Name: combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales
Uploaded: 2020-11-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales at JoVE.com

Wir würdigen die Hilfe von Antoine Wiedmer beim Aufbau des Roboterspenders und der dispenser.py Skript.

1. Bakterielle Kulturbedingungen
<ol><li>Verwenden Sie unter einer laminaren Durchflusshaube 100 l eines Glyzerinbestands von Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 ml-1, bei -80 °C gelagert), um 5 ml Luria-Bertani (LB) Medium zu impfen. Bei 30 °C inkubieren und über Nacht bei 250 Umdrehungen schütteln.</li>
	<li>Am nächsten Tag 100 l der Übernachtungskultur in 5 ml LB-Medium wieder aufheben und unter den gleichen Bedingungen für 5h (exponentielle Phase) inkubieren. Ein 1 ml Aliquot i...

<ol>
	<li>Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+and+removal+of+pathogenic+bacteria+in+wastewater+percolating+through+porous+media:+a+review.">Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review.</a> Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).</li><li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues.">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li><li>Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processes+in+microbial+transport+in+the+natural+subsurface.">Processes in microbial transport in the natural subsurface.</a> Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).</li><li>Tufenkji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+microbial+transport+in+porous+media:+Traditional+approaches+and+recent+developments.">Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments.</a> Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).</li><li>Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+modelling+straining+of+Escherichia+coli+in+saturated+porous+media.">Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media.</a> Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).</li><li>Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+and+biogeochemistry+of+stream+biofilms.">The ecology and biogeochemistry of stream biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).</li><li>Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+biophysical+underpinnings+to+the+success+of+multispecies+biofilms+in+porous+environments.">Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments.</a> The ISME Journal. 1, (2019).</li><li>Carrel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+in+3D+porous+media:+Delineating+the+influence+of+the+pore+network+geometry,+flow+and+mass+transfer+on+biofilm+development.">Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development.</a> Water Research. 134, 280-291 (2018).</li><li>Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+hopping+and+trapping+in+porous+media.">Bacterial hopping and trapping in porous media.</a> Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).</li><li>Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trait-specific+dispersal+of+bacteria+in+heterogeneous+porous+environments:+from+pore+to+porous+medium+scale.">Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale.</a> Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).</li><li>Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+preferential+flow+paths+perpetuated+by+microbial+activity+in+the+soil+matrix?+A+review.">Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review.</a> Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).</li><li>Creppy, A., Cl&#233;ment, E., Douarche, C., D'Angelo, M. V., Auradou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+motility+on+the+transport+of+bacteria+populations+through+a+porous+medium.">Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium.</a> Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).</li><li>Camesano, T. A., Logan, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Fluid+Velocity+and+Cell+Concentration+on+the+Transport+of+Motile+and+Nonmotile+Bacteria+in+Porous+Media.">Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media.</a> Environmental Science &amp; Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).</li><li>Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+surface+characteristics+on+the+transport+of+multiple+Escherichia+coli+isolates+in+large+scale+columns+of+quartz+sand.">The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand.</a> Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).</li><li>Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+biofilm+on+bacterial+transport+and+deposition+in+porous+media.">Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media.</a> Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).</li><li>Long, T., Ford, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Transverse+Migration+of+Bacteria+by+Chemotaxis+in+a+Porous+T-Sensor.">Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor.</a> Environmental Science &amp; Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).</li><li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+Expanding+the+Frontiers+of+Microbial+Ecology.">Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology.</a> Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Digital+Video+Microscopy+for+Colloidal+Studies.">Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+determination+of+bacterial+abundance+in+lake+plankton+with+the+green+nucleic+acid+stain+SYTO+13.">Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13.</a> Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).</li></ol>

Hier schlagen wir zwei Mittel vor, um den Transport von Mikroben durch poröse Systeme auf Einzelzell- und Populationsebene zu untersuchen. Während die Untersuchung von Transportphänomenen mit Hilfe von BTC-Modellierung wertvolle Erkenntnisse über die Ausbreitung von Krankheitserregern oder Kontaminanten auf den Ökosystemskalen lieferte, gibt es nach wie vor Schwierigkeiten, von Laborexperimenten bis hin zu Feldbedingungen zu skalieren. Die hier beschriebenen Werkzeuge ermöglichen es den Forschern, die räumlichen u...

Studien, die darauf abzielen, den Transport von Mikroben durch poröse Medien zu verstehen, wurden hauptsächlich durch Bedenken der Kontamination1, der Übertragung von Krankheit2 und der Biosanierung3 getrieben. In dieser Hinsicht wurden Bakterien in den Transportmodellen4 meist als Partikel behandelt und Prozesse wie Filtration, Belastung, Gravitationsabsetzen oder Remobilisierung aus Biofilmen wurden als Treiber der Retention oder des Transports von Mikroben identifiziert5. Die Untersuchung des Transports von Bakterien durch poröse Landschaften kann uns jedoch auch über die ökologischen Strategien informieren, die ihren Erfolg in diesen komplexen Umgebungen untermauern. Dies erfordert jedoch neuartige Experimente und mathematische Modelle, die auf der Ebene der Einzelzellen, der Population oder der mikrobiellen Gemeinschaft funktionieren.
Natürliche poröse Umgebungen, wie sie in der hyporhoischen Zone von Bächen und Flüssen gefunden werden, werden von verschiedenen Gemeinschaften von biofilmbildenden Mikroben dicht besiedelt6. Biofilme bilden Strukturen, die den Fluss und damit den Transport und die Dispersion von Bakterien in der flüssigen Phase7,8verändern. Der Transport von Bakterien im Porenmaßstab hängt von der begrenzten Raumverfügbarkeit in der porösen Matrix ab und die mit Dermotilität zusammenhängende Dispersion kann ein effektiver Weg sein, um die individuelle Fitness durch einen geringeren Wettbewerb um Ressourcen in weniger dicht besiedelten Gebieten zu erhöhen. Auf der anderen Seite können motile Bakterien auch mehr isolierte Regionen der porösen Matrix erreichen und die erweiterte Erforschung solcher Gebiete kann ökologische Möglichkeiten für motile Populationen bieten10. Bei größeren räumlichen Maßstäben lenkt das Biofilmwachstum die Strömungswege um, was auch zu (teilweiser) Verstopfung der Poren und damit zur Etablierung noch kanalisierterer und heterogener Strömungsbedingungen11führt. Dies hat Folgen für die Nährstoffversorgung und Diedispersionskapazität, Frequenz und Entfernung. Bevorzugter Fluss kann beispielsweise sogenannte "Fast-Tracks" erzeugen und motile Bakterien können noch höhere Geschwindigkeiten erreichen als der lokale Fluss entlang dieser Bahnen12. Dies ist ein effektiver Weg, um die Erforschung neuer Lebensräume zu erhöhen.
Eine Vielzahl von Werkzeugen nutzen sich für die Untersuchung des Transports von motilen und nicht-motilen Bakterien (und Partikeln) in porösen Medien. Numerische Modelle haben große Vorhersagekapazitäten, die für Anwendungen wichtig sind, werden jedoch oft durch inhärente Annahmen eingeschränkt4. Laborexperimente13,14 kombiniert mit der Modellierung von Bahnbrechenden Kurven (BTC) haben wichtige Erkenntnisse über die Bedeutung bakterieller Zelloberflächeneigenschaften für die Hafteffizienz15geliefert. Typischerweise werden BTCs (d. h. Malreihen der Partikelkonzentration an einem festen Ort) durch konstante Freisetzungen und Messung der Zellzahlen am Abfluss des Versuchsgeräts erhalten. In diesem Zusammenhang spiegeln BTCs die Advektions-Dispersionsdynamik von Bakterien in der porösen Matrix wider und können durch einen Senketerm erweitert werden, der die Anhaftung berücksichtigt. Die Modellierung von BTCs allein löst jedoch nicht die Rolle der räumlichen Organisation des porösen Substrats oder Biofilms für Transportprozesse auf. Andere makroskopische Beobachtungswerte wie Dispergivität oder Ablagerungsprofile liefern nachweislich wichtige Informationen über die räumliche Verteilung oder die zurückgehaltenen Teilchen oder wachsenden Gemeinschaften. Mikrofluidik ist eine Technologie, die das Studium des Transports in porösen Medien durch Mikroskopie Untersuchung9,12,16ermöglicht, und außer einer kürzlichen Arbeit10, experimentelle Systeme sind in der Regel auf eine einzelne Längenskala der Auflösung beschränkt, das heißt, die Porenskala oder die gesamte Fluidgeräteskala.
Hier stellen wir eine Reihe kombinierter Methoden vor, um den Transport von motilen und nicht-motilen Bakterien in porösen Landschaften in verschiedenen Maßstäben zu untersuchen. Wir kombinieren Beobachtungen des bakteriellen Transports auf der Porenskala mit Informationen in größerem Maßstab, mittels BTC-Analysen. Mikrofluidische Geräte aus weicher Lithographie mit Polydimethylsiloxan (PDMS) sind biokompatibel, resistent gegen eine Reihe von Chemikalien, ermöglichen Einereproduzierlichkeit zu niedrigen Kosten und bieten eine hervorragende optische Transparenz sowie eine geringe Autofluoreszenz, die für die mikroskopische Beobachtung entscheidend ist. Mikrofluidik auf Basis von PDMS wurde bisher verwendet, um den Transport von Mikroben in einfachen Kanälen17 oder in komplexeren Geometrien12zu untersuchen. Typischerweise konzentrieren sich Mikrofluidik-Experimente jedoch auf kurzfristige Horizonte, und die mikroskopische Beobachtung lebender Zellen durch Epifluoreszenz ist häufig auf genetisch veränderte Stämme (z. B. GFP-markierte Stämme) beschränkt. Hier stellen wir Werkzeuge zur Untersuchung des bakteriellen Transports mit MIKROfluidischen PDMS-basierten Geräten in Kombination mit Mikroskopie und größeren Geräten aus Poly (Methylmethacrylat) (PMMA, auch Plexiglas genannt) in Kombination mit Durchflusszytometrie vor. PDMS und PMMA unterscheiden sich in der Gasdurchlässigkeit und Oberflächeneigenschaften und bieten so ergänzende Möglichkeiten, den bakteriellen Transport zu untersuchen. Während das mikrofluidische Gerät eine kontrolliertere Umgebung bietet, ermöglicht das größere Gerät Experimente über einen längeren Zeitraum oder die Verwendung natürlicher Bakteriengemeinschaften. Die Mikroskopiezählung mit hoher zeitlicher Auflösung in einem speziellen Bereich wird verwendet, um BTC im PDMS-basierten mikrofluidischen Gerät zu erhalten. Um die Anzahl der Zellen für die BTC-Modellierung vom PMMA-basierten Gerät zu erhalten, führen wir einen selbstkonstruierten automatisierten Flüssigkeitsspender in Kombination mit Durchflusszytometrie ein. Bei diesem Setup passieren die Zellen das Fluidgerät und werden nacheinander in 96 Brunnenplatten abgegeben. Die zeitliche Auflösung wird durch das minimale Volumen, das genau abgegeben werden kann, und damit die mittlere Durchflussrate durch das Fluidgerät eingeschränkt. Fixativ in den Brunnen verhindert Wachstum und erleichtert DIE DNA-Färbung für die nachgeschaltete strömungszytometrische Enumeration. Um das Bakterienwachstum bei Transportexperimenten zu verhindern, verwenden wir einen minimalen mittelmäßigen Motilitätspuffer.
Da Protokolle zur Herstellung von Fluidgeräten in verschiedenen Maßstäben leicht verfügbar sind, führen wir nur kurz die Techniken zur Herstellung solcher Geräte ein und konzentrieren uns vielmehr auf die experimentellen Verfahren zur Aufzeichnung von BTCs. In ähnlicher Weise gibt es verschiedene Routinen für die zytometrische Aufzählung von Mikroben durch die Durchfluss- und Benutzer benötigen Expertenwissen, um die ergebnisse zu interpretieren, die durch die Durchflusszytometrie erzielt werden. Wir berichten über den neuartigen Einsatz von mikrofluidischen Geräten in Kombination mit mikroskopischer Bildgebung, um BTCs von fluoreszierend markierten Zellen aufzuzeichnen. Auf der Porenskala werden lokale Geschwindigkeiten und Flugbahnen mittels Bildverarbeitung ermittelt. Darüber hinaus zeigen wir den Einsatz eines PMMA-basierten Fluidgeräts in Kombination mit strömungszytometrischer Zählung, um den bakteriellen Transport von motilen und nicht-motilen Zellen in porösen Umgebungen zu beobachten, die durch einen nativen Strombiofilm besiedelt sind.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastomer Sylgard 184</td>
			<td>Dowsil</td>
			<td>101697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer NovoCyte</td>
			<td>Acea</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit</td>
			<td>makeblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axio Imager</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope AxioZoom v16</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 75 mm &#215; 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 3 peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma bonder Corona SB</td>
			<td>BlackHole Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump New Era NE 4000</td>
			<td>New Era</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF31SA universal milling machine</td>
			<td>Mikron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales

Das Verständnis des Transports, der Dispersion und der Ablagerung von Mikroorganismen in porösen Medien ist eine komplexe wissenschaftliche Aufgabe, die so unterschiedliche Themen wie Hydrodynamik, Ökologie und Umwelttechnik umfasst. Die Modellierung des bakteriellen Transports in porösen Umgebungen in unterschiedlichen räumlichen Maßstäben ist entscheidend, um die Folgen des bakteriellen Transports besser vorherzusagen, doch aktuelle Modelle verfehlen es oft, von Labor zu Feldbedingungen zu skalieren. Hier stellen wir experimentelle Werkzeuge vor, um den bakteriellen Transport in porösen Medien in zwei räumlichen Maßstäben zu untersuchen. Ziel dieser Werkzeuge ist es, makroskopische Beobachtungen (wie Durchbruchkurven oder Abscheidungsprofile) von Bakterien zu erhalten, die in transparente poröse Matrizen injiziert werden. Im kleinen Maßstab (10-1000 m) werden mikrofluidische Geräte mit optischer Videomikroskopie und Bildverarbeitung kombiniert, um bahnbrechende Kurven zu erhalten und gleichzeitig einzelne Bakterienzellen im Porenmaßstab zu verfolgen. In größerem Maßstab wird die Durchflusszytometrie mit einem selbstgebauten Roboterspender kombiniert, um bahnbrechende Kurven zu erhalten. Wir veranschaulichen den Nutzen dieser Werkzeuge, um besser zu verstehen, wie Bakterien in komplexen porösen Medien wie der hyporhoischen Zone von Strömen transportiert werden. Da diese Werkzeuge simultane Messungen über Skalen hinweg ermöglichen, ebnen sie den Weg für mechanismusbasierte Modelle, die für die Hochskalierung von entscheidender Bedeutung sind. Die Anwendung dieser Werkzeuge kann nicht nur zur Entwicklung neuartiger Biosanierungsanwendungen beitragen, sondern auch ein neues Licht auf die ökologischen Strategien von Mikroorganismen werfen, die poröse Substrate besiedeln.

Um die Funktionalität des vorgestellten Workflows zu veranschaulichen, führten wir Experimente mit dem gentechnisch veränderten Pseudomonas putida KT2440 durch, einem gramnegativen motile Bakterium, das für die Biosanierung und Biotechnologie wichtig ist. Gentechnisch veränderte Versionen dieses Stammes, die die GFP-Produktion ausdrücken, sind im Handel erhältlich. Ein nicht-motiler Stamm von P. putida KT2440, dem die relevanten strukturellen und regulatorischen G...

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Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

Durchbruchskurven (BTCs) sind effiziente Werkzeuge, um den Transport von Bakterien in porösen Medien zu untersuchen. Hier stellen wir Werkzeuge auf Basis von Fluidgeräten in Kombination mit Mikroskopie und Zytometrischer Durchflusszählung vor, um BTCs zu erhalten.

Kombination von Fluidic Devices mit Mikroskopie und Durchflusszytometrie zur Untersuchung des mikrobiellen Transports in porösen Medien über räumliche Skalen hinweg

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

Die Untersuchung des Transports von Bakterien in porösen Systemen ist im Hinblick auf Kontamination, Ausbreitung von Krankheiten und Biosanierung wichtig. Für diese Experimente in mathematischen Modellen, die an der Einzelzelle arbeiten, sind die Population und die mikrobielle Gemeinschaftsebene erforderlich. Hier stellen wir Werkzeuge zur Untersuchung des bakteriellen Transports mit mikrofluidischen Geräten und Mikroskopie sowie größerer Geräte in Kombination mit Durchflusszytometrie vor.Die Kombination von mikrofluidischen Geräten mit Mikroskopie und Durchflusszytometrie bietet eine Reihe von Möglichkeiten, bakterielle Transportphänomene in verschiedenen räumlichen Maßstäben zu untersuchen. Um dieses Protokoll vollständig zu erkunden, wird empfohlen, bereits Erfahrungen in der Mikroskopie, der grundlegenden Bildverarbeitung, dem Entwerfen mikrofluidischer Geräte und der Mastering-Flow-Zytometrie zu haben. Dieses Video beschreibt zwei Methoden, um den bakteriellen Transport in verschiedenen räumlichen Maßstäben zu untersuchen.Die erste Methode, die auf mikrofluidischen Geräten basiert, beruht auf der Mikroskopie, um einzelne Zellen zu zählen. Dieses System kann verwendet werden, um den bakteriellen Transport über mehrere räumliche Skalen von der Pore bis zur gesamten porösen Systemskala zu untersuchen. Die zweite Methode, mit größeren Fluidien, die an einen automatisierten Spender gekoppelt sind, und durchFlusszytometrie, kann verwendet werden, um bakterielle Transportphänomene in der Größenordnung ganzer poröser Systeme zu untersuchen.Solche Methoden können auch in Kolonstudien im Labormaßstab sowie in Kleinfelduntersuchungen eingesetzt werden. Entwerfen Sie zunächst die gewünschte poröse Geometrie, die aus einer Matrix von Kreisen besteht. Basierend auf der gewählten Geometrie, bereiten Sie eine Form mit Standard SU-8 Photolithographie.Bereiten Sie 50 Gramm PDMS vor, indem Sie 90 % Elastomer zu 10 % des Härtungsmittels zu 90 % des Elastomers in einem sauberen Einwegbehälter hinzufügen und die beiden Reagenzien mit einem sauberen Werkzeug vermischen. Tragen Sie ein Vakuum von 100 Millibar für 30 Minuten auf, um gelöste Luft und Blasen zu entfernen. Legen Sie die Form in eine Petrischale und gießen Sie das PDMS auf die gewünschte Höhe zwischen zwei und fünf Millimetern.Bedecken Sie die Petrischale mit einem Deckel und halten Sie sie mindestens vier Stunden bei 60 Grad Celsius. Danach lassen Sie das mikrofluidische Gerät auf Raumtemperatur abkühlen. Sobald es abgekühlt ist, entfernen Sie vorsichtig den gewünschten Teil von PDMS mit einem Skalpell.Versiegeln Sie vorübergehend den Boden des PDMS-Kanals mit Klebeband. Mit einem Stanzer mit einem Durchmesser von 0,5 Millimetern können Sie Kanäle durchbohren, um einen Einlass und einen Auslass zu erzeugen. Entfernen Sie das Band aus dem PDMS-Kanal und platzieren Sie den Kanal mit der porösen Seite nach oben.Behandeln Sie die Glasrutsche und PDMS-Oberflächen mit Plasma für jeweils ca. 45 Sekunden bei Raumtemperatur. Legen Sie den vorbehandelten PDMS-Kanal auf den vorbehandelten Glasschlitten und erhitzen Sie 30 Minuten lang bei 100 Grad Celsius auf einer Kochplatte, entfernen Sie dann das mikrofluidische Gerät von der Kochplatte und kühlen Sie es auf Raumtemperatur. Vakuum für 30 Minuten auftragen, um Luft von PDMS zu entfernen.Um die Basis zu erzeugen, die das Porenfach enthält, verwenden Sie hochpräzise Smicrofräsen, um 0,5 Millimeter von der Basis-PMMA-Schicht zu entfernen und eine Nut in der Größe von 1,1 mal 1,1 Millimetern für einen Gummi-O-Ring zu fräsen. Bohren Sie zwei Gewindebohrungen für einen Ein- und Auslass in den oberen Teil der Fluidvorrichtung und 12 Löcher für Schrauben. Dies dient als Deckel des Fluidgeräts.Nach der Reinigung des Fluidgeräts die Basis und den Deckel mit den 12 Gewindelöchern zusammenschrauben. Entfernen Sie das Mikrofluidaus vakuumfern und stellen Sie es auf die Mikroskopstufe. Verwenden Sie die Spritzenpumpe, um sie mit Motilitätspuffer zu sättigen.Passen Sie mit Brightfield-Mikroskopie oder Phasenkontrast die Vergrößerung an, um einzelne Bakterienzellen zu visualisieren und sich auf die Mitte des Beobachtungskanals zu konzentrieren. Schalten Sie die Lichtpfadeinstellungen auf Fluoreszenzmikroskopie um. Passen Sie den Fokus durch einen Offset und die Belichtungszeit der Kamera an, um einzelne Bakterienzellen aufzulösen.In diesem Fall 100 Millisekunden. Als nächstes legen Sie den Einlassschlauch in ein Zwei-Milliliter-Rohr ein, das die bakterielle Suspension enthält. Umkehren Sie die Pumpenrichtung und beginnen Sie mit dem Zurückziehen der Suspension mit einer Durchflussrate von einem Mikroliter pro Minute.Scannen Sie den Querschnitt des gesamten Beobachtungskanals und zeichnen Sie jede Minute ein Bild auf. Importieren Sie Bilder auf eine gewünschte Softwareplattform. Zeichnen Sie den Hintergrund als Durchschnitt der ersten Bilder auf, wenn keine Partikel aufgezeichnet wurden.Subtrahieren Sie den Hintergrund von jedem Bild, um Kamerageräusche und optische Aberrationzuentfernen. Schneiden Sie die Bilder in eine Region von Interesse. Identifizieren Sie einen Schwellenwert, der der Zellfluoreszenzpixelintensität entspricht, sodass Werte, die größer als der Schwellenwert sind, bakterielle Zellen enthalten.Verwenden Sie die Bildverarbeitung, um den Schwellenwert von jedem Bild zu subtrahieren. Binarisieren Sie das resultierende Bild so, dass Bakterienzellen einen Wert von eins annehmen, während der Hintergrund den Wert Null annimmt. Entfernen Sie Pixelcluster mit einer Fläche, die kleiner als die kleinste bakterielle Zellengröße in Pixeln ist.Summieren Sie das binarisierte Bild, um die Gesamtzahl der Pixel der verbleibenden Cluster abzuerhalten. Teilen Sie die Anzahl der Pixel durch die durchschnittliche Größe einer Bakterienzelle in Pixel, um eine Schätzung der Anzahl der Zellen zu erhalten. Verwandeln Sie die Zählungen in Partikel pro Milliliter in Konzentration.Um die Konzentration der injizierten bakteriellen Suspension zu identifizieren, injizieren Sie die bakterielle Suspension mit einer Spritze in den Beobachtungskanal einer sauberen mikrofluidischen Vorrichtung. Zeichnen Sie das Bild auf und berechnen Sie die in fluent bakterielle Konzentration, wie zuvor gezeigt. Visualisieren Sie Durchbruchskurven, indem Sie die bakterielle Konzentration C mit der zufließenden bakteriellen Konzentration C0 normalisieren und C über C0 im Vergleich zur Zeit zeichnen.Um die lokalen Geschwindigkeiten und Flugbahnen von Bakterien zu analysieren, die durch die poröse Matrix transportiert werden, bewegen Sie die Mikroskopstufe in einen Bereich von Interesse und passen Sie den Fokus an die Mitte des mikrofluidischen Geräts an. Stellen Sie die optische Konfiguration auf Phasenkontrast- oder Fluoreszenzmikroskopie ein. Zeichnen Sie Zeitrafferbilder und eine Belichtungszeit auf, die kurz genug ist, um bakterielle Verschiebungen zu erfassen.In diesem Fall 50 Millisekunden. Zeichnen Sie Bilder über einen ausreichenden Zeitraum auf, z. B. drei Minuten. Um Rauschen von jedem Bild zu entfernen, subtrahieren Sie den Hintergrund, der der Durchschnitt der Summe aller aufgezeichneten Bilder ist.Bestimmen Sie den Modul des numerischen Farbverlaufs und normalisieren Sie ihn anhand seines Maximalwerts. Suchen und aufzeichnen Sie bakterielle Koordinaten und den Zeitpunkt der Bildaufnahme in einer dreispaltigen Datei. Führen Sie partikelverfolgungsanalysen durch, um die aufgezeichneten Daten zu verarbeiten und die Flugbahnen zu berechnen.Um Ablagerungsprofile zu erhalten, zeichnen Sie ein zusammengesetztes Bild des gesamten porösen Kanals vor, d. h. den Hintergrund, und nach der Injektion der bakteriellen Suspension durch das mikrofluidische Gerät auf. Entfernen Sie den Hintergrund aus den Bildern, die nach der bakteriellen Injektion aufgenommen wurden. Berechnen Sie das Abscheidungsprofil D als Summe des bakteriellen Fluoreszenzsignals entlang transversaler Abschnitte der Länge x des porösen Kanals.Visualisieren Sie das Abscheidungsprofil als lokales Fluoreszenzsignal im Vergleich zur porösen Kanallänge. Um den automatisierten Spender einzurichten, stellen Sie den Roboterspender in der Nähe des Fluidgeräts auf. Schließen Sie den Roboterspender an den Computer mit BCNC an, und identifizieren Sie den richtigen Com-Port.Klicken Sie in BCNC auf die Home-Taste, um den Roboterspender in die Home-Position zurückzubekommen. Verbinden Sie die Peristaltikpumpe mit dem Einlass mit 50 Zentimeter langen Schläuchen mit einem Millimeter Innendurchmesser und den Abfluss mit dem automatisierten Spender mit dem gleichen Schlauch. Pumpenanbaumedium durch das Fluidgerät.Beachten Sie die Ankunft des Mediums an den am Roboterspender befestigten Auslassschläuchen und legen Sie eine 96-Well-Platte, die den Abfluss sammelt. Gleichzeitig aktivieren Sie den Roboterspender und injizieren Sie die bakterielle Suspension durch das PMMA Fluidgerät mit einer Durchflussrate von 0,2 Milliliter pro Minute. Injektion bakterielle Suspension entsprechend mehreren Porenvolumen.Zum Beispiel das 30-fache des Volumens des Fluidgeräts. Wechseln Sie nach der Injektion auf steriles Anbaumedium bis zum Ende des Experiments. Sobald eine 96-Well-Platte fertig ist, bedecken Sie die Platte und lagern Sie bei vier Grad Celsius bis zur Strömungszytometrie-Analyse.Analysieren Sie Proben mit Durchflusszytometrie und visualisieren Sie Durchbruchkurven, indem Sie die bakterielle Konzentration C mit der influenten bakteriellen Konzentration C0 normalisieren und C über C0 im Vergleich zur Zeit zeichnen. In dieser Studie wurden sowohl mit motilen als auch mit nicht-motilen Pseudomonas putida KT2440 sequentielle Experimente an mikrofluidischen PDMS-Geräten mit einer zufälligen Reihe von Säulen durchgeführt. Hier werden Durchbruchkurven, die auf die Konzentration der injizierten Zellen normalisiert wurden, sowie bakterielle Bahnen im Porenmaßstab gezeigt.Experimente mit großflächigen Fluidgeräten, die aus PMMA gefräst wurden, wurden ebenfalls durchgeführt. Motile und nicht-motile Pseudomonas putida KT2440 wurden in eine regelmäßig verteilte poröse Matrix injiziert. Auffallend ist, dass in einer porösen Umgebung ohne Biofilm motile und nicht-motile Pseudomonas putida KT2440 ein deutlich anderes Transportverhalten auf der Grundlage von Durchbruchkurven zeigte.In einer porösen Matrix, die 48 Stunden lang mit einer komplexen Flussbiofilmgemeinschaft kolonisiert wurde, verschwanden diese Unterschiede in den Durchbruchskurven zwischen motiler und nicht-motiler Pseudomonas putida KT2440. Wir verwenden dieses System, um bakterielle Transport in den Strömen zu untersuchen, aber diese Werkzeuge können leicht angepasst werden, um bakterielle Transportphänomene in anderen technischen und Umweltsystemen zu studieren. Bakterielle Transport durch hydratisierte poröse Medien verkapseln Prozesse über mehrere räumliche Skalen.Die hier vorgestellte Methodik ermöglicht es, die lokale Verdrängung von Bakterien auf der Porenskala mit dem mikroskopischen Transport am gesamten porösen Medium zu verknüpfen.

Research

JoVE Journal

Environment

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Herstellung und Prüfung von impedanzbasierten Fluidic Biochips mit RTgill-W1 Zellen für die schnelle Auswertung von Trinkwasserproben für Toxizität

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Forschung

Umwelt

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Extraktion und Analyse von Microbial Phospholipidfettsäuren in Böden

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems (PEMS) for the Real-driving Emissions (RDE) Regulation in Europe

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems PEMS for the Real-driving Emissions RDE Regulation in Europe

Die Umsetzung von transportabler Emissionsmesssysteme (PEMS) für die Echtzeit-Fahr Emissionen (RDE) Regulierung in Europa

Vehicles are tested in controlled and relatively narrow laboratory conditions to determine their official emission values and reference fuel consumption. ...

Using Pharmacological Manipulation and High-precision Radio Telemetry to Study the Spatial Cognition in Free-ranging Animals

Mit Pharmakologische Manipulation und Hochpräzisions-Radiotelemetrie die Spatial Cognition in frei lebenden Tiere zu studieren

An animal&#39;s ability to perceive and learn about its environment plays a key role in many behavioral processes, including navigation, migration, ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

Dispersion von Nanomaterialien in wässrigen Medien: zur Protokoll-Optimierung

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Microfluidic Devices for Characterizing Pore-scale Event Processes in Porous Media for Oil Recovery Applications

Mikrofluidische Geräte zur Charakterisierung von Pore angelegte Veranstaltung Prozesse in porösen Medien für Öl-Recovery-Anwendungen

Microfluidic devices are versatile tools for studying transport processes at a microscopic scale. A demand exists for microfluidic devices that are ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Charakterisierung der aquatischen Biofilme mit Durchflusszytometrie

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Metal Corrosion and the Efficiency of Corrosion Inhibitors in Less Conductive Media

Metallkorrosion und die Effizienz von Korrosionsinhibitoren in weniger leitfähigen Medien

Material corrosion can be a limiting factor for different materials in many applications. Thus, it is necessary to better understand corrosion processes, ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Isolierung und Analyse der mikrobiellen Lebensgemeinschaften im Boden, Rhizosphäre und Wurzeln in mehrjährige Grass Experimente

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Characterizing Microbiome Dynamics ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œ Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Kennzeichnenden Microbiome Dynamik – Durchflusszytometrie basierten Workflows von Reinkulturen zu natürlichen Gemeinschaften

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...