Name: combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales
Uploaded: 2020-11-25T14:00:00
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우리는 로봇 디스펜서와 dispenser.py 스크립트의 설정으로 앙토안 위드머의 도움을 인정합니다.

1. 세균 배양 조건
<ol><li>라미나르 유동 후드 하에서 작업하면, GFP 태그가 지정된 슈도모나스 푸티다 KT2440(1× 107mL -1,-80°C에 저장됨)의 글리세롤 스톡 100μL을 사용하여 루리아-베르타니(LB) 배지의 5mL를 접종한다. 하룻밤 사이에 250 rpm에서 흔들면서 30 °C에서 배양하십시오.</li>
	<li>다음 날, 5mL LB 배지에서 야간 배양100 μL을 재중단하고 5h(지수상)에 대해 동일한 조건하에서 배...

<ol>
	<li>Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+and+removal+of+pathogenic+bacteria+in+wastewater+percolating+through+porous+media:+a+review.">Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review.</a> Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).</li><li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues.">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li><li>Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processes+in+microbial+transport+in+the+natural+subsurface.">Processes in microbial transport in the natural subsurface.</a> Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).</li><li>Tufenkji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+microbial+transport+in+porous+media:+Traditional+approaches+and+recent+developments.">Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments.</a> Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).</li><li>Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+modelling+straining+of+Escherichia+coli+in+saturated+porous+media.">Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media.</a> Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).</li><li>Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+and+biogeochemistry+of+stream+biofilms.">The ecology and biogeochemistry of stream biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).</li><li>Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+biophysical+underpinnings+to+the+success+of+multispecies+biofilms+in+porous+environments.">Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments.</a> The ISME Journal. 1, (2019).</li><li>Carrel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+in+3D+porous+media:+Delineating+the+influence+of+the+pore+network+geometry,+flow+and+mass+transfer+on+biofilm+development.">Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development.</a> Water Research. 134, 280-291 (2018).</li><li>Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+hopping+and+trapping+in+porous+media.">Bacterial hopping and trapping in porous media.</a> Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).</li><li>Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trait-specific+dispersal+of+bacteria+in+heterogeneous+porous+environments:+from+pore+to+porous+medium+scale.">Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale.</a> Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).</li><li>Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+preferential+flow+paths+perpetuated+by+microbial+activity+in+the+soil+matrix?+A+review.">Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review.</a> Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).</li><li>Creppy, A., Cl&#233;ment, E., Douarche, C., D'Angelo, M. V., Auradou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+motility+on+the+transport+of+bacteria+populations+through+a+porous+medium.">Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium.</a> Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).</li><li>Camesano, T. A., Logan, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Fluid+Velocity+and+Cell+Concentration+on+the+Transport+of+Motile+and+Nonmotile+Bacteria+in+Porous+Media.">Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media.</a> Environmental Science &amp; Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).</li><li>Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+surface+characteristics+on+the+transport+of+multiple+Escherichia+coli+isolates+in+large+scale+columns+of+quartz+sand.">The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand.</a> Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).</li><li>Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+biofilm+on+bacterial+transport+and+deposition+in+porous+media.">Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media.</a> Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).</li><li>Long, T., Ford, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Transverse+Migration+of+Bacteria+by+Chemotaxis+in+a+Porous+T-Sensor.">Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor.</a> Environmental Science &amp; Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).</li><li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+Expanding+the+Frontiers+of+Microbial+Ecology.">Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology.</a> Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Digital+Video+Microscopy+for+Colloidal+Studies.">Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+determination+of+bacterial+abundance+in+lake+plankton+with+the+green+nucleic+acid+stain+SYTO+13.">Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13.</a> Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).</li></ol>

여기서 우리는 단일 세포와 인구 수준에서 다공성 시스템을 통해 미생물의 수송을 연구하는 두 가지 수단을 제안한다. BTC 모델링을 이용한 운송 현상에 대한 연구는 생태계 척도에서 병원균이나 오염물질의 확산에 대한 귀중한 통찰력을 제공했지만 실험실 실험에서 현장 조건으로 확장하는 데 어려움이 여전히 존재합니다. 여기에 설명된 도구는 다공성 환경에서 수송과 관련된 미생물의 생태 전...

다공성 매체를 통한 미생물의 수송을 이해하는 것을 목표로 하는 연구는 주로 오염1,질병2 및 생물 교정3의전염에 대한 우려에 의해 주도되었다. 이와 관련하여, 박테리아는 주로 수송 모델4에서 입자로 취급되고 있으며, 생물막으로부터여비, 긴장, 중력 침전 또는 재동원과 같은 공정은 미생물의 유지 또는 수송의 동인으로 확인되었다5. 그러나 다공성 경관을 통해 박테리아의 수송을 연구하는 것은 또한 이러한 복잡한 환경에서 성공을 뒷받침하는 생태 전략에 알려줄 수 있습니다. 그러나, 이것은 단 하나 세포, 인구 또는 미생물 지역 사회 수준에서 작동하는 새로운 실험 및 수학 모형을 요구합니다.
하천과 하천의 저압 구역에서 발견되는 것과 같은 자연 다공성 환경은 생물막 형성 미생물6의다양한 지역 사회에 의해 조밀하게 식민지화된다. 생물막은 액체 상7,,8에서박테리아의 흐름을 수정하고 따라서 박테리아의 수송 및 분산구조를 형성한다. 모공 규모에서 박테리아의 수송은 다공성 매트릭스및 운동성 관련 분산물의 제한된 공간 가용성에 따라 달라지며, 인구밀도가 낮은 지역에서 자원에 대한 경쟁 감소를 통해 개별 체력을 높이는 효과적인 방법이 될 수 있다. 한편, 운동성 균은 다공성 매트릭스의 더 고립된 영역에 도달할 수 있으며, 이러한 지역의 확장된 탐사는운동인구(10)에생태학적 기회를 제공할 수 있다. 더 큰 공간 비늘에서, 생물막 성장은 또한 모공의 (부분) 막힘으로 이어지는 흐름 경로를 전환하고, 따라서, 더욱 집중화및 이질적인 유량조건(11)의확립에 이르게 한다. 이것은 영양 공급 및 분산 용량, 주파수 및 거리에 대한 결과를 초래합니다. 예를 들어, 우대 흐름은 소위 "패스트 트랙"을 생성할 수 있으며, 운동균은 이트랙(12)을따라 로컬 흐름보다 더 높은 속도를 달성할 수 있다. 이것은 새로운 서식지의 탐험을 증가시키는 효과적인 방법입니다.
다양한 도구는 다공성 매체에서 운동및 비운동성 박테리아(및 입자)의 수송을 연구하기 위해 이용합니다. 수치 모델은 응용 프로그램에 중요한 훌륭한 예측 능력을 가지고 있지만, 종종 고유의 가정4에의해 제한됩니다. 실험실 규모 실험13,,14와 획기적인 곡선(BTC) 모델링이 결합되어 고착효율(15)을위한 세균세포 표면 특성의 중요성에 중요한 통찰력을 제공한다. 전형적으로, BtC(즉, 고정된 위치에서 입자 농도의 시간 시리즈)는 실험 장치의 유출시 셀 번호의 일정 속도 방출 및 측정을 통해 얻어진다. 이러한 맥락에서, BtC는 다공성 매트릭스내 박테리아의 흡착-분산 역학을 반영하고 부착을 고려한 싱크 용어에 의해 확장될 수 있다. 그러나, 혼자 BtC의 모델링은 운송 공정을 위한 다공성 기질 또는 생물막의 공간 조직의 역할을 해결하지 못합니다. 분산성 또는 증착 프로파일과 같은 다른 거시적 관찰은 공간 분포 또는 유지된 입자 또는 성장하는 커뮤니티에 대한 중요한 정보를 제공하는 것으로 입증되었습니다. 미세유체는 현미경 조사9,12,,16에의해 다공성 미디어에서 수송을 연구할 수 있는 기술이며, 최근작업(10)을제외하고, 실험 시스템은 전형적으로 단일 길이의 해상도, 즉, 기공 스케일 또는 전체 유체 장치 스케일로 제한된다.,
여기서는 다양한 비늘의 다공성 풍경에서 모틸류 와 비 운동성 박테리아의 수송을 연구하는 결합 된 방법의 제품군을 소개합니다. 우리는 BTC 분석을 통해 더 큰 규모의 정보와 모공 규모에서 세균 수송의 관찰을 결합합니다. 폴리디메틸실록산(PDMS)을 사용하여 연약한 리소그래피로 제작된 미세유체 장치는 다양한 화학 물질에 대한 생체 적합성, 낮은 비용으로 복제성을 허용하며, 미세한 관찰에 중요한 낮은 광학 적 투명성뿐만 아니라 낮은 광학 적 투명성을 제공합니다. PDMS에 기초한 미세 유체학은 이전에 간단한채널(17) 또는 더 복잡한 기하학(12)에서 미생물의 수송을 연구하는 데 사용되어 왔다.12 그러나, 전형적으로 미세유체학 실험은 살아있는 세포의 단기 지평선 및 에피 형광 현미경 관측에 초점을 맞추고 일반적으로 유전자 변형 균주(예를 들어, GFP 태그된 균주)로 제한됩니다. 여기서 우리는 유동 세포측정과 함께 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA, 플렉시유리라고도 함)에서 제작된 현미경 검사법과 더 큰 장치와 함께 PDMS 기반 의 미세 유체 장치를 사용하여 세균 수송을 연구하는 도구를 제시합니다. PDMS와 PMMA는 가스 투과성 및 표면 특성이 다르므로 세균 수송을 연구할 수 있는 보완적인 기회를 제공합니다. 미세 유체 장치는 보다 통제된 환경을 제공하지만, 더 큰 장치는 장기간 또는 자연 세균 커뮤니티를 사용하여 실험을 할 수 있습니다. 전용 영역에서 고시간 분해능에서 계산되는 현미경 은 PDMS 기반 미세 유체 장치에서 BTC를 획득하는 데 사용됩니다. PMMA 기반 장치에서 BTC 모델링에 대한 셀 카운트를 얻기 위해 유동 세포 측정과 결합하여 자체 제작 된 자동화 된 액체 디스펜서를 소개합니다. 이 설정에서, 세포는 유체 장치를 통과하고 연속적으로 96 웰 플레이트로 분배된다. 측두해상도는 유체 장치를 통해 정확하게 분배될 수 있는 최소 부피에 의해 제한되고 따라서 중간 유량에 의해 제한됩니다. 우물의 고정은 성장을 방지하고 다운스트림 흐름- 사이토메트릭 열거에 대한 DNA 염색을 용이하게합니다. 운송 실험 중 세균 성장을 방지하기 위해 최소한의 중간(운동완 완충이라고 불임)을 사용합니다.
다양한 비늘에서 유체 장치 제조를 위한 프로토콜을 쉽게 사용할 수 있기 때문에 이러한 장치를 생산하고 오히려 BtC를 기록하는 실험 절차에 집중하는 기술을 간단히 소개합니다. 유사하게, 미생물의 유동 세포측정 열거에 대한 다양한 루틴이 존재하며 사용자는 유동 세포측정에 의해 얻은 결과를 해석하기 위해 전문가 지식을 필요로 한다. 우리는 형광 태그 세포의 BtC를 기록하기 위해 현미경 이미징과 함께 미세 유체 장치의 새로운 사용을보고합니다. 모공 스케일에서 로컬 속도와 궤적은 이미지 처리를 통해 얻을 수 있습니다. 또한, 우리는 원시 스트림 생물막에 의해 식민지화 다공성 환경에서 연약및 비 연약 세포의 세균수송을 관찰하기 위해 유량 세포계 계수와 결합하여 PMMA 기반 유체 장치의 사용을 입증한다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastomer Sylgard 184</td>
			<td>Dowsil</td>
			<td>101697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer NovoCyte</td>
			<td>Acea</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit</td>
			<td>makeblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axio Imager</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope AxioZoom v16</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 75 mm &#215; 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 3 peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma bonder Corona SB</td>
			<td>BlackHole Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump New Era NE 4000</td>
			<td>New Era</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF31SA universal milling machine</td>
			<td>Mikron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales

다공성 미디어에서 미생물의 운송, 분산 및 증착을 이해하는 것은 유체 역학, 생태 및 환경 공학과 같은 다양한 주제로 구성된 복잡한 과학적 과제입니다. 다양한 공간 비늘에서 다공성 환경에서 세균 수송을 모델링하는 것은 세균 수송의 결과를 더 잘 예측하는 데 매우 중요하지만 현재 모델은 종종 실험실에서 현장 조건으로 확장하지 못합니다. 여기서는 두 개의 공간 비늘에서 다공성 매체의 세균 수송을 연구하는 실험 도구를 소개합니다. 이러한 도구의 목적은 투명 다공성 행렬에 주입 된 박테리아의 거시적 인 관찰물 (예 : 획기적인 곡선 또는 증착 프로파일)을 얻는 것입니다. 작은 규모(10-1000 μm)에서 미세유체 장치는 광학 비디오 현미경 및 이미지 처리와 결합되어 획기적인 곡선을 얻고 동시에 개별 세균 세포를 모공 스케일로 추적합니다. 더 큰 규모로, 유동 세포측정은 획기적인 곡선을 얻기 위해 자체 제작 로봇 디스펜서와 결합됩니다. 우리는 박테리아가 스트림의 저압 영역과 같은 복잡한 다공성 매체에서 어떻게 운반되는지 더 잘 이해하기 위해 이러한 도구의 유용성을 보여줍니다. 이러한 도구는 스케일 전반에 걸쳐 동시 측정을 제공하므로 업스케일링에 매우 중요한 메커니즘 기반 모델을 위한 길을 열어줍니다. 이러한 도구의 적용은 새로운 생물 교정 응용 프로그램의 개발에 기여할뿐만 아니라 다공성 기판을 식민지화 하는 미생물의 생태 전략에 새로운 빛을 발산 할 수 있습니다.

제시된 워크플로우의 기능을 설명하기 위해, 우리는 유전자 변형 슈도모나스 푸티다 KT2440, 생체 치료 및 생명 공학에 중요한 그램 음성 운동균을 사용하여 실험을 수행했습니다. GFP 생산을 발현하는 이 균주의 유전자 변형 버전은 시판됩니다. 운동성에 대한 관련 구조 및 규제 유전자가 부족한 P. putida KT2440의 비운동균도 사용할 수 있습니다. 모틸및비운동성 ...

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Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

획기적인 곡선(BtC)은 다공성 미디어에서 박테리아의 운반을 연구하는 효율적인 도구입니다. 여기에서는 현미경 검사법과 유동 세포계 계수와 함께 유체 장치를 기반으로 한 도구를 소개하여 BtC를 획득합니다.

유체 장치를 현미경 검사법과 유동 세포측정과 결합하여 공간 저울을 가로지르는 다공성 미디어에서 미생물 수송을 연구합니다.

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

다공성 시스템에서 박테리아의 수송을 공부하는 것은 오염에 관하여 중요합니다, 질병의 퍼짐, 및 biore중개. 단일 세포에서 작동하는 수학적 모델에서 이러한 실험을 위해서는 인구와 미생물 커뮤니티 수준이 필요합니다. 여기서 우리는 미세 유체 장치 및 현미경 검사법을 사용하여 세균 수송을 연구하는 도구뿐만 아니라 유동 세포측정과 함께 더 큰 장치를 제시합니다.미세 유체 장치와 미세 한 장치와 미세 한 세포 측정 의 조합은 다른 공간 비늘에서 세균 수송 현상을 연구 할 수있는 다양한 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜을 완전히 탐구하기 위해 현미경 검사법, 기본 이미지 처리, 미세 유체 장치 설계 및 유동 세포 측정 을 마스터하는 이전의 경험을 갖는 것이 좋습니다. 이 비디오는 다른 공간 비늘에서 세균 수송을 연구하는 두 가지 방법을 설명합니다.미세 유체 장치를 기반으로 하는 첫 번째 방법은 현미경 검사법에 의존하여 개별 세포를 계산합니다. 이 시스템은 전체 다공성 시스템 규모에 공공에서 여러 공간 비늘에 걸쳐 세균 수송을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 두 번째 방법은 자동화된 디스펜서 및 유동 세포측정에 결합된 더 큰 유체 장치를 사용하여 전체 다공성 시스템의 규모로 세균 수송 현상을 연구하는 데 사용될 수 있다.이러한 방법은 실험실 규모의 컬럼 연구와 소규모 현장 조사에도 배포할 수 있습니다. 먼저 원 행렬로 구성된 원하는 다공성 형상을 디자인합니다. 선택한 형상을 기반으로 표준 SU-8 포토리소그래피를 사용하여 금형을 준비합니다.깨끗한 일회용 용기에 무게로 엘라스토머의 90%에 화합제의 90%에 엘라스토머의 90%를 추가하고 두 시약을 깨끗한 공구와 혼합하여 50그램의 PDMS를 준비합니다. 용존 공기와 거품을 제거하기 위해 30 분 동안 100 밀리바의 진공을 적용합니다. 금형을 페트리 접시에 넣고 PDMS를 금형에 붓고 2~5밀리미터 사이의 원하는 높이로 붓습니다.페트리 접시를 뚜껑으로 덮고 섭씨 60도에서 최소 4시간 동안 보관하십시오. 그 후, 미세 유체 장치가 실온으로 냉각 할 수 있습니다. 냉각되면 메스로 PDMS의 원하는 부분을 조심스럽게 제거하십시오.PDMS 채널의 바닥을 테이프로 일시적으로 밀봉합니다. 직경 0.5mm의 펀처로 채널을 관통하여 입구와 콘센트를 만듭니다. PDMS 채널에서 테이프를 제거하고 다공성 면이 위로 향하는 채널을 배치합니다.유리 슬라이드와 PDMS 표면을 실온에서 각각 약 45초 동안 플라즈마로 처리합니다. 전처리 된 PDMS 채널을 전처리 된 유리 슬라이드에 놓고 뜨거운 접시에 30 분 동안 100도의 열에 놓고 뜨거운 플레이트에서 미세 유체 장치를 제거하고 실온으로 냉각하십시오. 30분간 진공을 적용하여 PDMS에서 공기를 제거합니다.기공 구획을 포함하는 베이스를 생산하려면 고정밀 마이크로 밀링을 사용하여 기본 PMMA 층에서 0.5 밀리미터를 제거하고 고무 O 링의 경우 1.1 x 1.1 밀리미터 크기의 홈을 밀링하십시오. 입구와 출구를 위해 두 개의 나사 구멍을 뚫고 유체 장치의 상단 부분과 나사에 대한 12 구멍을 뚫습니다. 이것은 유체 장치의 뚜껑 역할을합니다.유체 장치를 청소한 후 12개의 나사 구멍을 사용하여 베이스와 뚜껑을 함께 나사로 연결합니다. 진공에서 미세 유체를 제거하고 현미경 단계에 배치합니다. 주사기 펌프를 사용하여 운동성 버퍼로 포화시합니다.브라이트필드 현미경 검사법 또는 위상 대비를 사용하여 배율을 조정하여 개별 세균 세포를 시각화하고 관찰 채널의 중심에 집중합니다. 광 경로 설정을 형광 현미경 검사법으로 전환합니다. 오프셋과 카메라 노출 시간을 통해 초점을 조정하여 개별 세균 세포를 해결합니다.이 경우 100밀리초. 다음으로, 세균 현탁액을 포함하는 2 밀리리터 튜브에 입구 튜브를 삽입합니다. 펌프 방향을 반전하고 분당 1마이크로리터의 유속도로 서스펜션을 철회하기 시작합니다.전체 관측 채널의 단면을 스캔하여 분마다 이미지를 기록합니다. 이미지를 원하는 소프트웨어 플랫폼으로 가져옵니다. 파티클이 기록되지 않았을 때 배경을 첫 번째 이미지의 평균으로 기록합니다.각 이미지의 배경을 빼서 카메라 노이즈와 광학 수차를 제거합니다. 이미지를 관심 영역으로 자르는 것입니다. 임계값보다 큰 값이 세균 세포를 포함하도록 세포 형광 픽셀 강도와 동일한 임계값을 식별합니다.이미지 처리를 사용하여 각 그림에서 임계값값을 뺍니다. 결과 이미지를 비나이즈하여 박테리아 세포가 하나의 값을 차지하지만 배경은 0의 값을 차지합니다. 픽셀에서 가장 작은 세균 세포 크기보다 작은 영역으로 픽셀 클러스터를 제거합니다.바이나화된 이미지를 합하여 나머지 클러스터의 총 픽셀 수를 가져옵니다. 픽셀 수를 픽셀 단위로 나누어 셀 수의 추정치를 얻습니다. 밀리리터당 입자의 농도로 카운트를 변환합니다.주입된 세균 현탁액의 농도를 식별하려면 주사기가 있는 깨끗한 미세 유체 장치의 관찰 채널에 세균 현탁액을 주입하십시오. 이미지를 기록하고 이전에 표시된 대로 인부유성 세균 농도를 계산합니다. 유천성 세균 농도 C0로 유출세균 농도 C를 정상화하고 C0 을 통해 C를 시간 동안 플로팅하여 획기적인 곡선을 시각화한다.다공성 매트릭스를 통해 수송되는 박테리아의 국소 속도 및 궤적을 분석하기 위해 현미경 단계를 관심 영역으로 이동하고 미세 유체 장치의 중심으로 초점을 조정한다. 광학 구성을 위상 대비 또는 형광 현미경검사로 설정합니다. 시간 경과 이미지와 노출 시간을 충분히 짧게 기록하여 세균 변위를 포착합니다.이 경우 50밀리초입니다. 예를 들어 3분 동안 충분한 시간 동안 사진을 기록합니다. 각 이미지에서 노이즈를 제거하려면 기록된 모든 이미지의 평균인 배경을 뺍니다.숫자 그라데이션의 계수를 결정하고 최대 값으로 정규화합니다. 세균 좌표및 이미지 수집 시간을 3열 파일로 찾아 기록합니다. 파티클 추적 분석을 수행하여 기록된 데이터를 처리하고 궤적을 계산합니다.증착 프로파일을 얻으려면, 전 전체 다공성 채널의 복합 이미지를 기록하였고, 이는 미세유체 장치를 통해 세균현탁액의 배경및 주입 후이다. 세균 주사 후 기록 된 이미지에서 배경을 제거합니다. 증착 프로파일 D를 다공성 채널의 길이 x의 횡단 구간을 따라 세균형 형광 신호의 합으로 계산한다.증착 프로파일을 다공성 채널 길이 에 비해 국소 형광 신호로 시각화합니다. 자동 디스펜서를 설정하려면 로봇 디스펜서를 유체 장치 가까이에 두는 다. 로봇 디스펜서를 BCNC를 실행하는 컴퓨터에 연결하고 올바른 컴 포트를 식별합니다.BCNC에서 홈 버튼을 클릭하여 로봇 디스펜서를 홈 위치로 반환합니다. 연동 펌프를 50cm 길이, 1mm 내경 튜브, 동일한 튜브를 사용하는 자동 디스펜서와 유출을 사용하여 입구와 연결합니다. 유체 장치를 통해 배양 배지를 펌핑합니다.로봇 디스펜서에 고정된 콘센트 튜브에 매체가 도착하여 유출을 수집하는 96웰 플레이트를 배치합니다. 동시에, 로봇 디스펜서를 활성화하고 분당 0.2 밀리리터의 유량으로 PMMA 유체 장치를 통해 세균 현탁액을 주입한다. 여러 모공 볼륨에 해당하는 세균 현탁액을 주입하십시오.예를 들어, 유체 장치의 30 배 부피. 주사 후, 실험이 끝날 때까지 멸균 재배 배지로 전환한다. 96웰 플레이트가 완성되면 플레이트를 덮고 혈류 세포 분석이 될 때까지 섭씨 4도에 보관하십시오.유동 세포측정을 사용하여 샘플을 분석하고 유입성 세균 농도 C0을 정상화하고 C0 대 시간 동안 C를 플로팅하여 획기적인 곡선을 시각화합니다. 본 연구에서는, 모틸및 비운동성 슈도모나스 푸티다 KT2440을 모두 사용하여, 임의의 기둥 배열을 가진 PDMS 미세유체 장치에서 순차적인 실험을 수행하였다. 분공 스케일의 세균 궤적뿐만 아니라 주입된 세포의 농도로 정규화된 획기적인 곡선이 여기에 나와 있다.PMMA에서 분쇄된 대규모 유체 장치를 위한 실험도 수행하였다. 모틸및비운동성 슈도모나스 푸티다 KT2440은 정기적으로 이격된 다공성 매트릭스에 주입되었다. 놀랍게도, 생물막이 없는 다공성 환경에서, 모틸및 비운동성 슈도모나스 푸티다 KT2440은 획기적인 곡선을 기반으로 현저하게 다른 운송 동작을 보였다.복잡한 스트림 생물막 커뮤니티와 함께 48시간 동안 식민지화된 다공성 매트릭스에서, 모틸과 비운동성 슈도모나스 푸티다 KT2440 사이의 획기적인 곡선의 차이는 사라졌다. 우리는 이 시스템을 사용하여 스트림에서 세균 수송을 연구하지만, 이러한 도구는 다른 엔지니어링 및 환경 시스템에서 세균 수송 현상을 연구하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다. 수화 다공성 매체를 통한 세균 성 수송은 여러 공간 저울을 통해 공정을 캡슐화합니다.여기서 제시된 방법론은 전체 다공성 매체에서 미세한 수송에 게 모공 규모에 박테리아의 국소 변위를 연결할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Environment

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

준비 및 시험 독성에 대한 신속한 평가 음주의 물 샘플에 대한 RTgill-W1 세포와 유체 바이오칩을 임피던스 기반

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

연구

환경과학

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

추출 및 토양의 미생물 인지질 지방산의 분석

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems (PEMS) for the Real-driving Emissions (RDE) Regulation in Europe

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems PEMS for the Real-driving Emissions RDE Regulation in Europe

유럽에서 실시간 구동 배출량 (RDE) 규제를위한 휴대용 배기 가스 측정 시스템 (PEMS)의 구현

Vehicles are tested in controlled and relatively narrow laboratory conditions to determine their official emission values and reference fuel consumption. ...

Using Pharmacological Manipulation and High-precision Radio Telemetry to Study the Spatial Cognition in Free-ranging Animals

자유에 이르기까지 동물의 공간인지를 연구하는 약리 조작 및 고정밀 라디오 텔레 메 트리를 사용하여

An animal&#39;s ability to perceive and learn about its environment plays a key role in many behavioral processes, including navigation, migration, ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

수성 미디어에 나노 재료의 분산: 프로토콜 최적화 쪽으로

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Microfluidic Devices for Characterizing Pore-scale Event Processes in Porous Media for Oil Recovery Applications

다공성 매체에 있는 기 공-규모 이벤트 프로세스 오일 복구 응용 프로그램에 대 한 특성화를 위한 미세 장치

Microfluidic devices are versatile tools for studying transport processes at a microscopic scale. A demand exists for microfluidic devices that are ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Cytometry와 수생 Biofilms의 특성

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Metal Corrosion and the Efficiency of Corrosion Inhibitors in Less Conductive Media

금속 부식 및 보다 적게 전도성 매체에서 부식 억제제의 효율성

Material corrosion can be a limiting factor for different materials in many applications. Thus, it is necessary to better understand corrosion processes, ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

절연 및 토양, Rhizosphere, 및 다년생 잔디 실험에 뿌리에서 미생물 커뮤니티의 분석

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Characterizing Microbiome Dynamics ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œ Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

특성화 미생물 역학-Cytometry 워크플로 순수 문화에서 자연 커뮤니티를 기반으로

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...