Name: combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales
Uploaded: 2020-11-25T14:00:00
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Riconosciamo l'aiuto di Antoine Wiedmer con l'installazione del distributore robotico e la dispenser.py script.

1. Condizioni di coltura batterica
<ol><li>Lavorando sotto una cappa di flusso laminare, utilizzare 100 μL di uno stock di glicerolo di Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 mL-1,conservato a -80 °C) per inoculare 5 mL di mezzo Luria-Bertani (LB). Incubare a 30 °C mentre si trema a 250 giri/min durante la notte.</li>
	<li>Il giorno successivo, resospend 100 μL della coltura notturna in mezzo LB da 5 mL e incubare nelle stesse condizioni per 5h (fase esponenziale). Campionare un'aliquota...

<ol>
	<li>Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+and+removal+of+pathogenic+bacteria+in+wastewater+percolating+through+porous+media:+a+review.">Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review.</a> Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).</li><li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues.">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li><li>Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processes+in+microbial+transport+in+the+natural+subsurface.">Processes in microbial transport in the natural subsurface.</a> Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).</li><li>Tufenkji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+microbial+transport+in+porous+media:+Traditional+approaches+and+recent+developments.">Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments.</a> Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).</li><li>Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+modelling+straining+of+Escherichia+coli+in+saturated+porous+media.">Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media.</a> Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).</li><li>Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+and+biogeochemistry+of+stream+biofilms.">The ecology and biogeochemistry of stream biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).</li><li>Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+biophysical+underpinnings+to+the+success+of+multispecies+biofilms+in+porous+environments.">Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments.</a> The ISME Journal. 1, (2019).</li><li>Carrel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+in+3D+porous+media:+Delineating+the+influence+of+the+pore+network+geometry,+flow+and+mass+transfer+on+biofilm+development.">Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development.</a> Water Research. 134, 280-291 (2018).</li><li>Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+hopping+and+trapping+in+porous+media.">Bacterial hopping and trapping in porous media.</a> Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).</li><li>Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trait-specific+dispersal+of+bacteria+in+heterogeneous+porous+environments:+from+pore+to+porous+medium+scale.">Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale.</a> Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).</li><li>Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+preferential+flow+paths+perpetuated+by+microbial+activity+in+the+soil+matrix?+A+review.">Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review.</a> Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).</li><li>Creppy, A., Cl&#233;ment, E., Douarche, C., D'Angelo, M. V., Auradou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+motility+on+the+transport+of+bacteria+populations+through+a+porous+medium.">Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium.</a> Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).</li><li>Camesano, T. A., Logan, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Fluid+Velocity+and+Cell+Concentration+on+the+Transport+of+Motile+and+Nonmotile+Bacteria+in+Porous+Media.">Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media.</a> Environmental Science &amp; Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).</li><li>Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+surface+characteristics+on+the+transport+of+multiple+Escherichia+coli+isolates+in+large+scale+columns+of+quartz+sand.">The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand.</a> Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).</li><li>Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+biofilm+on+bacterial+transport+and+deposition+in+porous+media.">Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media.</a> Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).</li><li>Long, T., Ford, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Transverse+Migration+of+Bacteria+by+Chemotaxis+in+a+Porous+T-Sensor.">Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor.</a> Environmental Science &amp; Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).</li><li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+Expanding+the+Frontiers+of+Microbial+Ecology.">Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology.</a> Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Digital+Video+Microscopy+for+Colloidal+Studies.">Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+determination+of+bacterial+abundance+in+lake+plankton+with+the+green+nucleic+acid+stain+SYTO+13.">Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13.</a> Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).</li></ol>

Qui suggeriamo due mezzi per studiare il trasporto di microbi attraverso sistemi porosi a livello di singola cellula e popolazione. Mentre lo studio dei fenomeni di trasporto mediante modellazione BTC ha fornito preziose informazioni sulla diffusione di agenti patogeni o contaminanti su scala ecosistemica, esistono ancora difficoltà da scalare dagli esperimenti di laboratorio alle condizioni sul campo. Gli strumenti qui descritti consentono ai ricercatori di risolvere sperimentalmente le scale spaziali e temporali al fi...

Gli studi volti a comprendere il trasporto di microbi attraverso mezzi porosi sono stati principalmente guidati dapreoccupazioni di contaminazione 1,trasmissione dellamalattia 2 e biorimediazione3. A questo proposito, i batteri sono stati per lo più trattati come particelle neimodelli di trasporto 4 e processi come filtrazione, deformazione, sedimentazione gravitazionale o rimobilitazione da biofilm sono stati identificati come fattori di ritenzione o trasporto di microbi5. Tuttavia, studiare il trasporto di batteri attraverso paesaggi porosi può anche informarci sulle strategie ecologiche alla base del loro successo in questi ambienti complessi. Tuttavia, ciò richiede nuovi esperimenti e modelli matematici che operano a livello di singola cellula, popolazione o comunità microbica.
Gli ambienti porosi naturali, come quelli che si trovano nella zona iporeica di torrenti e fiumi, sono densamente colonizzati da diverse comunità di microbi biofilm-forming6. I biofilm formano strutture che modificano il flusso e quindi il trasporto e la dispersione dei batteri nella faseliquida 7,,8. Il trasporto di batteri su scala porosa dipende dalla limitata disponibilità di spazio nella matrice porosa e la dispersione legata alla motilità può essere un modo efficace per aumentare l'idoneità individuale attraverso una ridotta competizione per le risorse nelle aree meno densamente popolate. D'altra parte, i batteri motili possono anche raggiungere regioni più isolate della matrice porosa e l'esplorazione estesa di tali aree può fornire opportunità ecologiche alle popolazioni mobile10. Su scale spaziali più grandi, la crescita del biofilm devia i percorsi di flusso portando anche all'intasamento (parziale) dei pori e, quindi, alla creazione di condizioni di flusso ancora più canalizzate ed eterogenee11. Ciò ha conseguenze per l'approvvigionamento di nutrienti e la capacità di dispersione, la frequenza e la distanza. Il flusso preferenziale, ad esempio, può generare le cosiddette "corsie preferenziali" e i batteri motili possono raggiungere velocità ancora più elevate rispetto al flusso localelungo questi binari 12. Questo è un modo efficace per aumentare l'esplorazione di nuovi habitat.
Una varietà di strumenti si avvale dello studio del trasporto di batteri (e particelle) mobile e non mobile in mezzi porosi. I modelli numerici hanno grandi capacità predittive importanti per le applicazioni, tuttavia sono spesso limitati da ipotesi intrinseche4. Gli esperimenti su scaladi laboratorio 13,,14 combinati con la modellazione della curva di svolta (BTC) hanno fornito importanti spunti sull'importanza delle proprietà della superficie cellulare batterica per l'efficienza dell'incollaggio15. Tipicamente, i BTC (cioè, serie volte serie di concentrazione di particelle in un luogo fisso) sono ottenuti attraverso rilasci a velocità costante e misurazione del numero di cellule al deflusso del dispositivo sperimentale. In questo contesto, i BTC riflettono la dinamica di advezione-dispersione dei batteri nella matrice porosa e possono essere estesi da un termine di affondamento che rappresenta l'attaccamento. Tuttavia, la modellazione dei BTC da sola non risolve il ruolo dell'organizzazione spaziale del substrato poroso o del biofilm per i processi di trasporto. Altri osservabili macroscopici come la dispersività o i profili di deposizione hanno dimostrato di fornire informazioni importanti sulla distribuzione spaziale o sulle particelle trattenute o sulle comunità in crescita. La microfluidica è una tecnologia che consente di studiare il trasporto in mezzi porosi mediante indagine di microscopia9,12,16, e ad eccezione di un recente lavoro10, i sistemi sperimentali sono tipicamente vincolati a una singola scala di lunghezza di risoluzione, cioè la scala dei pori o l'intera scala del dispositivo fluido.
Qui, introduciamo una suite di metodi combinati per studiare il trasporto di batteri motili e non motili in paesaggi porosi su diverse scale. Combiniamo le osservazioni del trasporto batterico su scala dei pori con informazioni su larga scala, attraverso l'analisi BTC. I dispositivi microfluidici costruiti con litografia morbida utilizzando polidimetilsilossano (PDMS) sono bio-compatibili, resistenti a una vasta gamma di sostanze chimiche, consentono la replicabilità a bassi costi e forniscono un'eccellente trasparenza ottica e una bassa autofluorescenza critica per l'osservazione microscopica. La microfluidica a base di PDMS è stata precedentemente utilizzata per studiare il trasporto di microbi incanali semplici 17 o in geometrie più complesse12. Tuttavia, tipicamente gli esperimenti di microfluidica si concentrano su orizzonti a breve termine e l'osservazione microscopica dell'epi-fluorescenza delle cellule viventi è comunemente limitata a ceppi geneticamente modificati (ad esempio, ceppi taggati dalla GFP). Qui presentiamo strumenti per studiare il trasporto batterico utilizzando dispositivi microfluidici basati su PDMS in combinazione con microscopia e dispositivi più grandi fabbricati da poli (metacrilato metile) (PMMA, noto anche come plexiglass) in combinazione con citometria a flusso. PDMS e PMMA differiscono per permeabilità al gas e proprietà superficiali, offrendo così opportunità complementari per studiare il trasporto batterico. Mentre il dispositivo microfluidico fornisce un ambiente più controllato, il dispositivo più grande consente esperimenti per lunghi periodi di tempo o utilizzando comunità batteriche naturali. Il conteggio delle microscopie ad alta risoluzione temporale in un'area dedicata viene utilizzato per ottenere BTC nel dispositivo microfluidico basato su PDMS. Per ottenere il conteggio delle celle per la modellazione BTC dal dispositivo basato su PMMA, introduciamo un distributore automatico di liquidi autocostruito in combinazione con la citometria a flusso. In questa configurazione, le cellule passano il dispositivo fluido e vengono erogate consecutivamente in 96 piastre di pozzo. La risoluzione temporale è limitata dal volume minimo che può essere accuratamente eroso e quindi dalla portata media attraverso il dispositivo fluido. Il fissatore nei pozzi previene la crescita e facilita la colorazione del DNA per l'enumerazione citometrica a flusso a valle. Per prevenire la crescita batterica durante gli esperimenti di trasporto utilizziamo un mezzo minimo (termo buffer di motilità).
Poiché i protocolli per la preparazione di dispositivi fluidici su scale diverse sono prontamente disponibili, introduciamo solo brevemente le tecniche per produrre tali dispositivi e ci concentriamo piuttosto sulle procedure sperimentali per registrare i BTC. Allo stesso modo, esistono varie routine per l'enumerazione citometrica del flusso dei microbi e gli utenti richiedono conoscenze esperte per interpretare i risultati ottenuti dalla citometria del flusso. Reportiamo il nuovo uso di dispositivi microfluidici in combinazione con l'imaging microscopico per registrare I BTC di cellule con tag fluorescenti. Alla scala dei pori, le velocità e le traiettorie locali si ottengono attraverso l'elaborazione delle immagini. Inoltre, dimostriamo l'uso di un dispositivo fluido a base di PMMA in combinazione con il conteggio flusso-citometrico per osservare il trasporto batterico di cellule mobili e non mobili in ambienti porosi colonizzati da un biofilm a flusso nativo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastomer Sylgard 184</td>
			<td>Dowsil</td>
			<td>101697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer NovoCyte</td>
			<td>Acea</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit</td>
			<td>makeblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axio Imager</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope AxioZoom v16</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 75 mm &#215; 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 3 peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma bonder Corona SB</td>
			<td>BlackHole Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump New Era NE 4000</td>
			<td>New Era</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF31SA universal milling machine</td>
			<td>Mikron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales

Comprendere il trasporto, la dispersione e la deposizione di microrganismi nei mezzi porosi è un compito scientifico complesso che comprende argomenti diversi come l'idrodinamica, l'ecologia e l'ingegneria ambientale. La modellazione del trasporto batterico in ambienti porosi su diverse scale spaziali è fondamentale per prevedere meglio le conseguenze del trasporto batterico, ma i modelli attuali spesso non riescono a scalare da laboratorio a condizioni sul campo. Qui introduciamo strumenti sperimentali per studiare il trasporto batterico in mezzi porosi su due scale spaziali. Lo scopo di questi strumenti è quello di ottenere osservabili macroscopici (come curve rivoluzionarie o profili di deposizione) di batteri iniettati in matrici porose trasparenti. Su piccola scala (10-1000 μm), i dispositivi microfluidici sono combinati con la video-microscopia ottica e l'elaborazione delle immagini per ottenere curve rivoluzionarie e, allo stesso tempo, per tracciare singole cellule batteriche alla scala dei pori. Su scala più ampia, la citometria a flusso è combinata con un distributore robotico autoprofeso per ottenere curve rivoluzionarie. Illustriamo l'utilità di questi strumenti per capire meglio come i batteri vengono trasportati in complessi mezzi porosi come la zona iporeica dei corsi d'acqua. Poiché questi strumenti forniscono misurazioni simultanee su scale, aprono la strada a modelli basati su meccanismo, di fondamentale importanza per l'upscaling. L'applicazione di questi strumenti può non solo contribuire allo sviluppo di nuove applicazioni di biorimediazione, ma anche gettare nuova luce sulle strategie ecologiche dei microrganismi che colonizzano substrati porosi.

Per illustrare la funzionalità del flusso di lavoro presentato, abbiamo eseguito esperimenti utilizzando Pseudomonas putida KT2440 geneticamente modificato, un batterio motile gram negativo importante per la bioremediazione e la biotecnologia. Le versioni geneticamente modificate di questo ceppo che esprimono la produzione di FPG sono disponibili in commercio. È disponibile anche un ceppo non mobile di P. putida KT2440 che manca dei geni strutturali e regolatori rileva...

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Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

Le curve di svolta (BTC) sono strumenti efficienti per studiare il trasporto di batteri nei mezzi porosi. Qui introduciamo strumenti basati su dispositivi fluidici in combinazione con microscopia e conteggio citometrico del flusso per ottenere I BTC.

Combinazione di dispositivi fluidici con microscopia e citometria di flusso per studiare il trasporto microbico nei mezzi porosi attraverso le scale spaziali

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

Studiare il trasporto di batteri nei sistemi porosi è importante per quanto riguarda la contaminazione, la diffusione delle malattie e la bioremediazione. Per questi esperimenti in modelli matematici che operano a singola cellula, sono necessari la popolazione e il livello della comunità microbica. Qui presentiamo strumenti per studiare il trasporto batterico utilizzando dispositivi microfluidici e microscopia, nonché dispositivi più grandi in combinazione con citometria a flusso.La combinazione di dispositivi microfluidici con microscopia e citometria di flusso offre una gamma di possibilità per studiare fenomeni di trasporto batterico su diverse scale spaziali. Al fine di esplorare completamente questo protocollo, si consiglia di avere precedenti esperienze in microscopia, elaborazione di immagini di base, progettazione di dispositivi microfluidici e citometria del flusso di masterizzazione. Questo video descrive due metodi per studiare il trasporto batterico su diverse scale spaziali.Il primo metodo, basato su dispositivi microfluidici, si basa sulla microscopia per contare le singole cellule. Questo sistema può essere utilizzato per studiare il trasporto batterico attraverso più scale spaziali dal poro all'intera scala del sistema poroso. Il secondo metodo, utilizzando dispositivi fluidici più grandi accoppiati a un distributore automatizzato e a una citometria di flusso, può essere utilizzato per studiare il fenomeno del trasporto batterico su larga scala di interi sistemi porosi.Tali metodi possono anche essere utilizzati in studi a colonne su scala di laboratorio, nonché in piccole indagini sul campo. Per iniziare, progettare la geometria porosa desiderata che consiste in una matrice di cerchi. In base alla geometria scelta, preparare uno stampo utilizzando la fotolitografia SU-8 standard.Preparare 50 grammi di PDMS aggiungendo il 90% di elastomero al 10% dell'agente polimerizzante al 90% di elastomero in peso in un contenitore monouso pulito e mescolare i due reagenti con uno strumento pulito. Applicare un vuoto di 100 millibar per 30 minuti per rimuovere l'aria disciolta e le bolle. Posizionare lo stampo in una piastra di Petri e versare il PDMS sullo stampo all'altezza desiderata tra i due e i cinque millimetri.Coprire la piastra di Petri con un coperchio e tenerla a 60 gradi Celsius per almeno quattro ore. Successivamente, lasciare raffreddare il dispositivo microfluidico a temperatura ambiente. Una volta raffreddato, rimuovere con cura la porzione desiderata di PDMS con un bisturi.Sigillare temporaneamente la parte inferiore del canale PDMS con nastro adesivo. Con un punzonatore da 0,5 millimetri di diametro, perforare i canali per creare un'ingresso e una presa. Rimuovere il nastro dal canale PDMS e posizionare il canale con il lato poroso rivolto verso l'alto.Trattare lo scivolo di vetro e le superfici PDMS con plasma per circa 45 secondi ciascuno a temperatura ambiente. Posizionare il canale PDMS pretrattato sullo scivolo di vetro pretrattato e riscaldare a 100 gradi Celsius per 30 minuti su una piastra calda, quindi rimuovere il dispositivo microfluidico dalla piastra calda e raffreddarlo a temperatura ambiente. Applicare il vuoto per 30 minuti per rimuovere l'aria dal PDMS.Per produrre la base contenente il vano poro, utilizzare la micro fresatura ad alta precisione per rimuovere 0,5 millimetri dallo strato PMMA di base e fresare una scanalatura delle dimensioni di 1,1 per 1,1 millimetri per un O-ring in gomma. Praticare due fori filettati per un ingresso e una presa nella parte superiore del dispositivo fluido e 12 fori per le viti. Questo funge da coperchio del dispositivo fluido.Dopo aver pulito il dispositivo fluido, avvitare la base e il coperchio insieme utilizzando i 12 fori filettati. Rimuovere il microfluidico dal vuoto e posizionarlo sullo stadio del microscopio. Utilizzare la pompa della siringa per saturarla con un tampone di motilità.Utilizzando la microscopia Brightfield o il contrasto di fase, regola l'ingrandimento per visualizzare le singole cellule batteriche e concentrati sul centro del canale di osservazione. Passare le impostazioni del percorso della luce alla microscopia a fluorescenza. Regolare la messa a fuoco attraverso un offset e il tempo di esposizione della fotocamera per risolvere singole cellule batteriche.In questo caso, 100 millisecondi. Quindi, inserire il tubo di ingresso in un tubo a due millilitri contenente la sospensione batterica. Invertire la direzione della pompa e iniziare a ritirare la sospensione a una portata di un microlitro al minuto.Scansiona la sezione trasversale dell'intero canale di osservazione, registrando un'immagine ogni minuto. Importare immagini in una piattaforma software desiderata. Registrare lo sfondo come media delle prime immagini quando non sono state registrate particelle.Sottrarre lo sfondo da ogni immagine per rimuovere il rumore della fotocamera e l'aberrazione ottica. Ritagliare le immagini in un'area di interesse. Identificare un valore di soglia uguale all'intensità del pixel di fluorescenza cellulare in modo che i valori superiori alla soglia includano cellule batteriche.Usa l'elaborazione delle immagini per sottrarre il valore di soglia da ogni immagine. Binarizzare l'immagine risultante in modo che le cellule batteriche prendano un valore pari a uno, mentre lo sfondo assume un valore pari a zero. Rimuovere i cluster di pixel con un'area più piccola della dimensione minima delle celle batteriche in pixel.Sommare l'immagine binarizzata per ottenere il numero totale di pixel dei cluster rimanenti. Dividere il numero di pixel per la dimensione media di una cella batterica in pixel per ottenere una stima del numero di celle. Trasforma i conteggi in concentrazione in particelle per millilitro.Per identificare la concentrazione della sospensione batterica iniettata, iniettare la sospensione batterica nel canale di osservazione di un dispositivo microfluidico pulito con una siringa. Registrare l'immagine e calcolare la concentrazione batterica influente come mostrato in precedenza. Visualizzare le curve di svolta normalizzando la concentrazione batterica degli effluenti C con la concentrazione batterica influente C0 e tracciando C su C0 rispetto al tempo.Al fine di analizzare le velocità e le traiettorie locali dei batteri trasportati attraverso la matrice porosa, spostare lo stadio del microscopio in una regione di interesse e regolare la messa a fuoco al centro del dispositivo microfluidico. Impostare la configurazione ottica sulla microscopia a contrasto di fase o a fluorescenza. Registra immagini time-lapse e un tempo di esposizione abbastanza breve da catturare lo spostamento batterico.In questo caso, 50 millisecondi. Registrare le immagini in un lasso di tempo sufficiente, ad esempio tre minuti. Per rimuovere il rumore da ogni immagine, sottrarre lo sfondo, che è la media della somma di tutte le immagini registrate.Determinare il modulo del gradiente numerico e normalizzarlo in base al valore massimo. Trovare e registrare coordinate batteriche e il tempo di acquisizione dell'immagine in un file a tre colonne. Eseguire l'analisi del tracciamento delle particelle per elaborare i dati registrati e calcolare le traiettorie.Per ottenere profili di deposizione, registrare un'immagine composita dell'intero canale poroso prima, cioè lo sfondo, e dopo l'iniezione della sospensione batterica attraverso il dispositivo microfluidico. Rimuovere lo sfondo dalle immagini registrate dopo l'iniezione batterica. Calcola il profilo di deposizione D come la somma del segnale di fluorescenza batterica lungo sezioni trasversali di lunghezza x del canale poroso.Visualizzare il profilo di deposizione come segnale di fluorescenza locale rispetto alla lunghezza del canale poroso. Per impostare il distributore automatico, posizionare il distributore robotico vicino al dispositivo fluido. Collegare il distributore robotico al computer che esegue BCNC e identificare la porta com corretta.In BCNC, fare clic sul pulsante Home per riportare il distributore robotico nella posizione di casa. Collegare la pompa peristaltica con l'ingresso utilizzando tubi di diametro interno lunghi 50 centimetri, diametro interno di un millimetro e il deflusso con il distributore automatico utilizzando lo stesso tubo. Pompare il mezzo di coltivazione attraverso il dispositivo fluido.Si noti l'arrivo del mezzo al tubo di uscita fissato al distributore robotico e posizionare una piastra da 96 potte che raccoglierà il deflusso. Allo stesso tempo, attivare il distributore robotico e iniettare la sospensione batterica attraverso il dispositivo fluido PMMA a una portata di 0,2 millilitri al minuto. Iniettare sospensioni batteriche equivalenti a diversi volumi di pori.Ad esempio, 30 volte il volume del dispositivo fluido. Dopo l'iniezione, passare al mezzo di coltivazione sterile fino alla fine dell'esperimento. Una volta completata una piastra da 96 pozzetti, coprire la piastra e conservare a quattro gradi Celsius fino all'analisi della citometria del flusso.Analizzare i campioni con citometria del flusso e visualizzare le curve di svolta normalizzando la concentrazione batterica degli effluenti C con la concentrazione batterica influente C0 e tracciando C su C0 rispetto al tempo. In questo studio, utilizzando pseudomonas putida KT2440 sia mobili che non mobili, sono stati eseguiti esperimenti sequenziali in dispositivi microfluidici PDMS con una serie casuale di pilastri. Qui vengono mostrate curve rivoluzionarie normalizzate alla concentrazione di cellule iniettate, così come traiettorie batteriche sulla scala dei pori.Sono stati eseguiti anche esperimenti con dispositivi fluidici su larga scala fresati dal PMMA. Pseudomonas putida KT2440, motile e non mobile, sono stati iniettati in una matrice porosa regolarmente distanziata. Sorprendentemente, in un ambiente poroso privo di biofilm, Pseudomonas putida KT2440, mobile e non mobile, ha mostrato un comportamento di trasporto marcatamente diverso basato su curve rivoluzionarie.In una matrice porosa colonizzata per 48 ore con una complessa comunità di biofilm a flusso, queste differenze nelle curve rivoluzionarie tra pseudomonas putida KT2440 eterogenee e non motili sono scomparse. Utilizziamo questo sistema per studiare il trasporto batterico nei corsi d'acqua, ma questi strumenti possono essere facilmente adattati per studiare i fenomeni di trasporto batterico in altri sistemi ingegnerizzati e ambientali. Il trasporto batterico attraverso mezzi porosi idratati incapsula i processi su più scale spaziali.La metodologia qui presentata consente di collegare lo spostamento locale dei batteri sulla scala dei pori al trasporto microscopico su tutto il mezzo poroso.

Research

JoVE Journal

Environment

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Preparazione e test di impedenza a base di biochip fluidici con le cellule RTgill-W1 per valutare rapidamente campioni di acqua potabile per la tossicità

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Ricerca

Ambiente

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Estrazione e l&#39;analisi delle microbica fosfolipidi acidi grassi nei terreni

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems (PEMS) for the Real-driving Emissions (RDE) Regulation in Europe

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems PEMS for the Real-driving Emissions RDE Regulation in Europe

Implementazione di sistemi di misura portatili (PEMS) per il regolamento delle emissioni Real-guida (RDE) in Europa

Vehicles are tested in controlled and relatively narrow laboratory conditions to determine their official emission values and reference fuel consumption. ...

Using Pharmacological Manipulation and High-precision Radio Telemetry to Study the Spatial Cognition in Free-ranging Animals

Utilizzando manipolazione farmacologica e di alta precisione Radio Telemetria per studiare la Spatial Cognition in animali Free respiro

An animal&#39;s ability to perceive and learn about its environment plays a key role in many behavioral processes, including navigation, migration, ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

Dispersione dei nanomateriali in mezzi acquosi: verso l'ottimizzazione dei protocolli

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Microfluidic Devices for Characterizing Pore-scale Event Processes in Porous Media for Oil Recovery Applications

Dispositivi microfluidici per la caratterizzazione di processi di evento di poro-scala in mezzi porosi per le applicazioni di recupero olio

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Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Caratterizzazione di biofilm acquatici con citometria a flusso

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Metal Corrosion and the Efficiency of Corrosion Inhibitors in Less Conductive Media

Corrosione del metallo e l'efficienza di inibitori di corrosione in Media meno conduttivo

Material corrosion can be a limiting factor for different materials in many applications. Thus, it is necessary to better understand corrosion processes, ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Isolamento ed analisi di comunità microbiche nel suolo, rizosfera e radici negli esperimenti di erba perenne

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Characterizing Microbiome Dynamics ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œ Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Caratterizzante Microbiome Dynamics – flusso Cytometry basato su flussi di lavoro da colture Pure di comunità naturali

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...