Name: combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales
Uploaded: 2020-11-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales at JoVE.com

אנו מכירים את עזרתו של אנטואן וידמר עם ההתקנה של המתקן הרובוטי dispenser.py תסריט.

1. תנאי תרבות חיידקים
<ol><li>עובד תחת מכסה המנוע זרימה למינאר, להשתמש 100 μL של מלאי גליצרול של GFP מתויג פסאודומונס putida KT2440 (1 × 107 mL-1,מאוחסן ב -80 ° C) כדי לחסן 5 מ"ל של לוריה-Bertani (LB) בינוני. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס תוך כדי רעד ב 250 סל"ד לילה.</li>
	<li>למחרת, resuspend 100 μL של תרבות הלילה ב 5 מ"ל LB בי?...

<ol>
	<li>Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+and+removal+of+pathogenic+bacteria+in+wastewater+percolating+through+porous+media:+a+review.">Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review.</a> Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).</li><li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues.">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li><li>Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processes+in+microbial+transport+in+the+natural+subsurface.">Processes in microbial transport in the natural subsurface.</a> Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).</li><li>Tufenkji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+microbial+transport+in+porous+media:+Traditional+approaches+and+recent+developments.">Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments.</a> Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).</li><li>Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+modelling+straining+of+Escherichia+coli+in+saturated+porous+media.">Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media.</a> Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).</li><li>Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+and+biogeochemistry+of+stream+biofilms.">The ecology and biogeochemistry of stream biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).</li><li>Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+biophysical+underpinnings+to+the+success+of+multispecies+biofilms+in+porous+environments.">Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments.</a> The ISME Journal. 1, (2019).</li><li>Carrel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+in+3D+porous+media:+Delineating+the+influence+of+the+pore+network+geometry,+flow+and+mass+transfer+on+biofilm+development.">Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development.</a> Water Research. 134, 280-291 (2018).</li><li>Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+hopping+and+trapping+in+porous+media.">Bacterial hopping and trapping in porous media.</a> Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).</li><li>Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trait-specific+dispersal+of+bacteria+in+heterogeneous+porous+environments:+from+pore+to+porous+medium+scale.">Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale.</a> Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).</li><li>Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+preferential+flow+paths+perpetuated+by+microbial+activity+in+the+soil+matrix?+A+review.">Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review.</a> Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).</li><li>Creppy, A., Cl&#233;ment, E., Douarche, C., D'Angelo, M. V., Auradou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+motility+on+the+transport+of+bacteria+populations+through+a+porous+medium.">Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium.</a> Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).</li><li>Camesano, T. A., Logan, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Fluid+Velocity+and+Cell+Concentration+on+the+Transport+of+Motile+and+Nonmotile+Bacteria+in+Porous+Media.">Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media.</a> Environmental Science &amp; Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).</li><li>Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+surface+characteristics+on+the+transport+of+multiple+Escherichia+coli+isolates+in+large+scale+columns+of+quartz+sand.">The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand.</a> Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).</li><li>Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+biofilm+on+bacterial+transport+and+deposition+in+porous+media.">Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media.</a> Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).</li><li>Long, T., Ford, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Transverse+Migration+of+Bacteria+by+Chemotaxis+in+a+Porous+T-Sensor.">Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor.</a> Environmental Science &amp; Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).</li><li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+Expanding+the+Frontiers+of+Microbial+Ecology.">Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology.</a> Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Digital+Video+Microscopy+for+Colloidal+Studies.">Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+determination+of+bacterial+abundance+in+lake+plankton+with+the+green+nucleic+acid+stain+SYTO+13.">Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13.</a> Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).</li></ol>

כאן אנו מציעים שני אמצעים ללמוד את ההובלה של חיידקים באמצעות מערכות נקבוביות ברמת תא יחיד ואוכלוסייה. בעוד המחקר של תופעות תחבורה באמצעות מידול BTC סיפק תובנות יקרות ערך להתפשטות של פתוגנים או מזהמים בקנה מידה של המערכת האקולוגית, קשיים בקנה מידה מניסויי מעבדה לתנאי שדה עדיין קיימים. הכלים...

מחקרים שמטרתם להבין את ההובלה של חיידקים באמצעות מדיה נקבובית היו מונעים בעיקר עלידי חששות של זיהום 1, השידור של מחלה2 ותיקון ביולוגי3. בהקשר זה, חיידקים טופלו בעיקר כחלקיקים במודליםתחבורה 4 ותהליכים כגון סינון, מאמץ, יישוב כבידתי או remobilization מ biofilms זוהו כנהגים של שמירה או הובלה של חיידקים5. עם זאת, לימוד התחבורה של חיידקים באמצעות נופים נקבוביים יכול גם ליידע אותנו על האסטרטגיות האקולוגיות שבבסיס הצלחתם בסביבות מורכבות אלה. עם זאת, זה דורש ניסויים חדשניים ומודלים מתמטיים הפועלים ברמת התא היחיד, האוכלוסייה או הקהילה המיקרוביאלית.
סביבות נקבוביות טבעיות, כגון אלה שנמצאו באזור ההיפורי של נחלים ונהרות, מתיישבות בצפיפות על ידי קהילות מגוונות של חיידקים יוצרי ביופילם6. Biofilms יוצרים מבנים המ משנים את הזרימה ולכן הובלה ופיזור של חיידקים בשלבנוזלי 7,8. הובלת חיידקים בקנה מידה נקבוביות תלויה בזמינות החלל מוגבלת במטריקס נקבובי ופיזור הקשורות לתנוניות עשוי להיות דרך יעילה כדי להגדיל את הכושר הפרט באמצעות תחרות מופחתת על משאבים באזורים מאוכלסים פחות בצפיפות. מצד שני, חיידקים מוטיב יכולים גם להגיע לאזורים מבודדים יותר של המטריצה הנקבובית, והחקירה המורחבת של אזורים כאלה עשויה לספק הזדמנויות אקולוגיות לאוכלוסיות10. בקנה מידה מרחבי גדול יותר, צמיחת biofilm מסיט את נתיבי הזרימה גם מוביל (חלקי) סתימת נקבוביות, ובכך, להקמת תנאי זרימה מתועלים והטרוגנייםעוד יותר 11. זה יש השלכות על אספקת חומרים מזינים וקיבולת פיזור, תדירות ומרחק. זרימה מועדף, למשל, יכול ליצור מה שנקרא "מסלולים מהירים" וחיידקים מוטיב יכולים להגיע למהילות גבוהות עוד יותר מאשר הזרימה המקומיתלאורך מסלולים אלה 12. זוהי דרך יעילה להגביר את חקר בתי גידול חדשניים.
מגוון כלים מועילים לחקר הובלת חיידקים צייתנים ולא מוטיבים (וחלקיקים) במדיה נקבובית. מודלים מספריים יש יכולות חיזוי גדול חשוב עבור יישומים, עם זאת מוגבלים לעתים קרובות על ידי הנחות הטבועות4. ניסויים בקנה מידהמעבדה 13,14 בשילוב עם מידול עקומה פריצת דרך (BTC) סיפקו תובנות חשובות בחשיבות של תכונות פני תא חיידקי עבורדבק יעילות 15. בדרך כלל, BTCs (כלומר, סדרת פעמים של ריכוז חלקיקים במיקום קבוע) מתקבלים באמצעות מהדורות קצב קבוע ומדידה של מספרי תאים בזרימה של המכשיר הניסיוני. בהקשר זה, BTCs משקפים את הדינמיקה של אדו-פיזור חיידקים במטריקס הנקבובי ותורחב על ידי מונח כיור חשבונאות עבור קובץ מצורף. עם זאת, מידול של BTCs לבד אינו פותר את התפקיד של ארגון מרחבי של המצע נקבובי או biofilm עבור תהליכי תחבורה. נצפים מאקרוסקופיים אחרים כמו פרופילי פיזור או תצהיר הוכחו כמספקים מידע חשוב על ההתפלגות המרחבית או על החלקיקים השמורים או על הקהילות הגדלות. מיקרו-נוזלים היא טכנולוגיה המאפשרת לימוד תחבורה במדיה נקבובית על ידיחקירת מיקרוסקופ 9,12,16, וחוץמעבודה אחרונה 10, מערכות ניסיוניות מוגבלות בדרך כלל בקנה מידה אורך אחד של רזולוציה, כל כך, סולם הנקבוביות או סולם המכשיר הנוזלי כולו.
כאן, אנו מציגים סוויטה של שיטות משולבות כדי ללמוד את ההובלה של חיידקים מוטיב ולא מוטיב בנופים נקבוביים בקנה מידה שונים. אנו משלבים תצפיות של תחבורה חיידקית בקנה מידה נקבוביות עם מידע בקנה מידה גדול יותר, באמצעות ניתוח BTC. התקנים מיקרו-נוזלים הבנויים מליתוגרפיה רכה באמצעות פולידימטילסילוקסן (PDMS) תואמים ביולוגית, עמידים בפני מגוון כימיקלים, מאפשרים שכפול בעלויות נמוכות ומספקים שקיפות אופטית מצוינת, כמו גם פלואורסצינטי נמוך קריטי לתצפית מיקרוסקופית. מיקרו-נוזלים המבוססים על PDMS שימשו בעבר לחקר ההובלה של חיידקים בערוצים פשוטים17 או בגיאומטריות מורכבות יותר12. עם זאת, בדרך כלל ניסויים מיקרו-נוזלים מתמקדים באופקים לטווח קצר והתבוננות מיקרוסקופית אפינפרין-פלואורסצי של תאים חיים מוגבלת בדרך כלל זנים מהונדסים גנטית (למשל, זנים מתויגים GFP). כאן אנו מציגים כלים לחקר תחבורה חיידקית באמצעות התקנים מיקרו-נוזלים מבוססי PDMS בשילוב עם מיקרוסקופיה והתקנים גדולים יותר מפוברקים מפולי (מתיל methacrylate) (PMMA, המכונה גם פרספקס) בשילוב עם ציתום זרימה. PDMS ו PMMA שונים חחלנות גז ומאפייני פני השטח, ובכך מתן הזדמנויות משלימות ללמוד תחבורה חיידקים. בעוד המכשיר microfluidic מספק סביבה מבוקרת יותר, המכשיר הגדול מאפשר ניסויים על פני פרקי זמן ממושכים או באמצעות קהילות חיידקים טבעיים. ספירת מיקרוסקופים ברזולוציה זמנית גבוהה באזור ייעודי משמשת להשגת BTC בהתקן מיקרו-נוזלים מבוסס PDMS. כדי להשיג ספירות תאים עבור מידול BTC מהתקן מבוסס PMMA, אנו מציגים מתקן נוזלי אוטומטי שנבנה באופן עצמאי בשילוב עם ציתום זרימה. בהתקנה זו, תאים לעבור את המכשיר הנוזלי והם מחולקים ברצף לתוך 96 צלחות באר. רזולוציית הזמן מוגבלת על ידי נפח מינימלי שניתן לחלק במדויק ולכן קצב הזרימה הבינוני דרך המכשיר הנוזלי. קיבעון בארות מונע צמיחה ומקל על כתמי DNA לתפיכת זרימה-ציטומטרית במורד הזרם. כדי למנוע צמיחה חיידקית במהלך ניסויי תחבורה אנו משתמשים במדיום מינימלי (מוזמן מאגר תנועתיות).
מאז פרוטוקולים להכנת התקנים נוזליים בקנה מידה שונים זמינים, אנו רק לזמן קצר להציג את הטכניקות כדי לייצר מכשירים כאלה ולא להתמקד בהליכים ניסיוניים כדי להקליט BTCs. באופן דומה, שגרות שונות קיימות עבור תקרת זרימה ציטוטית של חיידקים ומשתמשים דורשים ידע מומחה כדי לפרש תוצאות שהושגו על ידי ציטומטריית זרימה. אנו מדווחים על השימוש החדשני במכשירים מיקרו-נוזלים בשילוב עם הדמיה מיקרוסקופית כדי להקליט BTCs של תאים מתויגים פלורסנט. בסולם הנקבוביות, מהומות מקומיות ומסלולים מתקבלים באמצעות עיבוד תמונה. יתר על כן, אנו מדגימים את השימוש במכשיר נוזלי מבוסס PMMA בשילוב עם זרימה-ציטומטרית ספירה כדי לצפות הובלה חיידקים של תאים מוטיב ולא מוטיב בסביבות נקבוביות התיישבו על ידי biofilm זרם מקורי.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastomer Sylgard 184</td>
			<td>Dowsil</td>
			<td>101697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer NovoCyte</td>
			<td>Acea</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit</td>
			<td>makeblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axio Imager</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope AxioZoom v16</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 75 mm &#215; 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 3 peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma bonder Corona SB</td>
			<td>BlackHole Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump New Era NE 4000</td>
			<td>New Era</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF31SA universal milling machine</td>
			<td>Mikron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales

הבנת ההובלה, הפיזור והתצהיר של מיקרואורגניזמים במדיה נקבובית היא משימה מדעית מורכבת הכוללת נושאים מגוונים כמו הידרודינמיקה, אקולוגיה והנדסה סביבתית. מידול תחבורה חיידקית בסביבות נקבוביות בקנה מידה מרחבי שונה הוא קריטי כדי לחזות טוב יותר את ההשלכות של תחבורה חיידקים, עדיין מודלים נוכחיים לעתים קרובות להיכשל בקנה מידה ממעבדה לתנאי שדה. כאן, אנו מציגים כלים ניסיוניים לחקר תחבורה חיידקית במדיה נקבובי בשני קשקשים מרחביים. מטרתם של כלים אלה היא להשיג התבוננות מאקרוסקופית (כגון עקומות פורצות דרך או פרופילי תצהיר) של חיידקים המוזרקים למטריצות נקבוביות שקופות. בקנה מידה קטן (10-1000 μm), התקנים מיקרו-נוזלים משולבים עם וידאו אופטי-מיקרוסקופי ועיבוד תמונה כדי להשיג עקומות פורצות דרך, ו, באותו זמן, כדי לעקוב אחר תאים חיידקיים בודדים בקנה המידה הנקבוביות. בקנה מידה גדול יותר, ציתום זרימה משולב עם מתקן רובוטי מעשה עצמי כדי להשיג עקומות פורצות דרך. אנו ממחישים את התועלת של כלים אלה כדי להבין טוב יותר כיצד חיידקים מועברים במדיה נקבובי מורכבת כגון האזור hyporheic של נחלים. מכיוון שכלים אלה מספקים מדידות בו-זמנית על-פני סולמות, הם סוללים את הדרך למודלים מבוססי מנגנון, החשובים ביותר לצורך upscaling. יישום של כלים אלה עשוי לא רק לתרום לפיתוח יישומים חדשניים לשיקום ביולוגי, אלא גם לשפוך אור חדש על האסטרטגיות האקולוגיות של מיקרואורגניזמים ליישב מצעים נקבוביים.

כדי להמחיש את הפונקציונליות של זרימת העבודה המוצגת, ביצענו ניסויים באמצעות פסאודומונס putida putida KT2440, חיידק מוטיב שלילי גרם חשוב עבור ביו-מדייה וביוטכנולוגיה. גרסאות מהונדסות גנטית של זן זה המבטאות את ייצור GFP זמינות מסחרית. זן שאינו מוטיב של P. putida KT2440 אשר חסר את הג...

Watch this Scientific Journal Video about Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales at JoVE.com

Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

עקומות פורצות דרך (BTCs) הן כלים יעילים לחקר הובלת חיידקים במדיה נקבובית. כאן אנו מציגים כלים המבוססים על התקנים נוזליים בשילוב עם מיקרוסקופיה וספירת ציטומטרית זרימה כדי להשיג BTCs.

שילוב התקנים נוזליים עם מיקרוסקופיה וציתום זרימה לחקר תחבורה מיקרוביאלית במדיה נקבובית על פני קשקשים מרחביים

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

לימוד הובלת חיידקים במערכות נקבוביות חשוב בכל הנוגע לזיהום, התפשטות מחלות ושיקום ביולוגי. עבור ניסויים אלה במודלים מתמטיים הפועלים בתא יחיד, האוכלוסייה ואת רמת הקהילה המיקרוביאלית נדרשים. כאן אנו מציגים כלים לחקר הובלת חיידקים באמצעות מכשירים מיקרופלואידיים ומיקרוסקופיה, כמו גם מכשירים גדולים יותר בשילוב עם ציטומטריית זרימה.השילוב של מכשירים מיקרופלואידיים עם מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה מציע מגוון אפשרויות לחקר תופעות תחבורה חיידקית בקנה מידה מרחבי שונה. על מנת לחקור באופן מלא פרוטוקול זה, הוא הציע יש ניסיון קודם במיקרוסקופיה, עיבוד תמונה בסיסי, תכנון התקנים microfluidic, ו cytometry זרימה שליטה. סרטון זה מתאר שתי שיטות לחקר הובלת חיידקים בקנה מידה מרחבי שונה.השיטה הראשונה, המבוססת על מכשירים מיקרופלואידיים, מסתמכת על מיקרוסקופיה לספירת תאים בודדים. מערכת זו יכולה לשמש לחקר הובלת חיידקים על פני קשקשים מרחביים מרובים מן הנקבוביות לסקאלה המערכת הנקבובית כולה. השיטה השנייה, באמצעות מכשירים נוזליים גדולים יותר יחד עם מתקן אוטומטי ציטומטריה זרימה, ניתן להשתמש כדי לחקור תופעת תחבורה חיידקית בקנה מידה של מערכות נקבוביות שלמות.שיטות כאלה ניתן לפרוס גם במחקרי עמודות בקנה מידה מעבדה, כמו גם סקרי שדה קטנים. ראשית, תכנן את הגיאומטריה הנקבובית הרצויה המורכבת מטריצה של עיגולים. בהתבסס על הגיאומטריה שנבחרה, הכינו תבנית באמצעות פוטוליתוגרפיה סטנדרטית SU-8.הכן 50 גרם של PDMS על ידי הוספת 90% של אלסטומר ל 10% של ריפוי סוכן ל 90% של אלסטומר לפי משקל במיכל חד פעמי נקי ומערבבים את שני reagents עם כלי נקי. החל ואקום של 100 מיליבר במשך 30 דקות כדי להסיר אוויר מומס בועות. מניחים את התבנית לתוך צלחת פטרי ויוצקים את PDMS על התבנית לגובה הרצוי בין שניים לחמישה מילימטרים.מכסים את צלחת פטרי במכסה ולשמור אותו ב 60 מעלות צלזיוס לפחות ארבע שעות. לאחר מכן, לאפשר את המכשיר microfluidic להתקרר לטמפרטורת החדר. ברגע שהוא מקורר, להסיר בזהירות את החלק הרצוי של PDMS עם אזמל.לאטום באופן זמני את החלק התחתון של ערוץ PDMS עם קלטת. עם אגרוף בקוטר 0.5 מילימטר, פירס ערוצים כדי ליצור מפרץ ושקע. הסר את הקלטת מערוץ PDMS והצב את הערוץ כשהצד הנקבובי פונה כלפי מעלה.יש לטפל במגלשת הזכוכית ובמשטחי PDMS בפלזמה למשך כ-45 שניות כל אחד בטמפרטורת החדר. מניחים את ערוץ PDMS מטופל מראש על מגלשת זכוכית מטופלת מראש וחום ב 100 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות על צלחת חמה, ולאחר מכן להסיר את המכשיר microfluidic מהצלחת החמה לקרר אותו לטמפרטורת החדר. יש למרוח ואקום למשך 30 דקות להסרת אוויר מ-PDMS.כדי לייצר את הבסיס המכיל את תא הנקבוביות, השתמש בטחינת מיקרו בדיוק גבוה כדי להסיר 0.5 מילימטרים משכבת PMMA הבסיסית ולטחן חריץ בגודל של 1.1 על 1.1 מילימטרים עבור טבעת גומי O. לקדוח שני חורים מושחלים עבור inlet ושקע לתוך החלק העליון של המכשיר fluidic ו 12 חורים עבור ברגים. זה משמש כמכסה של המכשיר הנוזלי.לאחר ניקוי ההתקן הנוזלי, בורג את הבסיס ואת המכסה יחד באמצעות 12 חורים מושחלים. מוציאים את המיקרופלואידים מהוואקום ומ מניחים אותו על שלב המיקרוסקופ. השתמש במשאבת המזרק כדי להרוות אותו עם חיץ תנועתיות.באמצעות מיקרוסקופיה של Brightfield או ניגודיות פאזה, התאימו את ההגדלה כדי לדמיין תאים חיידקיים בודדים והתמקדו במרכז ערוץ התצפית. העבר את הגדרות נתיב האור למיקרוסקופיה פלואורסצנטית. התאם את המיקוד באמצעות היסט ותזמן החשיפה למצלמה כדי לפתור תאים חיידקיים בודדים.במקרה הזה, 100 אלפיות שנייה. לאחר מכן, הכנס את צינורות הכניסה לצינור של שני מיליליטר המכיל את ההשעיה החיידקית. הפוך את כיוון המשאבה ולהתחיל למשוך את המתלה בקצב זרימה של מיקרוליטר אחד לדקה.לסרוק את חתך רוחב של ערוץ התצפית כולו, הקלטת תמונה בכל דקה. יבא תמונות לפלטפורמת תוכנה רצויה. רשום את הרקע כממוצע של התמונות הראשונות כאשר לא נרשמו חלקיקים.הפחת את הרקע מכל תמונה כדי להסיר רעש מצלמה סטייה אופטית. חתוך את התמונות לאזור מעניין. זהה ערך סף השווה לעוצמת פיקסל הפלואורסצנטיות של התא כך ערכים הגדולים מהסף כוללים תאים חיידקיים.השתמש בעיבוד תמונה כדי להחסיר את ערך הסף מכל תמונה. הפוך את התמונה המתקבלת לערך של תא חיידקי, בעוד שהרקע מקבל ערך של אפס. הסר אשכולות של פיקסלים עם שטח קטן יותר מגודל התא החיידקי הקטן ביותר בפיקסלים.סכם את התמונה הבינארית כדי לקבל את המספר הכולל של פיקסלים באשכולות הנותרים. חלק את מספר הפיקסלים בגודל הממוצע של תא חיידקי בפיקסלים כדי לקבל הערכה של מספר התאים. להפוך את הספירות לריכוז בחלקיקים למיליליטר.כדי לזהות את הריכוז של ההשעיה החיידקית מוזרק, להזריק את ההשעיה החיידקית לתוך ערוץ התצפית של מכשיר microfluidic נקי עם מזרק. תקליטו את התמונה וחשבו את ריכוז החיידקים בשפעת כפי שהוצג קודם לכן. דמיינו עקומות פורצות דרך על ידי נרמול ריכוז החיידקים בשפך C עם ריכוז חיידקי מתקלף C0 ותכנון C מעל C0 לעומת הזמן.על מנת לנתח את המהירויות והמסלולים המקומיים של חיידקים שהועברו דרך המטריצה הנקבובית, להעביר את שלב המיקרוסקופ לאזור מעניין ולהתאים את המיקוד למרכז המכשיר המיקרופלואידי. הגדר את התצורה האופטית למיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה או פלואורסצנטיות. הקלט תמונות לשגות בזמן ותזמן חשיפה קצר מספיק כדי ללכוד תזוזה חיידקית.במקרה הזה, 50 אלפיות שנייה. הקלט תמונות במשך פרק זמן מספיק, לדוגמה שלוש דקות. להסרת רעש מכל תמונה, חיסור הרקע, שהוא ממוצע הסכום של כל התמונות המוקלטות.קבע את המודולוס של מעבר הצבע המספרי ונרמל אותו בערך המרבי שלו. חפש והקליט קואורדינטות חיידקים ואת הזמן של רכישת תמונה לתוך קובץ בן שלוש עמודות. בצע ניתוח מעקב חלקיקים כדי לעבד את הנתונים המוקלטים ול לחשב את המסלולים.כדי להשיג פרופילי תצהיר, להקליט תמונה מורכבת של הערוץ הנקבובי כולו לפני, זה הרקע, ולאחר הזרקה של ההשעיה חיידקי דרך המכשיר microfluidic. הסר רקע מהתמונות שנרשמו לאחר הזרקת חיידקים. לחשב את פרופיל התצהיר D כמו הסכום של אות פלואורסצנטי חיידקי לאורך קטעים רוחביים של אורך x של הערוץ הנקבובי.דמיין את פרופיל התצהיר כאות פלואורסצנטי מקומי לעומת אורך הערוץ הנקבובי. כדי להגדיר את המתקן האוטומטי, מקם את המתקן הרובוטי קרוב למכשיר הנוזלי. חבר את המתקן הרובוטי למחשב שבו פועל BCNC וזהה את יציאת com הנכונה.ב- BCNC, לחץ על לחצן הבית כדי להחזיר את המתקן הרובוטי למיקום הבית. חבר את המשאבה ההיסטלטית עם הפנימה באמצעות צינורות בקוטר פנימי באורך 50 ס"מ, צינורות בקוטר פנימי של מילימטר אחד, ואת הזרימה עם המתקן האוטומטי באמצעות אותו צינורות. מטפח משאבה בינוני דרך המכשיר הנוזלי.שימו לב להגעת המדיום לשקע הצינור הקבוע למתקן הרובוטי והכניסו צלחת של 96 באר שתאסוף את הזרימה. במקביל, להפעיל את המתקן הרובוטי ולהזריק את ההשעיה חיידקי דרך המכשיר נוזלי PMMA בקצב זרימה של 0.2 מיליליטר לדקה. להזריק השעיה חיידקית שווה ערך למספר כרכים נקבוביות.לדוגמה, פי 30 מנפח ההתקן הנוזלי. לאחר ההזרקה, עבור למדיום טיפוח סטרילי עד סוף הניסוי. לאחר השלמת צלחת 96 באר, לכסות את הצלחת ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס עד ניתוח ציטומטריה זרימה.לנתח דגימות עם cytometry זרימה לדמיין עקומות פריצת דרך על ידי נרמול ריכוז חיידקי קולחים C עם ריכוז חיידקי בשפעת C0 התוויית C מעל C0 לעומת הזמן. במחקר זה, באמצעות שני מוטילים ולא מוטילים Pseudomonas putida KT2440, ניסויים רציפים בוצעו במכשירים מיקרופלואידיים PDMS עם מערך אקראי של עמודים. עקומות פורצות דרך מנורמלות לריכוז של תאים מוזרקים, כמו גם מסלולים חיידקיים בסולם הנקבוביות מוצגים כאן.כמו כן בוצעו ניסויים בהתקנים נוזליים בקנה מידה גדול הטחונים מ-PMMA. מוטיב ולא מוטיבציה Pseudomonas putida KT2440 הוזרקו לתוך מטריצה נקבובית רווחים באופן קבוע. באופן מדהים, בסביבה נקבובית נטולת ביופילם, מוטיב ופסאודומונס ללא מוטיבציה putida KT2440 הראה התנהגות תחבורה שונה במידה ניכרת המבוססת על עקומות פורצות דרך.במטריצה נקבובית שהתיישבה במשך 48 שעות עם קהילת ביופילם זרם מורכבת, הבדלים אלה בעקומות פורצות דרך בין מוטיב לפסאודומונס שאינם מניעים פואידה KT2440 נעלמו. אנו משתמשים במערכת זו כדי לחקור הובלה חיידקית בנחלים, אך ניתן להתאים כלים אלה בקלות לחקר תופעות תחבורה חיידקית במערכות מהונדסות וסביבתיות אחרות. הובלה חיידקית באמצעות מדיה נקבובית hydrated encapsulate תהליכים על פני סולמות מרחביים מרובים.המתודולוגיה המוצגת כאן מאפשרת לקשר את התזוזה המקומית של חיידקים בסולם הנקבוביות לתחבורה המיקרוסקופית בכל המדיום הנקבובי.

Research

JoVE Journal

Environment

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

הכנה ובדיקה של עכבה מבוססי biochips fluidic עם תאים RTgill-W1 טוב ההערכה המהירה של שתייה דגימות מים עבור רעילות

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

הפקה וניתוח של פוספוליפידים מיקרוביאלית חומצות שומן בקרקעות

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems (PEMS) for the Real-driving Emissions (RDE) Regulation in Europe

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems PEMS for the Real-driving Emissions RDE Regulation in Europe

יישום פליטות ניידים מדידה מערכות (PEMS) עבור פליטות Real-נהיגה (RDE) תקנה באירופה

Vehicles are tested in controlled and relatively narrow laboratory conditions to determine their official emission values and reference fuel consumption. ...

Using Pharmacological Manipulation and High-precision Radio Telemetry to Study the Spatial Cognition in Free-ranging Animals

באמצעות מניפולציה תרופתית ו-דיוק גבוה טלמטריה רדיו לחקר הקוגניציה המרחבי בעלי חיים חינם היריעה

An animal&#39;s ability to perceive and learn about its environment plays a key role in many behavioral processes, including navigation, migration, ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

פיזור של ננו בתקשורת מימית: לקראת פרוטוקול אופטימיזציה

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Microfluidic Devices for Characterizing Pore-scale Event Processes in Porous Media for Oil Recovery Applications

מכשירי Microfluidic אפיון תהליכים אירוע בקנה מידה נקבובית בתקשורת נקבובי עבור יישומים התאוששות שמן

Microfluidic devices are versatile tools for studying transport processes at a microscopic scale. A demand exists for microfluidic devices that are ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

אפיון Biofilms ימיים עם Cytometry זרימה

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Metal Corrosion and the Efficiency of Corrosion Inhibitors in Less Conductive Media

מתכת קורוזיה ואת היעילות של מעכבי קורוזיה בתקשורת פחות מוליך

Material corrosion can be a limiting factor for different materials in many applications. Thus, it is necessary to better understand corrosion processes, ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

בידוד וניתוח של הקהילות מיקרוביאלית בקרקע, Rhizosphere ושורשים בניסויים עשב רב שנתי

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Characterizing Microbiome Dynamics ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œ Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

אפיון Microbiome Dynamics – Cytometry זרימה מבוסס זרימות עבודה מתרבויות טהור לקהילות טבעי

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...