøse matricer. I lille skala (10-1000 μm) kombineres mikrofluidiske enheder med optisk videomikroskopi og billedbehandling for at opnå gennembrudskurver og samtidig spore individuelle bakterieceller i poreskalaen. I større skala kombineres flowcytometri med en selvskabt robotdispenser for at opnå gennembrudskurver. Vi illustrerer nytten af disse værktøjer til bedre at forstå, hvordan bakterier transporteres i komplekse porøse medier såsom hyporheic zone af vandløb. Da disse værktøjer giver samtidige målinger på tværs af skalaer, baner de vejen for mekanismebaserede modeller, hvilket er af afgørende betydning for opskalering. Anvendelsen af disse værktøjer kan ikke kun bidrage til udviklingen af nye bioremedieringsapplikationer, men også kaste nyt lys over mikroorganismers økologiske strategier for kolonisering af porøse substrater.

For at illustrere funktionaliteten af den præsenterede arbejdsgang udførte vi eksperimenter ved hjælp af genetisk modificerede Pseudomonas putida KT2440, en gram negativ motile bakterie, der er vigtig for bioremediering og bioteknologi. Genetisk modificerede versioner af denne stamme, der udtrykker GFP produktion er kommercielt tilgængelige. En ikke-motile stamme af P. putida KT2440, som mangler de relevante strukturelle og lovgivningsmæssige gener for motilitet er ...

Watch this Scientific Journal Video about Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales at JoVE.com

Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

Banebrydende kurver (BPC'er) er effektive værktøjer til at studere transport af bakterier i porøse medier. Her introducerer vi værktøjer baseret på flydende enheder i kombination med mikroskopi og flow cytometrisk optælling for at opnå BPC'er.

Kombinere fluidic enheder med mikroskopi og flow cytometri at studere mikrobiel transport i porøse medier på tværs af rumlige skalaer

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

Undersøgelse af transport af bakterier i porøse systemer er vigtigt med hensyn til forurening, spredning af sygdom, og bioremediering. For disse eksperimenter i matematiske modeller, der opererer på den enkelte celle, befolkningen og det mikrobielle samfund niveau er påkrævet. Her præsenterer vi værktøjer til at studere bakteriel transport ved hjælp af mikrofluidiske enheder og mikroskopi, samt større enheder i kombination med flow cytometri.Kombinationen af mikrofluidiske enheder med mikroskopi og flowcytometri giver en række muligheder for at studere bakterielle transportfænomener i forskellige rumlige skalaer. For fuldt ud at udforske denne protokol, foreslås det at have tidligere erfaring med mikroskopi, grundlæggende billedbehandling, designe mikrofluidiske enheder, og mastering flow cytometri. Denne video beskriver to metoder til at studere bakteriel transport på forskellige rumlige skalaer.Den første metode, baseret på mikrofluidiske enheder, er afhængig af mikroskopi til at tælle de enkelte celler. Dette system kan bruges til at studere bakteriel transport på tværs af flere rumlige skalaer fra pore til hele porøse systemskala. Den anden metode, ved hjælp af større flydende enheder koblet til en automatiseret dispenser og flow cytometri, kan bruges til at studere bakteriel transport fænomen på skalaen af hele porøse systemer.Sådanne metoder kan også anvendes i laboratorieundersøgelser af søjler samt små feltundersøgelser. Til at begynde, designe den ønskede porøse geometri, der består af en matrix af cirkler. Baseret på den valgte geometri, forberede en støbeform ved hjælp af standard SU-8 fotolitografi.Forbered 50 gram PDMS ved at tilsætte 90% af elastomer til 10% af hærdningsmiddel til 90% af elastomer efter vægt i en ren engangsbeholder og bland de to reagenser med et rent værktøj. Påfør et vakuum på 100 millibar i 30 minutter for at fjerne opløst luft og bobler. Placer formen i en petriskål og hæld PDMS på formen til den ønskede højde mellem to og fem millimeter.Dæk petriskålen med et låg og hold den ved 60 grader Celsius i mindst fire timer. Derefter skal mikrofluidisk enheden køle af til stuetemperatur. Når det er afkølet, forsigtigt fjerne den ønskede del af PDMS med en skalpel.Forsegl midlertidigt bunden af PDMS-kanalen med tape. Med en 0,5 millimeter diameter puncher, gennembore kanaler for at skabe en indløb og en stikkontakt. Fjern båndet fra PDMS-kanalen, og placer kanalen med den porøse side opad.Behandl glasrutsjebanen og PDMS-overfladerne med plasma i ca. 45 sekunder hver ved stuetemperatur. Placer den forbehandlede PDMS-kanal på den forbehandlede glasrutsjebane og varm ved 100 grader Celsius i 30 minutter på en kogeplade, fjern derefter den mikrofluidiske anordning fra kogepladen og afkøles til stuetemperatur. Påfør vakuum i 30 minutter for at fjerne luft fra PDMS.For at producere basen, der indeholder porerummet, skal du bruge højpræcisionsmikrofræsning til at fjerne 0,5 millimeter fra det grundlæggende PMMA-lag og fræse en rille på størrelse med 1,1 gange 1,1 millimeter for en O-ring af gummi. Bor to gevindhuller til et indløb og udløb i den øverste del af den flydende enhed og 12 huller til skruer. Dette fungerer som låget af den flydende enhed.Efter rengøring af den flydende enhed skrues basen og låget sammen ved hjælp af de 12 gevindhuller. Fjern mikrofluidic fra vakuum og læg den på mikroskopet fase. Brug sprøjtepumpen til at mætte den med motilitetsbufferen.Ved hjælp af Brightfield mikroskopi eller fase kontrast, justere forstørrelsen til at visualisere de enkelte bakterieceller og fokusere på midten af observationskanalen. Skift indstillingerne for lysstien til fluorescensmikroskopi. Juster fokus gennem en forskydning og kameraets eksponeringstid for at løse individuelle bakterieceller.I dette tilfælde 100 millisekunder. Dernæst sættes indløbsslangen i et to milliliterrør, der indeholder bakterieaffjedringen. Vend pumperetningen om, og begynd at trække affjedringen tilbage med en strømningshastighed på en mikroliter pr. minut.Scan tværsnittet af hele observationskanalen og opstå et billede hvert minut. Importér billeder til en ønsket softwareplatform. Optag baggrunden som gennemsnittet af de første billeder, når der ikke er optaget partikler.Træk baggrunden fra hvert billede for at fjerne kamerastøj og optisk afvigelse. Beskære billederne til et område af interesse. Identificer en tærskelværdi svarende til cellefluorescenspixelintensiteten, så værdier, der er større end tærsklen, omfatter bakterieceller.Brug billedbehandling til at trække tærskelværdien fra hvert billede. Binarize det resulterende billede, så bakterieceller tage en værdi af en, mens baggrunden tager en værdi på nul. Fjern pixelklynger med et område, der er mindre end den mindste bakteriecellestørrelse i pixel.Summer det binariserede billede for at hente det samlede antal pixel i de resterende klynger. Divider antallet af pixel med den gennemsnitlige størrelse af en bakteriecelle i pixel for at opnå et estimat over antallet af celler. Omdan tællingerne til koncentration i partikler pr. milliliter.For at identificere koncentrationen af den injicerede bakteriel suspension skal bakteriesuspensionen injiceres i observationskanalen for en ren mikrofluidisk enhed med en sprøjte. Optag billedet og beregne den influent bakterielle koncentration som tidligere vist. Visualiser gennembrudskurver ved at normalisere spildevandets bakteriekoncentration C med den influente bakteriekoncentration C0 og afbilde C over C0 versus tid.For at analysere de lokale hastigheder og baner af bakterier transporteres gennem den porøse matrix, flytte mikroskop fase til en region af interesse og justere fokus til centrum af den mikrofluidiske enhed. Indstil den optiske konfiguration til fasekontrast eller fluorescensmikroskopi. Optag time-lapse billeder og en eksponeringstid kort nok til at fange bakteriel forskydning.I dette tilfælde 50 millisekunder. Optag billeder over en tilstrækkelig tid, f.eks. Hvis du vil fjerne støj fra hvert billede, skal du trække baggrunden fra, hvilket er gennemsnittet af summen af alle optagede billeder.Bestem modulus af den numeriske gradient og normalisere det med sin maksimale værdi. Find og optag bakteriekoordinater og tidspunktet for erhvervelse af billeder i en fil med tre kolonner. Udfør partikelsporingsanalyse for at behandle de registrerede data og beregne forløbene.For at opnå deposition profiler, optage et sammensat billede af hele porøse kanal før, det er baggrunden, og efter injektion af bakteriel suspension gennem mikrofluidic enhed. Fjern baggrunden fra de billeder, der er optaget efter bakteriel injektion. Beregn depositionsprofilen D som summen af det bakterielle fluorescenssignal langs tværgående dele af længden x af den porøse kanal.Visualiser aflejringsprofilen som det lokale fluorescenssignal i forhold til den porøse kanallængde. For at opsætte den automatiske dispenser skal robotdispenseren være tæt på den flydende enhed. Tilslut robotdispenseren til den computer, der kører BCNC, og identificer den korrekte com-port.I BCNC skal du klikke på startknappen for at få robotdispenseren tilbage til startpositionen. Tilslut peristaltiske pumpe med indløbet ved hjælp af 50 centimeter lang, en millimeter indvendig diameter slange, og udstrømningen med den automatiserede dispenser ved hjælp af samme slange. Pumpe dyrkning medium gennem den flydende enhed.Bemærk ankomsten af medium ved udløbsslangen fastgjort til robotdispenseren og placer en 96-brøndplade, som vil indsamle udstrømningen. Samtidig aktiveres robotdispenseren, og bakteriesuspensionen injiceres gennem PMMA-væskeapparatet med en strømningshastighed på 0,2 milliliter i minuttet. Injicer bakteriel suspension svarende til flere pore mængder.For eksempel 30 gange mængden af den flydende enhed. Efter injektion skiftes til sterilt dyrkningsmedium indtil afslutningen af forsøget. Når en 96-brønd plade er afsluttet, dække pladen og opbevares ved fire grader Celsius indtil flow cytometri analyse.Analysér prøver med flowcytometri og visualiser gennembrudskurver ved at normalisere spildevandets bakteriekoncentration C med den influente bakteriekoncentration C0 og plotte C over C0 versus tid. I denne undersøgelse, ved hjælp af både motile og ikke-motile Pseudomonas putida KT2440, sekventielle eksperimenter blev udført i PDMS mikrofluidic enheder med en tilfældig vifte af søjler. Gennembrud kurver normaliseret til koncentrationen af injicerede celler, samt bakterielle baner på pore skalaen er vist her.Der blev også udført eksperimenter med store flydende enheder sleben fra PMMA. Motile og ikke-motile Pseudomonas putida KT2440 blev injiceret i en regelmæssigt afstand porøs matrix. Påfaldende, i et porøst miljø blottet for biofilm, motile og ikke-motile Pseudomonas putida KT2440 viste en markant anderledes transport adfærd baseret på gennembrud kurver.I en porøs matrix koloniseret i 48 timer med en kompleks strøm biofilm samfund, disse forskelle i gennembrud kurver mellem motile og ikke-motile Pseudomonas putida KT2440 forsvandt. Vi bruger dette system til at studere bakteriel transport i vandløbene, men disse værktøjer kan let justeres til at studere bakterielle transportfænomener i andre manipulerede og miljømæssige systemer. Bakteriel transport gennem hydreret porøse medier indkapsler processer over flere rumlige skalaer.Den her præsenterede metode gør det muligt at forbinde den lokale forskydning af bakterier i poreskalaen med den mikroskopiske transport på hele det porøse medium.

Research

JoVE Journal

Environment

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Forberedelse og Test af Impedans-baserede strømningstekniske Biochips med RTgill-W1 Celler til hurtig evaluering af drikkevand Prøver til Toksicitet

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Ekstraktion og analyse af Mikrobiel Phospholipid fedtsyrer i Jordbunden

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems (PEMS) for the Real-driving Emissions (RDE) Regulation in Europe

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems PEMS for the Real-driving Emissions RDE Regulation in Europe

Implementering af bærbare emissionsmålingssystemer (PEMS) for Real-drivende Emission (RDE) Forordning i Europa

Vehicles are tested in controlled and relatively narrow laboratory conditions to determine their official emission values and reference fuel consumption. ...

Using Pharmacological Manipulation and High-precision Radio Telemetry to Study the Spatial Cognition in Free-ranging Animals

Brug Farmakologisk manipulation og Høj præcision RF at studere den Spatial Cognition i fritgående dyr

An animal&#39;s ability to perceive and learn about its environment plays a key role in many behavioral processes, including navigation, migration, ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

Spredning af nanomaterialer i vandige medier: mod protokollen optimering

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Microfluidic Devices for Characterizing Pore-scale Event Processes in Porous Media for Oil Recovery Applications

Mikrofluid anordninger til kendetegner Pore-skala begivenhed processer i porøse medier for olie Recovery programmer

Microfluidic devices are versatile tools for studying transport processes at a microscopic scale. A demand exists for microfluidic devices that are ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Karakterisering af akvatiske biofilm med flowcytometri

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Metal Corrosion and the Efficiency of Corrosion Inhibitors in Less Conductive Media

Metal korrosion og effektiviteten af korrosionsinhibitorer i mindre ledende medier

Material corrosion can be a limiting factor for different materials in many applications. Thus, it is necessary to better understand corrosion processes, ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Isolering og analyse af mikrobielle samfund i jord, rhizosfære og rødder i flerårig græs eksperimenter

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Characterizing Microbiome Dynamics ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œ Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Kendetegner Microbiome Dynamics – flowcytometri baseret arbejdsprocesser fra renkulturer naturlige samfund

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...