Name: combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales
Uploaded: 2020-11-25T14:00:00
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Nous reconnaissons l’aide d’Antoine Wiedmer avec la mise en place du distributeur robotique et le dispenser.py script.

1. Conditions de culture bactérienne
<ol><li>En travaillant sous un capot d’écoulement laminaire, utiliser 100 μL d’un stock de glycérol de Pseudomonas putida KT2440 marqué GFP (1 ×10 7 mL-1, stocké à -80 °C) pour inoculer 5 mL de milieu Luria-Bertani (LB). Incuber à 30 °C tout en secouant à 250 rpm pendant la nuit.</li>
	<li>Le lendemain, resuspendez 100 μL de la culture nocturne en moyenne LB de 5 mL et incubez dans les mêmes conditions pendant 5h (phase exponentielle)...

<ol>
	<li>Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+and+removal+of+pathogenic+bacteria+in+wastewater+percolating+through+porous+media:+a+review.">Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review.</a> Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).</li><li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues.">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li><li>Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processes+in+microbial+transport+in+the+natural+subsurface.">Processes in microbial transport in the natural subsurface.</a> Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).</li><li>Tufenkji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+microbial+transport+in+porous+media:+Traditional+approaches+and+recent+developments.">Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments.</a> Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).</li><li>Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+modelling+straining+of+Escherichia+coli+in+saturated+porous+media.">Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media.</a> Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).</li><li>Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+and+biogeochemistry+of+stream+biofilms.">The ecology and biogeochemistry of stream biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).</li><li>Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+biophysical+underpinnings+to+the+success+of+multispecies+biofilms+in+porous+environments.">Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments.</a> The ISME Journal. 1, (2019).</li><li>Carrel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+in+3D+porous+media:+Delineating+the+influence+of+the+pore+network+geometry,+flow+and+mass+transfer+on+biofilm+development.">Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development.</a> Water Research. 134, 280-291 (2018).</li><li>Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+hopping+and+trapping+in+porous+media.">Bacterial hopping and trapping in porous media.</a> Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).</li><li>Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trait-specific+dispersal+of+bacteria+in+heterogeneous+porous+environments:+from+pore+to+porous+medium+scale.">Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale.</a> Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).</li><li>Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+preferential+flow+paths+perpetuated+by+microbial+activity+in+the+soil+matrix?+A+review.">Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review.</a> Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).</li><li>Creppy, A., Cl&#233;ment, E., Douarche, C., D'Angelo, M. V., Auradou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+motility+on+the+transport+of+bacteria+populations+through+a+porous+medium.">Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium.</a> Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).</li><li>Camesano, T. A., Logan, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Fluid+Velocity+and+Cell+Concentration+on+the+Transport+of+Motile+and+Nonmotile+Bacteria+in+Porous+Media.">Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media.</a> Environmental Science &amp; Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).</li><li>Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+surface+characteristics+on+the+transport+of+multiple+Escherichia+coli+isolates+in+large+scale+columns+of+quartz+sand.">The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand.</a> Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).</li><li>Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+biofilm+on+bacterial+transport+and+deposition+in+porous+media.">Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media.</a> Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).</li><li>Long, T., Ford, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Transverse+Migration+of+Bacteria+by+Chemotaxis+in+a+Porous+T-Sensor.">Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor.</a> Environmental Science &amp; Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).</li><li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+Expanding+the+Frontiers+of+Microbial+Ecology.">Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology.</a> Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Digital+Video+Microscopy+for+Colloidal+Studies.">Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+determination+of+bacterial+abundance+in+lake+plankton+with+the+green+nucleic+acid+stain+SYTO+13.">Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13.</a> Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).</li></ol>

Ici, nous suggérons deux moyens d’étudier le transport des microbes à travers des systèmes poreux au niveau d’une seule cellule et au niveau de la population. Bien que l’étude des phénomènes de transport à l’aide de la modélisation BTC ait fourni des informations précieuses sur la propagation des agents pathogènes ou des contaminants à l’échelle de l’écosystème, il existe encore des difficultés à passer des expériences de laboratoire aux conditions sur le terrain. Les outils décrits ici per...

Les études visant à comprendre le transport des microbes à travers les médias poreux ont principalement été motivées par des préoccupations de contamination1, la transmission de lamaladie 2 et la biorémédiation3. À cet égard, les bactéries ont surtout été traitées comme des particules dans les modèles de transport4 et des processus tels que la filtration, la tension, le décantation gravitationnelle ou la remobilisation à partir de biofilms ont été identifiés comme des moteurs de rétention ou de transport des microbes5. Toutefois, l’étude du transport des bactéries à travers les paysages poreux peut également nous renseigner sur les stratégies écologiques qui sous-tendent leur succès dans ces environnements complexes. Pourtant, cela nécessite de nouvelles expériences et des modèles mathématiques fonctionnant au niveau de la cellule unique, de la population ou de la communauté microbienne.
Les milieux poreux naturels, tels que ceux que l’on trouve dans la zone hyporhéique des cours d’eau et des rivières, sont densément colonisés par diverses communautés de microbes formant des biofilms6. Les biofilms forment des structures qui modifient le flux et donc le transport et la dispersion des bactéries dans la phaseliquide 7,8. Le transport des bactéries à l’échelle des pores dépend de la disponibilité limitée de l’espace dans la matrice poreuse et la dispersion liée à la motilité peut être un moyen efficace d’augmenter la condition physique individuelle grâce à une concurrence réduite pour les ressources dans les zones moins densément peuplées. D’autre part, les bactéries motiles peuvent également atteindre des régions plus isolées de la matrice poreuse et l’exploration prolongée de ces zones peut offrir des possibilités écologiques aux populationsmotiles 10. À de plus grandes échelles spatiales, la croissance des biofilms détourne les trajectoires d’écoulement, ce qui entraîne également un obstruement (partiel) des pores et, par conséquent, l’établissement de conditions d’écoulement encore plus canalisées ethétérogènes11. Cela a des conséquences sur l’approvisionnement en éléments nutritifs et la capacité de dispersion, la fréquence et la distance. Le flux préférentiel, par exemple, peut générer ce qu’on appelle des « voies rapides » et les bactéries motiles peuvent atteindre des vitesses encore plus élevées que le débit local le long de cesvoies 12. Il s’agit d’un moyen efficace d’accroître l’exploration de nouveaux habitats.
Une variété d’outils se servent pour l’étude du transport des bactéries motiles et non motiles (et des particules) dans les médias poreux. Les modèles numériques ont de grandes capacités prédictives importantes pour les applications, mais sont souvent limités par des hypothèsesinhérentes 4. Les expériences àl’échelle de laboratoire 13,14 combinées à la modélisation révolutionnaire de la courbe (BTC) ont fourni des aperçus importants de l’importance des propriétés bactériennes de surface cellulaire pour collerl’efficacité 15. En règle générale, les CTC (c.-à-d. séries de temps de concentration de particules à un endroit fixe) sont obtenus au moyen de rejets à taux constant et de la mesure des nombres cellulaires à l’extérieur du dispositif expérimental. Dans ce contexte, les BTC reflètent la dynamique d’advection-dispersion des bactéries dans la matrice poreuse et peuvent être prolongés par un terme d’évier tenant compte de l’attachement. Toutefois, la modélisation des CTC à elle seule ne résout pas le rôle de l’organisation spatiale du substrat poreux ou du biofilm pour les processus de transport. Il a été prouvé que d’autres observables macroscopiques comme les profils de dispersion ou de dépôt fournissent des informations importantes sur la distribution spatiale ou les particules retenues ou les communautés en croissance. La microfluidique est une technologie qui permet d’étudier le transport dans les médias poreux par microscopieenquête 9,12,16, et à l’exception d’un travail récent10, les systèmes expérimentaux sont généralement limités à une seule échelle de longueur de résolution, c’est-à-dire l’échelle pore ou l’échelle de l’appareil fluide ensemble.
Ici, nous introduisons une série de méthodes combinées pour étudier le transport des bactéries motiles et non motiles dans les paysages poreux à différentes échelles. Nous combinons les observations du transport bactérien à l’échelle des pores avec des informations à plus grande échelle, au moyen d’une analyse BTC. Les dispositifs microfluidiques construits à partir de lithographie douce à l’aide de polydimethylsiloxane (PDMS) sont biocompatibles, résistants à une gamme de produits chimiques, permettent une réplicabilité à faible coût et offrent une excellente transparence optique ainsi qu’une faible autofluorescence critique pour l’observation microscopique. Les microfluidiques basés sur le PDMS ont déjà été utilisés pour étudier le transport des microbes dans des canaux simples17 ou dans des géométries plus complexes12. Toutefois, les expériences typiquement microfluidiques se concentrent sur des horizons à court terme et l’observation microscopique d’épi fluorescence des cellules vivantes est généralement limitée aux souches génétiquement modifiées (p. ex., souches étiquetées GFP). Nous présentons ici des outils pour étudier le transport bactérien à l’aide d’appareils microfluidiques à base de PDMS en combinaison avec la microscopie et les dispositifs plus grands fabriqués à partir de poly(méthyle méthacrylate) (PMMA, également connu sous le nom de plexiglas) en combinaison avec la cytométrie du flux. Pdms et PMMA diffèrent dans la perméabilité du gaz et les propriétés de surface, offrant ainsi des possibilités complémentaires d’étudier le transport bactérien. Bien que le dispositif microfluidique offre un environnement plus contrôlé, le dispositif plus grand permet des expériences sur de longues périodes de temps ou en utilisant des communautés bactériennes naturelles. Le comptage par microscopie à haute résolution temporelle dans une zone dédiée est utilisé pour obtenir le BTC dans le dispositif microfluidique à base de PDMS. Pour obtenir le nombre de cellules pour la modélisation BTC à partir de l’appareil à base de PMMA, nous introduisons un distributeur automatique de liquide auto-construit en combinaison avec la cytométrie d’écoulement. Dans cette configuration, les cellules passent le dispositif fluidique et sont consécutivement distribuées dans 96 plaques de puits. La résolution temporelle est limitée par le volume minimum qui peut être distribué avec précision et donc le débit moyen à travers le dispositif fluide. Fixatif dans les puits empêche la croissance et facilite la coloration de l’ADN pour l’énumération en aval du débit cytométrique. Pour prévenir la croissance bactérienne pendant les expériences de transport, nous utilisons un milieu minimal (appelé tampon de motilité).
Étant donné que les protocoles de préparation des dispositifs fluidiques à différentes échelles sont facilement disponibles, nous n’introduisons que brièvement les techniques de production de tels dispositifs et nous nous concentrons plutôt sur les procédures expérimentales d’enregistrement des CFC. De même, diverses routines existent pour l’énumération cytométrique du flux des microbes et les utilisateurs ont besoin de connaissances spécialisées pour interpréter les résultats obtenus par cytométrie de flux. Nous rapportons l’utilisation nouvelle des dispositifs microfluidiques en combination avec la formation image microscopique pour enregistrer des BTCs des cellules fluorescentes-marquées. À l’échelle des pores, les vitesses et trajectoires locales sont obtenues au moyen du traitement d’image. De plus, nous démontrons l’utilisation d’un dispositif fluidique à base de PMMA en combinaison avec le comptage flow-cytométrique pour observer le transport bactérien de cellules motiles et non motiles dans des environnements poreux colonisés par un biofilm de cours d’eau indigène.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastomer Sylgard 184</td>
			<td>Dowsil</td>
			<td>101697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer NovoCyte</td>
			<td>Acea</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit</td>
			<td>makeblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axio Imager</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope AxioZoom v16</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 75 mm &#215; 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 3 peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma bonder Corona SB</td>
			<td>BlackHole Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump New Era NE 4000</td>
			<td>New Era</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF31SA universal milling machine</td>
			<td>Mikron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales

Comprendre le transport, la dispersion et le dépôt des micro-organismes dans les milieux poreux est une tâche scientifique complexe comprenant des sujets aussi divers que l’hydrodynamique, l’écologie et l’ingénierie environnementale. La modélisation du transport bactérien dans des environnements poreux à différentes échelles spatiales est essentielle pour mieux prévoir les conséquences du transport bactérien, mais les modèles actuels ne parviennent souvent pas à se mettre à l’échelle des conditions de laboratoire à des conditions sur le terrain. Ici, nous introduisons des outils expérimentaux pour étudier le transport bactérien dans les médias poreux à deux échelles spatiales. L’objectif de ces outils est d’obtenir des observables macroscopiques (comme des courbes révolutionnaires ou des profils de dépôt) de bactéries injectées dans des matrices poreuses transparentes. À petite échelle (10-1000 μm), les dispositifs microfluidiques sont combinés avec la vidéo-microscopie optique et le traitement d’image pour obtenir des courbes révolutionnaires et, en même temps, pour suivre les cellules bactériennes individuelles à l’échelle des pores. À plus grande échelle, la cytométrie d’écoulement est combinée avec un distributeur robotique self-made pour obtenir des courbes révolutionnaires. Nous montrons l’utilité de ces outils pour mieux comprendre comment les bactéries sont transportées dans des médias poreux complexes tels que la zone hyporhéique des cours d’eau. Comme ces outils fournissent des mesures simultanées à travers les échelles, ils ouvrent la voie à des modèles basés sur des mécanismes, d’une importance cruciale pour le haut de gamme. L’application de ces outils peut non seulement contribuer au développement de nouvelles applications de bioremédiation, mais aussi jeter un nouvel éclairage sur les stratégies écologiques des micro-organismes colonisant les substrats poreux.

Pour illustrer la fonctionnalité du flux de travail présenté, nous avons effectué des expériences à l’aide de Pseudomonas putida KT2440 génétiquement modifié, une bactérie motile gram négative importante pour la bioresamédiation et la biotechnologie. Les versions génétiquement modifiées de cette souche qui expriment la production de GFP sont disponibles dans le commerce. Une souche non motile de P. putida KT2440 qui n’a pas les gènes structurels et r?...

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Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

Les courbes révolutionnaires sont des outils efficaces pour étudier le transport des bactéries dans les médias poreux. Ici, nous introduisons des outils basés sur des dispositifs fluidiques en combinaison avec la microscopie et le comptage cytométrique de flux pour obtenir des BTCs.

Combiner des dispositifs fluides avec la microscopie et la cytométrie de débit pour étudier le transport microbien dans les médias poreux à travers les échelles spatiales

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

L’étude du transport des bactéries dans les systèmes poreux est importante en ce qui concerne la contamination, la propagation des maladies et la biorémédiation. Pour ces expériences dans des modèles mathématiques fonctionnant à la cellule unique, la population et le niveau de la communauté microbienne sont nécessaires. Nous présentons ici des outils pour étudier le transport bactérien à l’aide de dispositifs microfluidiques et de microscopie, ainsi que de plus grands dispositifs en combinaison avec la cytométrie du flux.La combinaison de dispositifs microfluidiques avec microscopie et cytométrie d’écoulement offre une gamme de possibilités d’étudier les phénomènes de transport bactérien à différentes échelles spatiales. Afin d’explorer pleinement ce protocole, il est suggéré d’avoir une expérience antérieure dans la microscopie, le traitement d’image de base, la conception d’appareils microfluidiques, et la maîtrise de la cytométrie du flux. Cette vidéo décrit deux méthodes pour étudier le transport bactérien à différentes échelles spatiales.La première méthode, basée sur des dispositifs microfluidiques, repose sur la microscopie pour compter les cellules individuelles. Ce système peut être utilisé pour étudier le transport bactérien à plusieurs échelles spatiales, du pore à l’échelle du système poreux entier. La deuxième méthode, utilisant de plus grands dispositifs fluidiques couplés à un distributeur automatisé et à une cytométrie d’écoulement, peut être utilisée pour étudier le phénomène de transport bactérien à l’échelle de systèmes poreux entiers.Ces méthodes peuvent également être déployées dans le cadre d’études de colonnes à l’échelle de laboratoire, ainsi que de petites études sur le terrain. Pour commencer, concevez la géométrie poreuse désirée qui se compose d’une matrice de cercles. Basé sur la géométrie choisie, préparez un moule à l’aide de la photolithographie SU-8 standard.Préparer 50 grammes de PDMS en ajoutant 90% de l’élastomer à 10% de l’agent de séchage à 90% de l’élastomer par poids dans un récipient jetable propre et mélanger les deux réaccente avec un outil propre. Appliquer un aspirateur de 100 millibar pendant 30 minutes pour éliminer l’air dissous et les bulles. Placez le moule dans une boîte de Pétri et versez le PDMS sur le moule à la hauteur désirée entre deux et cinq millimètres.Couvrir la boîte de Pétri d’un couvercle et la garder à 60 degrés Celsius pendant au moins quatre heures. Après cela, laisser refroidir le dispositif microfluidique à température ambiante. Une fois refroidi, retirer délicatement la partie désirée de PDMS avec un scalpel.Sceller temporairement le fond du canal PDMS avec du ruban adhésif. Avec un poinçonneur de 0,5 millimètre de diamètre, percer les canaux pour créer une entrée et une prise. Retirez la bande du canal PDMS et placez le canal avec le côté poreux orienté vers le haut.Traitez la glissière de verre et les surfaces PDMS avec du plasma pendant environ 45 secondes chacune à température ambiante. Placez le canal PDMS prétraité sur la toboggan en verre prétraité et chauffez à 100 degrés Celsius pendant 30 minutes sur une plaque chauffante, puis retirez le dispositif microfluidique de la plaque chaude et refroidissez-le à température ambiante. Appliquer l’aspirateur pendant 30 minutes pour retirer l’air du PDMS.Pour produire la base contenant le compartiment poreux, utilisez un micro fraisage de haute précision pour retirer 0,5 millimètre de la couche PMMA de base et moudre une rainure de la taille de 1,1 par 1,1 millimètre pour un anneau O en caoutchouc. Percer deux trous filetés pour une entrée et une sortie dans la partie supérieure de l’appareil fluidique et 12 trous pour les vis. Cela sert de couvercle de l’appareil fluide.Après avoir nettoyé l’appareil fluide, vissez la base et le couvercle ensemble à l’aide des 12 trous filetés. Retirer le microfluidique du vide et le placer au microscope. Utilisez la pompe à seringues pour la saturer avec un tampon de motilité.À l’aide de la microscopie Brightfield ou du contraste de phase, ajustez le grossissement pour visualiser les cellules bactériennes individuelles et concentrez-vous sur le centre du canal d’observation. Passez les paramètres du chemin lumineux à la microscopie par fluorescence. Réglez la mise au point à travers un décalage et le temps d’exposition de la caméra pour résoudre les cellules bactériennes individuelles.Dans ce cas, 100 millisecondes. Ensuite, insérez le tube d’entrée dans un tube de deux millilitres contenant la suspension bactérienne. Inverser la direction de la pompe et commencer à retirer la suspension à un débit d’un microlitre par minute.Scannez la section transversale de l’ensemble du canal d’observation, en enregistrant une image chaque minute. Importer des images sur une plate-forme logicielle souhaitée. Enregistrez l’arrière-plan comme la moyenne des premières images lorsqu’aucune particule n’a été enregistrée.Soustrayez l’arrière-plan de chaque image pour supprimer le bruit de la caméra et l’aberration optique. Recadrer les images dans une région d’intérêt. Identifier une valeur seuil égale à l’intensité des pixels de fluorescence cellulaire de sorte que les valeurs supérieures au seuil incluent les cellules bactériennes.Utilisez le traitement d’image pour soustraire la valeur seuil de chaque image. Binarize l’image résultante de sorte que les cellules bactériennes prennent une valeur d’un, tandis que l’arrière-plan prend une valeur de zéro. Retirez les grappes de pixels avec une zone plus petite que la plus petite taille de cellules bactériennes en pixels.Sum l’image binariée pour obtenir le nombre total de pixels des clusters restants. Divisez le nombre de pixels par la taille moyenne d’une cellule bactérienne en pixels pour obtenir une estimation du nombre de cellules. Transformez les dénombrements en concentration en particules par millilitre.Pour identifier la concentration de la suspension bactérienne injectée, injectez la suspension bactérienne dans le canal d’observation d’un dispositif microfluidique propre avec une seringue. Enregistrez l’image et calculez la concentration bactérienne influente telle qu’indiquée précédemment. Visualiser les courbes révolutionnaires en normalisant la concentration bactérienne des effluents C avec la concentration bactérienne influente C0 et en traçant C au-dessus de C0 par rapport au temps.Afin d’analyser les vitesses locales et les trajectoires des bactéries transportées à travers la matrice poreuse, déplacez le stade du microscope vers une région d’intérêt et ajustez l’accent au centre du dispositif microfluidique. Réglez la configuration optique en microscopie de contraste de phase ou de fluorescence. Enregistrez des images en accéléré et un temps d’exposition suffisamment court pour capturer le déplacement bactérien.Dans ce cas, 50 millisecondes. Enregistrez des images sur une quantité suffisante de temps, par exemple trois minutes. Pour supprimer le bruit de chaque image, soustrayez l’arrière-plan, qui est la moyenne de la somme de toutes les images enregistrées.Déterminez le module du gradient numérique et normalisez-le par sa valeur maximale. Trouvez et enregistrez les coordonnées bactériennes et l’heure de l’acquisition d’images dans un fichier à trois colonnes. Effectuez une analyse de suivi des particules pour traiter les données enregistrées et calculer les trajectoires.Pour obtenir des profils de dépôt, enregistrez une image composite de l’ensemble du canal poreux avant, c’est-à-dire l’arrière-plan, et après injection de la suspension bactérienne par le dispositif microfluidique. Retirez l’arrière-plan des images enregistrées après l’injection bactérienne. Calculer le profil de dépôt D comme la somme du signal de fluorescence bactérienne le long des sections transversales de la longueur x du canal poreux.Visualisez le profil de dépôt comme le signal local de fluorescence par rapport à la longueur poreuse du canal. Pour installer le distributeur automatisé, placez le distributeur robotique près de l’appareil fluidique. Connectez le distributeur robotique à l’ordinateur en cours d’exécution BCNC et d’identifier le port com correcte.En BCNC, cliquez sur le bouton d’accueil pour remettre le distributeur robotique à la position de la maison. Connectez la pompe périssaltique à l’entrée à l’aide d’un tube de 50 centimètres de long, d’un millimètre de diamètre intérieur et de l’écoulement avec le distributeur automatisé à l’aide du même tube. Pomper le milieu de culture à travers le dispositif fluide.Notez l’arrivée du milieu à la tuyauterie de sortie fixée au distributeur robotique et placez une plaque de 96 puits qui recueillera l’écoulement. Dans le même temps, activez le distributeur robotique et injectez la suspension bactérienne par l’intermédiaire de l’appareil fluide PMMA à un débit de 0,2 millilitres par minute. Injecter une suspension bactérienne équivalente à plusieurs volumes de pores.Par exemple, 30 fois le volume de l’appareil fluide. Après injection, passer au milieu de culture stérile jusqu’à la fin de l’expérience. Une fois qu’une plaque de 96 puits est terminée, couvrez la plaque et stockez à quatre degrés Celsius jusqu’à l’analyse de cytométrie du débit.Analyser les échantillons avec la cytométrie du débit et visualiser les courbes de percée en normalisant la concentration bactérienne des effluents C avec la concentration bactérienne influente C0 et en traçant C au-dessus de C0 par rapport au temps. Dans cette étude, utilisant à la fois motile et non motile Pseudomonas putida KT2440, des expériences séquentielles ont été réalisées dans des dispositifs microfluidiques PDMS avec un éventail aléatoire de piliers. Des courbes de percée normalisées à la concentration des cellules injectées, aussi bien que des trajectoires bactériennes à l’échelle de pore sont montrées ici.Des expériences avec des dispositifs fluidiques à grande échelle usinés à partir de PMMA ont également été réalisées. Motile et non-motile Pseudomonas putida KT2440 ont été injectés dans une matrice poreuse régulièrement espacée. Étonnamment, dans un environnement poreux dépourvu de biofilm, motile et non motile Pseudomonas putida KT2440 a montré un comportement de transport nettement différent basé sur des courbes révolutionnaires.Dans une matrice poreuse colonisée pendant 48 heures avec une communauté complexe de biofilms de flux, ces différences dans les courbes révolutionnaires entre pseudomonas motiles et non motiles putida KT2440 ont disparu. Nous utilisons ce système pour étudier le transport bactérien dans les cours d’eau, mais ces outils peuvent être facilement ajustés pour étudier les phénomènes de transport bactérien dans d’autres systèmes conçus et environnementaux. Le transport bactérien par des médias poreux hydratés encapsule les processus sur plusieurs échelles spatiales.La méthodologie présentée ici permet de relier le déplacement local des bactéries à l’échelle des pores au transport microscopique à l’ensemble du milieu poreux.

Research

JoVE Journal

Environment

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Préparation et essai d&#39;impédance basée sur biopuces fluidiques avec des cellules RTgill-W1 pour l&#39;évaluation rapide des échantillons d&#39;eau potable pour la toxicité

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Recherche

Environnement

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Extraction et analyse des acides gras des phospholipides microbiens dans les sols

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems (PEMS) for the Real-driving Emissions (RDE) Regulation in Europe

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems PEMS for the Real-driving Emissions RDE Regulation in Europe

La mise en œuvre des émissions mobiles des systèmes de mesure (PEMS) pour le règlement des émissions réel de conduite (RDE) en Europe

Vehicles are tested in controlled and relatively narrow laboratory conditions to determine their official emission values and reference fuel consumption. ...

Using Pharmacological Manipulation and High-precision Radio Telemetry to Study the Spatial Cognition in Free-ranging Animals

Utilisation Manipulation pharmacologique et de haute précision Radio Télémesure pour étudier la cognition spatiale chez les animaux en liberté

An animal&#39;s ability to perceive and learn about its environment plays a key role in many behavioral processes, including navigation, migration, ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

Dispersion des nanomatériaux dans les milieux aqueux : vers l’optimisation des protocoles

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Microfluidic Devices for Characterizing Pore-scale Event Processes in Porous Media for Oil Recovery Applications

Dispositifs microfluidiques pour caractériser les processus d’événement Pore-échelle dans les milieux poreux pour les Applications de récupération huile

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Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

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Metal Corrosion and the Efficiency of Corrosion Inhibitors in Less Conductive Media

La Corrosion des métaux et l’efficacité des inhibiteurs de Corrosion dans les milieux moins conductrice

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Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Isolement et analyse des communautés microbiennes dans le sol, rhizosphère et racines dans des expériences de graminée vivace

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Characterizing Microbiome Dynamics ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œ Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

CARACTERISATION Microbiome dynamique – écoulement Cytometry basé dans les Workflows de Cultures pures des communautés naturelles

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...