Name: combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales
Uploaded: 2020-11-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales at JoVE.com

We erkennen de hulp van Antoine Wiedmer met de opstelling van de robotdispenser en het dispenser.py script.

1. Bacteriële kweekomstandigheden
<ol><li>Gebruik onder een laminaire stroomkap 100 μL van een glycerolvoorraad met GFP-label Pseudomonas putida KT2440 (1 ×10 7 mL-1, opgeslagen bij -80 °C) om 5 mL Luria-Bertani (LB) medium in te enten. Incubeer bij 30 °C terwijl u 's nachts schudt bij 250 tpm.</li>
	<li>De volgende dag, resuspend 100 μL van de nachtelijke cultuur in 5 mL LB medium en incubeer onder dezelfde omstandigheden voor 5h (exponentiële fase). Proef een aliquot van 1 mL in ...

<ol>
	<li>Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+and+removal+of+pathogenic+bacteria+in+wastewater+percolating+through+porous+media:+a+review.">Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review.</a> Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).</li><li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues.">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li><li>Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processes+in+microbial+transport+in+the+natural+subsurface.">Processes in microbial transport in the natural subsurface.</a> Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).</li><li>Tufenkji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+microbial+transport+in+porous+media:+Traditional+approaches+and+recent+developments.">Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments.</a> Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).</li><li>Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+modelling+straining+of+Escherichia+coli+in+saturated+porous+media.">Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media.</a> Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).</li><li>Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+and+biogeochemistry+of+stream+biofilms.">The ecology and biogeochemistry of stream biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).</li><li>Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+biophysical+underpinnings+to+the+success+of+multispecies+biofilms+in+porous+environments.">Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments.</a> The ISME Journal. 1, (2019).</li><li>Carrel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+in+3D+porous+media:+Delineating+the+influence+of+the+pore+network+geometry,+flow+and+mass+transfer+on+biofilm+development.">Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development.</a> Water Research. 134, 280-291 (2018).</li><li>Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+hopping+and+trapping+in+porous+media.">Bacterial hopping and trapping in porous media.</a> Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).</li><li>Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trait-specific+dispersal+of+bacteria+in+heterogeneous+porous+environments:+from+pore+to+porous+medium+scale.">Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale.</a> Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).</li><li>Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+preferential+flow+paths+perpetuated+by+microbial+activity+in+the+soil+matrix?+A+review.">Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review.</a> Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).</li><li>Creppy, A., Cl&#233;ment, E., Douarche, C., D'Angelo, M. V., Auradou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+motility+on+the+transport+of+bacteria+populations+through+a+porous+medium.">Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium.</a> Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).</li><li>Camesano, T. A., Logan, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Fluid+Velocity+and+Cell+Concentration+on+the+Transport+of+Motile+and+Nonmotile+Bacteria+in+Porous+Media.">Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media.</a> Environmental Science &amp; Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).</li><li>Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+surface+characteristics+on+the+transport+of+multiple+Escherichia+coli+isolates+in+large+scale+columns+of+quartz+sand.">The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand.</a> Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).</li><li>Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+biofilm+on+bacterial+transport+and+deposition+in+porous+media.">Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media.</a> Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).</li><li>Long, T., Ford, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Transverse+Migration+of+Bacteria+by+Chemotaxis+in+a+Porous+T-Sensor.">Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor.</a> Environmental Science &amp; Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).</li><li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+Expanding+the+Frontiers+of+Microbial+Ecology.">Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology.</a> Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Digital+Video+Microscopy+for+Colloidal+Studies.">Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+determination+of+bacterial+abundance+in+lake+plankton+with+the+green+nucleic+acid+stain+SYTO+13.">Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13.</a> Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).</li></ol>

Hier stellen we twee middelen voor om het vervoer van microben door poreuze systemen op eencellig en populatieniveau te bestuderen. Hoewel de studie van transportverschijnselen met BTC-modellering waardevolle inzichten heeft opgeleverd in de verspreiding van ziekteverwekkers of verontreinigingen op de ecosysteemschalen, bestaan er nog steeds moeilijkheden om te variëren van laboratoriumexperimenten tot veldomstandigheden. De hier beschreven tools stellen onderzoekers in staat om de ruimtelijke en temporele schalen exper...

Studies die gericht zijn op het begrijpen van het vervoer van microben via poreuze media zijn voornamelijk veroorzaakt door bezorgdheid over besmetting1, de overdracht van ziekte2 en bioremediatie3. In dit verband zijn bacteriën meestal behandeld als deeltjes in transportmodellen4 en zijn processen zoals filtratie, overbelasting, gravitatieregeling of hermobilisatie van biofilms geïdentificeerd als aanjagers van retentie of transport van microben5. Het bestuderen van het transport van bacteriën door poreuze landschappen kan ons echter ook informeren over de ecologische strategieën die hun succes in deze complexe omgevingen ondersteunen. Toch vereist dit nieuwe experimenten en wiskundige modellen die werken op het niveau van één cel, populatie of microbiële gemeenschap.
Natuurlijke poreuze omgevingen, zoals die gevonden in de hyporheïsche zone van beken en rivieren, zijn dicht gekoloniseerd door diverse gemeenschappen van biofilm-vormende microben6. Biofilms vormen structuren die de stroom wijzigen en dus het transport en de verspreiding van bacteriën in de vloeibare fase7,8. Het vervoer van bacteriën op porieschaal hangt af van de beperkte beschikbaarheid van ruimte in de poreuze matrix en beweeglijkheidsgerelateerde verspreiding kan een effectieve manier zijn om de individuele geschiktheid te vergroten door verminderde concurrentie om hulpbronnen in minder dichtbevolkte gebieden. Aan de andere kant kunnen motilebacteriën ook meer geïsoleerde gebieden van de poreuze matrix bereiken en de uitgebreide verkenning van dergelijke gebieden kan ecologische mogelijkheden bieden om motile populaties10. Bij grotere ruimtelijke schalen leidt biofilmgroei de stroompaden af die ook leiden tot (gedeeltelijke) verstopping van poriën en dus tot de vaststelling van nog meer gekanaliseerde en heterogene stromingsvoorwaarden11. Dit heeft gevolgen voor de toevoer van voedingsstoffen en de verspreidingscapaciteit, de frequentie en de afstand. Preferentiële stroom, bijvoorbeeld, kan genereren zogenaamde "fast-tracks" en motile bacteriën kunnen bereiken nog hogere snelheden dan de lokale stroom langs deze tracks12. Dit is een effectieve manier om de verkenning van nieuwe habitats te verhogen.
Een verscheidenheid van instrumenten maken gebruik voor de studie van het vervoer van motile en niet-motile bacteriën (en deeltjes) in poreuze media. Numerieke modellen hebben grote voorspellende capaciteiten die belangrijk zijn voor toepassingen, maar worden vaak beperkt door inherente aannames4. Laboratoriumexperimenten13,14 in combinatie met baanbrekende curve (BTC) modellering hebben belangrijke inzichten opgeleverd in het belang van bacteriële celoppervlakeigenschappen voor het vasthouden van efficiëntie15. BBC's (d.w.z. tijden reeks deeltjesconcentratie op een vaste locatie) worden meestal verkregen via constantere emissies en meting van celnummers bij de uitstroom van het experimentele apparaat. In deze context weerspiegelen BTC's de advection-dispersiedynamiek van bacteriën in de poreuze matrix en kunnen ze worden verlengd met een gootsteenterm die waarde hechting. Het modelleren van BBC's alleen lost echter niet de rol op van de ruimtelijke organisatie van het poreuze substraat of biofilm voor transportprocessen. Andere macroscopische waarneembare stoffen zoals dispersiviteit of afzettingsprofielen hebben bewezen belangrijke informatie te verschaffen over de ruimtelijke verdeling of de behouden deeltjes of groeiende gemeenschappen. Microfluidics is een technologie die het mogelijk maakt het bestuderen van transport in poreuze media door microscopie onderzoek9,12,16, en met uitzondering van een recent werk10, experimentele systemen zijn meestal beperkt tot een enkele lengte schaal van resolutie, dat wil zeggen, de porie schaal of de gehele vloeistofapparaat schaal.
Hier introduceren we een reeks gecombineerde methoden om het transport van motile- en niet-motilebacteriën in poreuze landschappen op verschillende schalen te bestuderen. We combineren waarnemingen van bacterieel transport op de porieschaal met informatie op grotere schaal, door middel van BTC-analyse. Microfluïde apparaten die zijn opgebouwd uit zachte lithografie met behulp van polydimethylsiloxaan (PDMS) zijn biocompatibel, bestand tegen een reeks chemicaliën, maken replicabiliteit tegen lage kosten mogelijk en bieden een uitstekende optische transparantie en een lage autofluorescentie die cruciaal is voor microscopische observatie. Microfluidics op basis van PDMS is eerder gebruikt om het transport van microben in eenvoudige kanalen17 of in complexere geometrieën te bestuderen12. Echter, meestal microfluidics experimenten richten zich op korte termijn horizonten en epi-fluorescentie microscopische observatie van levende cellen is vaak beperkt tot genetisch gemodificeerde stammen (bijvoorbeeld, GFP-gelabelde stammen). Hier presenteren we tools om bacterieel transport te bestuderen met behulp van PDMS-gebaseerde microfluïde apparaten in combinatie met microscopie en grotere apparaten vervaardigd uit poly (methylmethacrylaat) (PMMA, ook bekend als plexiglas) in combinatie met flow cytometrie. PDMS en PMMA verschillen in gaspermeabiliteit en oppervlakte-eigenschappen, waardoor complementaire mogelijkheden zijn om bacterieel transport te bestuderen. Terwijl het microfluidic apparaat een gecontroleerdere omgeving verstrekt, staat het grotere apparaat voor experimenten over langere periodes van tijd of gebruikend natuurlijke bacteriële gemeenschappen toe. Microscopie tellen op hoge temporele resolutie in een specifiek gebied wordt gebruikt om BTC te verkrijgen in de PDMS-gebaseerde microfluïde apparaat. Om celtellingen voor BTC-modellering te verkrijgen van het OP PMMA gebaseerde apparaat, introduceren we een zelfgebouwde geautomatiseerde vloeistofdispenser in combinatie met stroomcytometrie. In deze opstelling passeren cellen het vloeibare apparaat en worden achtereenvolgens in 96 putplaten afgegeven. De temporele resolutie wordt beperkt door het minimumvolume dat nauwkeurig kan worden afgegeven en dus de gemiddelde stroomsnelheid door het vloeibare apparaat. Fixatief in de putten voorkomt groei en vergemakkelijkt DNA-kleuring voor downstream flow-cytometrische opsoming. Om bacteriële groei tijdens transportexperimenten te voorkomen gebruiken we een minimaal medium (begroeide beweeglijkheidsbuffer).
Aangezien protocollen voor de bereiding van vloeistofapparaten op verschillende schalen direct beschikbaar zijn, introduceren we slechts kort de technieken om dergelijke apparaten te produceren en richten we ons eerder op de experimentele procedures om BBC's op te nemen. Op dezelfde manier bestaan er verschillende routines voor de stromingscytometrische opsoming van microben en gebruikers vereisen deskundige kennis om resultaten te interpreteren die zijn verkregen door flow cytometrie. We rapporteren het nieuwe gebruik van microfluïde apparaten in combinatie met microscopische beeldvorming om BTC's van fluorescerend getagde cellen vast te leggen. Op de porieschaal worden lokale snelheden en trajecten verkregen door middel van beeldverwerking. Verder tonen we het gebruik van een PMMA-gebaseerde fluidic apparaat in combinatie met flow-cytometrische tellen om bacteriële transport van motile en niet-motile cellen in poreuze omgevingen gekoloniseerd door een native stream biofilm te observeren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastomer Sylgard 184</td>
			<td>Dowsil</td>
			<td>101697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer NovoCyte</td>
			<td>Acea</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit</td>
			<td>makeblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axio Imager</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope AxioZoom v16</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 75 mm &#215; 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 3 peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma bonder Corona SB</td>
			<td>BlackHole Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump New Era NE 4000</td>
			<td>New Era</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF31SA universal milling machine</td>
			<td>Mikron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales

Inzicht in het vervoer, de verspreiding en depositie van micro-organismen in poreuze media is een complexe wetenschappelijke taak die onderwerpen omvat die zo divers zijn als hydrodynamica, ecologie en milieutechniek. Het modelleren van bacterieel transport in poreuze omgevingen op verschillende ruimtelijke schalen is van cruciaal belang om de gevolgen van bacterieel vervoer beter te voorspellen, maar de huidige modellen slagen er vaak niet in om van laboratorium naar veldomstandigheden te worden opgeschaald. Hier introduceren we experimentele tools om bacterieel transport in poreuze media op twee ruimtelijke schalen te bestuderen. Het doel van deze instrumenten is om macroscopische observables (zoals doorbraakkrommen of afzettingsprofielen) van bacteriën geïnjecteerd in transparante poreuze matrices te verkrijgen. Op kleine schaal (10-1000 μm) worden microfluïde apparaten gecombineerd met optische videomicroscopie en beeldverwerking om baanbrekende krommen te verkrijgen en tegelijkertijd individuele bacteriële cellen op de porieschaal te volgen. Op grotere schaal wordt flow cytometrie gecombineerd met een zelfgemaakte robotdispenser om baanbrekende rondingen te verkrijgen. We illustreren het nut van deze hulpmiddelen om beter te begrijpen hoe bacteriën worden vervoerd in complexe poreuze media, zoals de hyporheïsche zone van stromen. Aangezien deze tools gelijktijdige metingen bieden op verschillende schalen, maken ze de weg vrij voor op mechanismen gebaseerde modellen, die van cruciaal belang zijn voor opschaling. Toepassing van deze instrumenten kan niet alleen bijdragen aan de ontwikkeling van nieuwe bioremediatietoepassingen, maar ook nieuw licht werpen op de ecologische strategieën van micro-organismen die poreuze substraten koloniseren.

Om de functionaliteit van de gepresenteerde workflow te illustreren, voerden we experimenten uit met genetisch gemodificeerde Pseudomonas putida KT2440, een gram negatieve motile bacterie die belangrijk is voor bioremediatie en biotechnologie. Genetisch gemodificeerde versies van deze stam die de GFP-productie uitdrukken zijn commercieel beschikbaar. Een niet-motile stam van P. putida KT2440 die niet de relevante structurele en regulerende genen voor beweeglijkheid is oo...

Watch this Scientific Journal Video about Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales at JoVE.com

Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

Baanbrekende krommen (BBC's) zijn efficiënte instrumenten om het transport van bacteriën in poreuze media te bestuderen. Hier introduceren we tools op basis van vloeibare apparaten in combinatie met microscopie en flow cytometrische tellingen om BTC's te verkrijgen.

Het combineren van fluidic devices met microscopie en flow cytometrie om microbiële transporten te bestuderen in poreuze media over ruimtelijke schalen

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

Het bestuderen van het transport van bacteriën in poreuze systemen is belangrijk met betrekking tot besmetting, verspreiding van ziekten en bioremediatie. Voor deze experimenten in wiskundige modellen die op de eencellige, de bevolking en de microbiële gemeenschap niveau nodig zijn. Hier presenteren we tools om bacterieel transport te bestuderen met behulp van microfluïde apparaten en microscopie, evenals grotere apparaten in combinatie met stroomcytometrie.De combinatie van microfluïde apparaten met microscopie en stroomcytometrie biedt een scala aan mogelijkheden om bacteriële transportverschijnselen op verschillende ruimtelijke schalen te bestuderen. Om dit protocol volledig te verkennen, wordt voorgesteld om eerdere ervaring te hebben in microscopie, basisbeeldverwerking, het ontwerpen van microfluïde apparaten en het beheersen van flow cytometrie. Deze video beschrijft twee methoden om bacterieel transport op verschillende ruimtelijke schalen te bestuderen.De eerste methode, gebaseerd op microfluidic apparaten, is gebaseerd op microscopie om individuele cellen te tellen. Dit systeem kan worden gebruikt om bacterieel transport te bestuderen over meerdere ruimtelijke schalen van de porie tot de gehele poreuze systeemschaal. De tweede methode, met behulp van grotere vloeibare apparaten gekoppeld aan een geautomatiseerde dispenser en flow cytometrie, kan worden gebruikt om bacteriële transport fenomeen te bestuderen op de schaal van hele poreuze systemen.Dergelijke methoden kunnen ook worden ingezet in laboratoriumkolomstudies, evenals kleine veldonderzoeken. Om te beginnen ontwerp je de gewenste poreuze geometrie die bestaat uit een matrix van cirkels. Op basis van de gekozen geometrie, bereiden een mal met behulp van standaard SU-8 fotolithografie.Bereid 50 gram PDMS door 90% elastomeer toe te voegen aan 10% van het uithardingsmiddel tot 90% elastomeer in gewicht in een schone wegwerpcontainer en meng de twee reagentia met een schoon gereedschap. Breng een vacuüm van 100 millibar gedurende 30 minuten aan om opgeloste lucht en bellen te verwijderen. Plaats de mal in een petrischaal en giet de PDMS op de mal op de gewenste hoogte tussen twee en vijf millimeter.Bedek de petrischaal met een deksel en houd het op 60 graden Celsius voor ten minste vier uur. Laat het microfluïde apparaat daarna afkoelen tot kamertemperatuur. Zodra het is afgekoeld, voorzichtig verwijderen van de gewenste portie PDMS met een scalpel.Verzegel de onderkant van het PDMS-kanaal tijdelijk met tape. Met een puncher met een diameter van 0,5 millimeter doorboort je kanalen om een inlaat en een uitlaat te creëren. Verwijder de tape uit het PDMS-kanaal en plaats het kanaal met de poreuze kant naar boven.Behandel de glazen schuif en PDMS oppervlakken met plasma voor ongeveer 45 seconden elk bij kamertemperatuur. Plaats het voorbehandelde PDMS-kanaal op de voorbehandelde glazen schuif en verwarm 30 minuten op een hete plaat op 100 graden Celsius, verwijder vervolgens het microfluïde apparaat van de hete plaat en koel het af tot kamertemperatuur. Breng vacuüm gedurende 30 minuten aan om lucht uit PDMS te verwijderen.Gebruik voor de productie van de basis met de porieruimte een zeer nauwkeurige microfrezen om 0,5 millimeter uit de basis-PMMA-laag te verwijderen en een groef te frezen ter grootte van 1,1 bij 1,1 millimeter voor een rubberen O-ring. Boor twee schroefdraadgaten voor een inlaat en uitlaat in het bovenste deel van het vloeibare apparaat en 12 gaten voor schroeven. Dit dient als het deksel van het vloeibare apparaat.Na het reinigen van de fluidic apparaat, schroef de basis en het deksel samen met behulp van de 12 schroefdraad gaten. Verwijder de microfluïde uit het vacuüm en plaats het op de microscoop fase. Gebruik de spuitpomp om het te verzadigen met beweeglijkheidsbuffer.Met behulp van Brightfield-microscopie of fasecontrast past u de vergroting aan om afzonderlijke bacteriële cellen te visualiseren en zich te concentreren op het midden van het observatiekanaal. Schakel de lichtpadinstellingen over naar fluorescentiemicroscopie. Pas de scherpstelling aan door middel van een verschuiving en de camerabelichtingstijd om individuele bacteriële cellen op te lossen.In dit geval 100 milliseconden. Steek vervolgens de inlaatbuizen in een twee milliliter buis met de bacteriële suspensie. Keer de pomprichting om en begin de suspensie terug te trekken met een stroomsnelheid van één microliter per minuut.Scan de dwarsdoorsnede van het gehele observatiekanaal en opname elke minuut een beeld. Importeer afbeeldingen naar een gewenst softwareplatform. Neem de achtergrond op als het gemiddelde van de eerste beelden wanneer er geen deeltjes zijn opgenomen.Trek de achtergrond van elke afbeelding af om cameraruis en optische aberratie te verwijderen. Snijd de afbeeldingen bij in een gebied waar u van belang bent. Identificeer een drempelwaarde die gelijk is aan de pixelintensiteit van de celfluorescentie, zodat waarden die groter zijn dan de drempel bacteriële cellen bevatten.Gebruik afbeeldingsverwerking om de drempelwaarde van elke afbeelding af te trekken. Binarize de resulterende afbeelding, zodat bacteriële cellen nemen een waarde van een, terwijl de achtergrond neemt een waarde van nul. Verwijder pixelclusters met een gebied dat kleiner is dan de kleinste bacteriële celgrootte in pixels.Som de binarized afbeelding op om het totale aantal pixels van de resterende clusters te verkrijgen. Verdeel het aantal pixels door de gemiddelde grootte van een bacteriële cel in pixels om een schatting van het aantal cellen te verkrijgen. Zet de tellingen om in concentratie in deeltjes per milliliter.Om de concentratie van de geïnjecteerde bacteriële suspensie te identificeren, injecteer de bacteriële suspensie in het observatiekanaal van een schoon microfluïdisch apparaat met een spuit. Nota van de afbeelding en bereken de eerder getoonde bacteriële concentratie. Visualiseer baanbrekende rondingen door de effluent bacteriële concentratie C te normaliseren met de influent bacteriële concentratie C0 en C te plotten boven C0 versus tijd.Om de lokale snelheden en trajecten van bacteriën die door de poreuze matrix worden getransporteerd te analyseren, verplaatst u het microscoopstadium naar een gebied van belang en past u de focus aan het midden van het microfluïde apparaat aan. Stel de optische configuratie in op fasecontrast- of fluorescentiemicroscopie. Neem time-lapse beelden en een belichtingstijd kort genoeg om bacteriële verplaatsing vast te leggen.In dit geval 50 milliseconden. Neem foto's op over een voldoende tijd, bijvoorbeeld drie minuten. Als u ruis uit elke afbeelding wilt verwijderen, trekt u de achtergrond af, het gemiddelde van de som van alle opgenomen afbeeldingen.Bepaal de modulus van het numerieke verloop en normaliseer deze met de maximale waarde. Zoek en neem bacteriële coördinaten en het tijdstip van beeldverwerving op in een bestand met drie kolommen. Voer deeltjestrackinganalyse uit om de opgenomen gegevens te verwerken en de trajecten te berekenen.Om depositieprofielen te verkrijgen, registreert u een samengesteld beeld van het gehele poreuze kanaal vóór, dat is de achtergrond, en na injectie van de bacteriële suspensie door het microfluïde apparaat. Verwijder de achtergrond van de beelden die zijn opgenomen na bacteriële injectie. Besle lang het depositieprofiel D als de som van het bacteriële fluorescentiesignaal langs transversale delen van lengte x van het poreuze kanaal.Visualiseer het depositieprofiel als het lokale fluorescentiesignaal ten opzichte van de poreuze kanaallengte. Om de automatische dispenser in te stellen, plaatst u de robotdispenser dicht bij het vloeistofapparaat. Sluit de robotdispenser aan op de computer waarop BCNC draait en identificeer de juiste com-poort.Klik in BCNC op de thuisknop om de robotdispenser terug te brengen naar de thuispositie. Sluit de peristaltische pomp met de inlaat met behulp van 50 centimeter lang, een millimeter binnendiameter buizen, en de uitstroom met de automatische dispenser met behulp van dezelfde slang. Pomp teeltmedium door het vloeibare apparaat.Let op de komst van medium bij de uitlaatbuizen die aan de robotautomaat zijn bevestigd en plaats een 96-putplaat die de uitstroom zal verzamelen. Activeer tegelijkertijd de robotdispenser en injecteer de bacteriële suspensie via het PMMA-vloeistofapparaat met een stroomsnelheid van 0,2 milliliter per minuut. Injecteer bacteriële suspensie gelijk aan verschillende porie volumes.Bijvoorbeeld, 30 keer het volume van het vloeibare apparaat. Na injectie overschakelen naar steriel teeltmedium tot het einde van het experiment. Zodra een 96-put plaat is voltooid, dek de plaat en bewaar op vier graden Celsius tot de stroom cytometrie analyse.Analyseer monsters met stroomcytometrie en visualiseer baanbrekende rondingen door de effluent bacteriële concentratie C te normaliseren met de influent bacteriële concentratie C0 en C te plotten boven C0 versus tijd. In deze studie, met behulp van zowel motile en niet-motile Pseudomonas putida KT2440, sequentiële experimenten werden uitgevoerd in PDMS microfluïde apparaten met een willekeurige array van pijlers. Doorbraakcurven genormaliseerd tot de concentratie van geïnjecteerde cellen, evenals bacteriële trajecten op de porieschaal worden hier weergegeven.Experimenten met grootschalige vloeistofapparatuur gefreesd van PMMA werden ook uitgevoerd. Motile en niet-motile Pseudomonas putida KT2440 werden geïnjecteerd in een regelmatig gespreide poreuze matrix. Opvallend, in een poreuze omgeving verstoken van biofilm, motile en niet-motile Pseudomonas putida KT2440 toonde een duidelijk ander transport gedrag op basis van baanbrekende bochten.In een poreuze matrix gekoloniseerd voor 48 uur met een complexe stroom biofilm gemeenschap, deze verschillen in doorbraak curven tussen motile en niet-motile Pseudomonas putida KT2440 verdwenen. We gebruiken dit systeem om bacterieel transport in de stromen te bestuderen, maar deze hulpmiddelen kunnen gemakkelijk worden aangepast om bacteriële transportverschijnselen in andere ontworpen en milieusystemen te bestuderen. Bacterietransport door gehydrateerde poreuze media kapselt processen over meerdere ruimtelijke schalen.De hier gepresenteerde methodologie maakt het mogelijk om de lokale verplaatsing van bacteriën op de porieschaal te koppelen aan het microscopisch transport op het gehele poreuze medium.

Research

JoVE Journal

Environment

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Opstellen en testen van impedantie-gebaseerde Fluidic biochips met RTgill-W1 Cellen voor snelle evaluatie van Drinkwater Monsters voor de toxiciteit

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Extractie en analyse van Microbiële Phospholipid vetzuren in de bodem

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems (PEMS) for the Real-driving Emissions (RDE) Regulation in Europe

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems PEMS for the Real-driving Emissions RDE Regulation in Europe

Implementatie van Portable emissiemeetsystemen (PEMS) voor de Real-driving Emissies (RDE) Verordening in Europa

Vehicles are tested in controlled and relatively narrow laboratory conditions to determine their official emission values and reference fuel consumption. ...

Using Pharmacological Manipulation and High-precision Radio Telemetry to Study the Spatial Cognition in Free-ranging Animals

Met behulp van farmacologische Manipulatie en hoge precisie-Radio Telemetrie op de Ruimtelijke Cognition in Free opgezette dieren Studie

An animal&#39;s ability to perceive and learn about its environment plays a key role in many behavioral processes, including navigation, migration, ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

Dispersie van nanomaterialen in waterige Media: op weg naar protocolverbetering

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Microfluidic Devices for Characterizing Pore-scale Event Processes in Porous Media for Oil Recovery Applications

Microfluidic apparaten voor het karakteriseren van porie-schaal gebeurtenis processen in poreuze Media voor olie herstel toepassingen

Microfluidic devices are versatile tools for studying transport processes at a microscopic scale. A demand exists for microfluidic devices that are ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Karakterisering van aquatische Biofilms met stroom Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Metal Corrosion and the Efficiency of Corrosion Inhibitors in Less Conductive Media

Metalen tegen corrosie en de efficiëntie van corrosie remmers in minder geleidende Media

Material corrosion can be a limiting factor for different materials in many applications. Thus, it is necessary to better understand corrosion processes, ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Isolatie en analyse van microbiële gemeenschappen in bodem, rhizosfeer en wortels in de overblijvende gras experimenten

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Characterizing Microbiome Dynamics ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œ Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Wezenlijke Microbiome Dynamics – Stroom Cytometry gebaseerd werkstromen van reinculturen aan natuurlijke gemeenschappen

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...