Name: combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales
Uploaded: 2020-11-25T14:00:00
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私たちは、ロボットディスペンサーとdispenser.pyスクリプトのセットアップでアントワーヌ・ウィードマーの助けを認めます。

1. 細菌培養条件
<ol><li>ラミナーフローフードの下で作業し、100 μLのグリセロールストックを使用して、GFP タグ付き シュードモナスプティダ KT2440 (1 × 107 mL-1、-80°Cで保存) ルリア ベルタニ (LB) 培地の 5 mL を接種します。一晩250rpmで振りながら30°Cでインキュベートする。</li>
	<li>翌日、100μLの一晩培養を5 mL LB培地で再中断し、同じ条件で5h(指数相)でインキュベートし...

<ol>
	<li>Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+and+removal+of+pathogenic+bacteria+in+wastewater+percolating+through+porous+media:+a+review.">Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review.</a> Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).</li><li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues.">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li><li>Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processes+in+microbial+transport+in+the+natural+subsurface.">Processes in microbial transport in the natural subsurface.</a> Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).</li><li>Tufenkji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+microbial+transport+in+porous+media:+Traditional+approaches+and+recent+developments.">Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments.</a> Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).</li><li>Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+modelling+straining+of+Escherichia+coli+in+saturated+porous+media.">Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media.</a> Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).</li><li>Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+and+biogeochemistry+of+stream+biofilms.">The ecology and biogeochemistry of stream biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).</li><li>Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+biophysical+underpinnings+to+the+success+of+multispecies+biofilms+in+porous+environments.">Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments.</a> The ISME Journal. 1, (2019).</li><li>Carrel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+in+3D+porous+media:+Delineating+the+influence+of+the+pore+network+geometry,+flow+and+mass+transfer+on+biofilm+development.">Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development.</a> Water Research. 134, 280-291 (2018).</li><li>Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+hopping+and+trapping+in+porous+media.">Bacterial hopping and trapping in porous media.</a> Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).</li><li>Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trait-specific+dispersal+of+bacteria+in+heterogeneous+porous+environments:+from+pore+to+porous+medium+scale.">Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale.</a> Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).</li><li>Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+preferential+flow+paths+perpetuated+by+microbial+activity+in+the+soil+matrix?+A+review.">Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review.</a> Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).</li><li>Creppy, A., Cl&#233;ment, E., Douarche, C., D'Angelo, M. V., Auradou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+motility+on+the+transport+of+bacteria+populations+through+a+porous+medium.">Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium.</a> Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).</li><li>Camesano, T. A., Logan, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Fluid+Velocity+and+Cell+Concentration+on+the+Transport+of+Motile+and+Nonmotile+Bacteria+in+Porous+Media.">Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media.</a> Environmental Science &amp; Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).</li><li>Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+surface+characteristics+on+the+transport+of+multiple+Escherichia+coli+isolates+in+large+scale+columns+of+quartz+sand.">The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand.</a> Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).</li><li>Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+biofilm+on+bacterial+transport+and+deposition+in+porous+media.">Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media.</a> Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).</li><li>Long, T., Ford, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Transverse+Migration+of+Bacteria+by+Chemotaxis+in+a+Porous+T-Sensor.">Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor.</a> Environmental Science &amp; Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).</li><li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+Expanding+the+Frontiers+of+Microbial+Ecology.">Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology.</a> Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Digital+Video+Microscopy+for+Colloidal+Studies.">Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+determination+of+bacterial+abundance+in+lake+plankton+with+the+green+nucleic+acid+stain+SYTO+13.">Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13.</a> Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).</li></ol>

ここでは、単一細胞レベルと人口レベルで多孔質系を介した微生物の輸送を研究する2つの手段を提案する。BTCモデリングを用いた輸送現象の研究は、生態系規模での病原体や汚染物質の拡散に関する貴重な洞察を提供してきましたが、実験室での実験から現場条件へのスケールの困難は依然として存在しています。ここで説明するツールは、多孔質環境での輸送に関連する微生物の生態学的...

多孔質媒体を介した微生物の輸送を理解することを目的とした研究は、主に汚染1、疾患2 の伝染およびバイオレメディエーション3の懸念によって駆動されてきた。この点に関して、細菌は主に輸送モデル4 において粒子として処理されており、バイオフィルムからの濾過、緊張、重力沈降または再動員などのプロセスが微生物5の保持または輸送の促進要因として同定されている。しかし、多孔質の風景を通して細菌の輸送を研究することは、これらの複雑な環境での成功を支える生態学的戦略についても私たちに知らせることができます。しかし、これは単一細胞、集団または微生物群集レベルで動作する新しい実験および数学的モデルを必要とする。
河川や河川の低密度帯に見られるような自然多孔質環境は、バイオフィルム形成微生物6の多様なコミュニティによって密集して植民地化されている。バイオフィルムは、流れを変え、したがって液相77,88における細菌の輸送および分散を変える構造を形成する。孔径での細菌の輸送は、多孔質マトリックスの制約された空間の可用性に依存 し、運動関連の分散は、人口密度の低い地域の資源の競争を減らすことによって個々の適性を高める効果的な方法である可能性がある。一方、モチル細菌はまた、多孔質マトリックスのより孤立した領域に到達することができ、そのような領域の拡張探査は、運動性集団10に生態学的機会を提供し得る。より大きな空間スケールでは、バイオフィルムの成長は、毛穴の(部分的な)詰まりにもつながって流路を流れ、したがって、さらにチャネライズ化および異種の流れ条件11の確立に導く。これは、栄養供給と分散容量、周波数と距離の結果を持っています。たとえば、優先的な流れは、いわゆる「高速トラック」を生成することができ、モタイル細菌は、これらのトラック12に沿った局所的な流れよりもさらに高速を達成することができる。これは、新しい生息地の探査を増やす効果的な方法です。
多孔質媒体中の可動性および非運動性細菌(および粒子)の輸送の研究のために、様々なツールが役に立つ。数値モデルは、アプリケーションにとって重要な大きな予測能力を持っていますが、多くの場合、固有の仮定4によって制限されます。実験室規模実験13,14,14を画期的曲線(BTC)モデリングと組み合わせることで、貼付効率15に対する細菌細胞表面特性の重要性に関する重要な知見を提供している。典型的には、BTCs(すなわち、一定の位置での一連の粒子濃度)は、実験装置の流出時の細胞数の定率放出および測定を介して得られる。この文脈では、BCCは多孔質マトリックス中の細菌の対流分散ダイナミクスを反映し、添付を考慮したシンク用語によって拡張することができる。しかし、BTCsのモデリングだけでは、輸送プロセスのための多孔質基質またはバイオフィルムの空間的構成の役割は解決しない。分散性や堆積プロファイルのような他の巨視的な観測可能な観測は、空間分布または保持された粒子または成長するコミュニティに関する重要な情報を提供することが証明されている。マイクロ流体は、顕微鏡,調査9、12、16、12および最近の研究910を除いて多孔質媒体の輸送を研究することを可能にする技術であり、実験系は典型的には、単一の長さの解像度スケール、すなわち孔スケールまたは全体の流体装置スケールに制約される。16
ここでは、異なるスケールで多孔質の風景の中でのモチル菌と非運動性細菌の輸送を研究するための組み合わせ方法のスイートを紹介します。我々は、BTC分析を用いて、孔径での細菌輸送の観測と、より大きなスケールでの情報を組み合わせたものである。ポリジメチルシロキサン(PDMS)を用いたソフトリソグラフィーから構築された微小流体デバイスは、生体適合性、化学薬品の範囲に耐性、低コストで複製可能、優れた光学透過性と微視的観察に不可欠な低い自己蛍光を提供します。PDMSに基づくマイクロ流体は、これまで、単純なチャネル17 またはより複雑な幾何学12における微生物の輸送を研究するために使用されてきた。しかし、一般的にマイクロ流体実験は、短期的な地平線に焦点を当て、生きている細胞のエピ蛍光顕微鏡観察は、一般的に遺伝子組み換え株(例えば、GFPタグ付き株)に限定される。ここでは、PDMSベースのマイクロ流体デバイスを、フローサイトメトリーと組み合わせてポリ(メチルメタクリル酸メチルメタクリル酸塩)(PMMA、プレキシガラスとも呼ばれる)から製造された大型デバイスと組み合わせて、細菌輸送を研究するツールを紹介します。PDMSとPMMAはガス透過性と表面特性が異なるため、細菌輸送を研究する補完的な機会を提供します。マイクロ流体デバイスはより制御された環境を提供する一方で、より大きなデバイスは長期間にわたる実験を可能にするか、自然細菌群集を使用することができます。専用領域での高い時間分解能での顕微鏡計数は、PDMSベースのマイクロ流体デバイスでBTCを得るために使用される。PMMAベースのデバイスからBTCモデリング用のセルカウントを得るために、フローサイトメトリーと組み合わせた自己構築自動液体ディスペンサーを導入します。この設定では、細胞は流体装置を通過し、連続して96ウェルプレートに分配されます。時間分解能は、正確に分配できる最小体積と、流体デバイスを通る中流量によって制限されます。ウェル内の固定は成長を防ぎ、下流のフローサイトメトリック列挙のためのDNA染色を促進する。輸送実験中の細菌の増殖を防ぐために、我々は最小限の培地(運動バッファーと呼ばれています)を使用します。
異なるスケールでの流体デバイスの調製のためのプロトコルが容易に利用可能であるため、我々は簡単にそのようなデバイスを生成するための技術を導入し、むしろ、BTCsを記録するための実験的な手順に焦点を当てています。同様に、微生物のフローサイトメトリック列挙に対して様々なルーチンが存在し、ユーザーはフローサイトメトリーによって得られた結果を解釈するための専門的な知識を必要とします。微小流体デバイスの新しい使用と顕微鏡イメージングを組み合わせて、蛍光タグ付き細胞のBTCを記録することを報告します。細孔スケールでは、局所的な速度と軌道は画像処理によって得られます。また、PMMAベースの流体デバイスをフローサイトメトリックカウントと組み合わせて使用し、天然の流れバイオフィルムによって植民地化された多孔質環境におけるモチル細胞および非モタイル細胞の細菌輸送を観察することを実証する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastomer Sylgard 184</td>
			<td>Dowsil</td>
			<td>101697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer NovoCyte</td>
			<td>Acea</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit</td>
			<td>makeblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axio Imager</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope AxioZoom v16</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 75 mm &#215; 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 3 peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma bonder Corona SB</td>
			<td>BlackHole Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump New Era NE 4000</td>
			<td>New Era</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF31SA universal milling machine</td>
			<td>Mikron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales

多孔質媒体における微生物の輸送、分散、堆積を理解することは、流体力学、生態学、環境工学など多様なトピックからなる複雑な科学的課題です。異なる空間スケールでの多孔質環境での細菌輸送のモデリングは、細菌輸送の結果をより良く予測するために重要ですが、現在のモデルはしばしば実験室から現場の状態にスケールアップに失敗します。ここでは、2つの空間スケールで多孔質媒体での細菌輸送を研究するための実験的なツールを紹介する。これらのツールの目的は、透明多孔質マトリックスに注入された細菌の巨視的な観測(画期的な曲線や堆積プロファイルなど)を得ることにあります。小スケール(10-1000 μm)では、マイクロ流体デバイスを光学ビデオ顕微鏡と画像処理と組み合わせて画期的な曲線を得るとともに、個々の細菌細胞を細孔スケールで追跡します。より大きいスケールでは、フローサイトメトリーは、画期的な曲線を得るために、自作のロボットディスペンサーと組み合わされます。我々は、細菌が小川の低熱ゾーンのような複雑な多孔質媒体で輸送される方法をよりよく理解するためのこれらのツールの有用性を示す。これらのツールはスケールをまたいで同時に測定するので、アップスケーリングにとって非常に重要なメカニズムベースのモデルへの道を開きます。これらのツールの応用は、新しいバイオレメディエーションアプリケーションの開発に貢献するだけでなく、多孔質基質を植民地化する微生物の生態学的戦略に新たな光を当てる。

提示されたワークフローの機能性を説明するために、バイオレメディエーションおよびバイオテクノロジーに重要なグラム陰性モチル菌である遺伝子組み換えシュードモナスプチダKT2440を用いた実験を行った。GFP生産を発現するこの株の遺伝子組み換えバージョンは市販されている。運動性に関する構造遺伝子や調節遺伝子を欠くP.プチダKT2440の非運動?...

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Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

画期的な曲線(BTCs)は、多孔質媒体における細菌の輸送を研究するための効率的なツールです。ここでは、マイクロコピーとフローサイトメトリックカウントと組み合わせて流体デバイスに基づくツールを紹介し、BTCsを取得します。

流体デバイスと顕微鏡とフローサイトメトリーを組み合わせて、空間スケールを越えた多孔質培地における微生物輸送を研究

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

多孔質系における細菌の輸送を研究することは、汚染、病気の蔓延、およびバイオレメディエーションに関して重要である。単一細胞で動作する数理モデルにおけるこれらの実験では、集団と微生物群集レベルが必要である。ここでは、マイクロ流体デバイスと顕微鏡を用いた細菌輸送を研究するツールや、フローサイトメトリーと組み合わせたより大きなデバイスを紹介します。顕微鏡検査とフローサイトメトリーとマイクロ流体デバイスの組み合わせは、異なる空間スケールで細菌輸送現象を研究する可能性の範囲を提供しています。このプロトコルを十分に探求するために、顕微鏡、基本的な画像処理、マイクロ流体デバイスの設計、およびフローサイトメトリーの習得に関する以前の経験を持つものが示唆されています。このビデオでは、異なる空間スケールで細菌輸送を研究する2つの方法について説明します。マイクロ流体デバイスに基づく最初の方法は、個々の細胞を数えるために顕微鏡に依存しています。このシステムは、細孔から多孔質システムスケール全体までの複数の空間スケールにわたる細菌輸送を研究するために使用できます。第2の方法は、自動化されたディスペンサーおよびフローサイトメトリーに結合されたより大きな流体装置を使用して、多孔質システム全体の規模で細菌輸送現象を研究するために使用することができる。このような方法は、実験室規模のカラム研究や小規模なフィールド調査にも展開できます。まず、円のマトリックスから構成される目的の多孔質ジオメトリを設計します。選択したジオメトリに基づいて、標準的なSU-8フォトリソグラフィを使用して金型を準備します。きれいな使い捨て容器の中でエラストマーの90%を10%のエラストマーに10%重量で加えて50グラムのPDMSを調製し、2つの試薬をクリーンなツールと混合します。溶存空気と気泡を除去するために30分間100ミリバールの真空を適用します。ペトリ皿に金型を入れ、2〜5ミリメートルの間の所望の高さにPDMSを鋳型に注ぎます。ペトリ皿を蓋で覆い、少なくとも4時間摂氏60度に保ちます。その後、マイクロ流体装置を室温まで冷却するようにします。冷却したら、PDMSの所望の部分をメスで慎重に取り除いてください。PDMSチャネルの底面をテープで一時的に密封します。直径0.5ミリメートルのパンチャーを使用して、チャンネルを貫通して入口と出口を作成します。PDMSチャンネルからテープを取り出し、多孔質側を上に向けてチャンネルを配置します。ガラススライドとPDMS表面を室温で約45秒間プラズマで処理します。前処理されたPDMSチャネルを前処理ガラススライドに置き、ホットプレートで30分間摂氏100度で熱し、ホットプレートからマイクロ流体装置を取り外し、室温まで冷却します。PDMSから空気を除去するために30分間真空を適用します。細孔コンパートメントを含むベースを製造するには、高精度マイクロミリングを使用して、ベースPMMA層から0.5ミリメートルを除去し、ゴム製Oリングの場合は1.1×1ミリメートルの大きさの溝を粉砕します。流入口と出口用の2つのネジ穴を流体装置の上部に、ネジ用に12個の穴を開けます。これは、流体装置の蓋として機能します。流体装置を洗浄した後、12通りの穴を使用して、ベースと蓋をねじ込みます。マイクロ流体を真空から取り出し、顕微鏡ステージに置きます。シリンジポンプを使用して、運動バッファーで飽和します。ブライトフィールド顕微鏡または位相コントラストを使用して、個々の細菌細胞を可視化し、観察チャネルの中心に焦点を合わせて拡大率を調整します。光路設定を蛍光顕微鏡に切り替えます。個々の細菌細胞を解決するためにオフセットとカメラ露出時間を通して焦点を調整します。この場合、100 ミリ秒。次に、入口チューブを細菌懸濁液を含む2ミリリットルチューブに挿入する。ポンプ方向を逆にして、1分間に1マイクロリットルの流量でサスペンションの引き出しを開始します。観測チャネル全体の断面をスキャンし、毎分画像を記録します。目的のソフトウェア プラットフォームにイメージをインポートします。パーティクルが記録されていない場合は、最初の画像の平均として背景を記録します。各画像から背景を引いて、カメラのノイズと光学収差を除去します。対象の領域に画像をトリミングします。閾値よりも大きい値が細菌細胞を含むように、細胞蛍光ピクセル強度に等しいしきい値を特定します。画像処理を使用して、各画像からしきい値を引きます。生じた画像を二元化して、細菌細胞が1の値を取るのに対し、背景はゼロの値を取るようにします。最小の細菌細胞サイズより小さい領域をピクセル単位で除去します。二項化された画像を合計して、残りのクラスターの合計ピクセル数を取得します。細胞数の推定値を得るために、細菌細胞の平均サイズでピクセル数を割ります。ミリリットルあたりの粒子の濃度にカウントを変換します。注入された細菌懸濁液の濃度を特定するには、注射器を用いて清潔なマイクロ流体装置の観察チャネルに細菌懸濁液を注入する。画像を記録し、先に示したように、流暢な細菌濃度を計算します。流暢な細菌濃度C0で廃菌濃度Cを正規化し、C0以上の時間でCをプロットすることにより、画期的な曲線を視覚化します。多孔質マトリックスを介して輸送される細菌の局所的な速度と軌道を解析するために、顕微鏡ステージを対象領域に移動し、マイクロ流体装置の中心に焦点を合わせます。光学構成を位相コントラストまたは蛍光顕微鏡に設定します。タイムラプス画像と、細菌の変位を捉えるのに十分な短い露出時間を記録します。この場合、50 ミリ秒。十分な時間 (例えば 3 分) にわたって画像を記録します。各画像からノイズを除去するには、記録されたすべての画像の合計の平均である背景を減算します。数値勾配の係数を決定し、最大値で正規化します。細菌座標と画像取得の時刻を検索して、3 列のファイルに記録します。パーティクル追跡解析を実行して、記録されたデータを処理し、軌道を計算します。堆積プロファイルを得るために、前に、すなわち背景であり、マイクロ流体装置を介して細菌懸濁液を注入した後に、多孔質チャネル全体の合成画像を記録する。細菌の注入後に記録された画像から背景を削除します。多孔質チャネルの長さxの横切り部分に沿った細菌蛍光信号の合計として、堆積プロファイルDを計算する。多孔質チャネル長に対する局所蛍光信号として堆積プロファイルを可視化します。自動ディスペンサーをセットアップするには、ロボットディスペンサーを流体デバイスの近くに置きます。ロボットディスペンサーをBCNCを実行しているコンピュータに接続し、正しいcomポートを特定します。BCNCでは、ホームボタンをクリックして、ロボットディスペンサーをホームポジションに戻します。長さ50センチメートル、内径1ミリメートルのチューブを使用して、浸透性ポンプを入口に接続し、同じチューブを使用して自動ディスペンサーで流出します。流体装置を介したポンプ栽培媒体。ロボットディスペンサーに固定された出口管に媒体が到着し、流出を収集する96ウェルプレートを置きます。同時に、ロボットディスペンサーを作動させ、PMMA流体装置を通して1分間に0.2ミリリットルの流量で細菌懸濁液を注入する。いくつかの細孔容積に相当する細菌懸濁液を注入する。例えば、流体装置の体積の30倍である。注射後、実験終了まで滅菌培養培地に切り替えます。96ウェルプレートが完成したら、プレートを覆い、フローサイトメトリー分析まで摂氏4度で保存します。フローサイトメトリーでサンプルを分析し、流暢な細菌濃度C0で排水細菌濃度Cを正規化し、C0以上のCを時間でプロットすることにより、画期的な曲線を可視化します。本研究では、モチルおよび非可換シュードモナスプチダKT2440の両方を用いて、ピラーのランダム配列を有するPDMSマイクロ流体デバイスで逐次実験を行った。注入された細胞の濃度に正規化された画期的な曲線、ならびに孔スケールでの細菌の軌跡がここに示されている。PMMAから粉砕した大規模な流体デバイスの実験も行った。モチルおよび非可動シュードモナスプチダKT2440を、定期的に間隔を置いた多孔質マトリックスに注入した。驚くべきことに、バイオフィルムを欠いた多孔質環境において、モチルおよび非モチルシュードモナスプチダKT2440は、画期的な曲線に基づいて著しく異なる輸送行動を示した。複雑なストリームバイオフィルムコミュニティで48時間コロニー形成された多孔質マトリックスでは、モチルと非モチルシュードモナスプチダKT2440の間の画期的な曲線のこれらの違いが消失した。私たちはこのシステムを使用して河川内の細菌輸送を研究しますが、これらのツールは、他のエンジニアリングおよび環境システムにおける細菌輸送現象を研究するために容易に調整することができます。水和された多孔質媒体を介した細菌輸送は、複数の空間スケール上のプロセスをカプセル化します。ここで提示された方法論は、孔スケールでの細菌の局所変位を多孔質培地全体の顕微鏡輸送に結び付けることを可能にする。

Research

JoVE Journal

Environment

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Microfluidic Devices for Characterizing Pore-scale Event Processes in Porous Media for Oil Recovery Applications

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Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

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Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

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特徴マイクロバイ ダイナミクス-フローサイトメトリー ベースの自然なコミュニティに純粋培養からワークフロー

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