Name: combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales
Uploaded: 2020-11-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales at JoVE.com

Vi anerkjenner hjelp fra Antoine Wiedmer med oppsettet av robotdispenseren og dispenser.py skriptet.

1. Bakterielle kulturforhold
<ol><li>Arbeider under en laminær strømningshette, bruk 100 μL av en glyserol lager av GFP-merket Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 ml-1, lagret ved -80 °C) for å inokulere 5 ml Luria-Bertani (LB) medium. Inkuber ved 30 °C mens du rister ved 250 o/min over natten.</li>
	<li>Neste dag, resuspend 100 μL av natten kultur i 5 ml LB medium og inkubere under de samme forholdene for 5t (eksponentiell fase). Prøv en 1 ml aliquot inn i en 2 ml rør, la avkjø...

<ol>
	<li>Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+and+removal+of+pathogenic+bacteria+in+wastewater+percolating+through+porous+media:+a+review.">Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review.</a> Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).</li><li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues.">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li><li>Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processes+in+microbial+transport+in+the+natural+subsurface.">Processes in microbial transport in the natural subsurface.</a> Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).</li><li>Tufenkji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+microbial+transport+in+porous+media:+Traditional+approaches+and+recent+developments.">Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments.</a> Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).</li><li>Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+modelling+straining+of+Escherichia+coli+in+saturated+porous+media.">Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media.</a> Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).</li><li>Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+and+biogeochemistry+of+stream+biofilms.">The ecology and biogeochemistry of stream biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).</li><li>Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+biophysical+underpinnings+to+the+success+of+multispecies+biofilms+in+porous+environments.">Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments.</a> The ISME Journal. 1, (2019).</li><li>Carrel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+in+3D+porous+media:+Delineating+the+influence+of+the+pore+network+geometry,+flow+and+mass+transfer+on+biofilm+development.">Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development.</a> Water Research. 134, 280-291 (2018).</li><li>Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+hopping+and+trapping+in+porous+media.">Bacterial hopping and trapping in porous media.</a> Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).</li><li>Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trait-specific+dispersal+of+bacteria+in+heterogeneous+porous+environments:+from+pore+to+porous+medium+scale.">Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale.</a> Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).</li><li>Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+preferential+flow+paths+perpetuated+by+microbial+activity+in+the+soil+matrix?+A+review.">Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review.</a> Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).</li><li>Creppy, A., Cl&#233;ment, E., Douarche, C., D'Angelo, M. V., Auradou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+motility+on+the+transport+of+bacteria+populations+through+a+porous+medium.">Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium.</a> Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).</li><li>Camesano, T. A., Logan, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Fluid+Velocity+and+Cell+Concentration+on+the+Transport+of+Motile+and+Nonmotile+Bacteria+in+Porous+Media.">Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media.</a> Environmental Science &amp; Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).</li><li>Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+surface+characteristics+on+the+transport+of+multiple+Escherichia+coli+isolates+in+large+scale+columns+of+quartz+sand.">The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand.</a> Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).</li><li>Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+biofilm+on+bacterial+transport+and+deposition+in+porous+media.">Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media.</a> Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).</li><li>Long, T., Ford, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Transverse+Migration+of+Bacteria+by+Chemotaxis+in+a+Porous+T-Sensor.">Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor.</a> Environmental Science &amp; Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).</li><li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+Expanding+the+Frontiers+of+Microbial+Ecology.">Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology.</a> Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Digital+Video+Microscopy+for+Colloidal+Studies.">Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+determination+of+bacterial+abundance+in+lake+plankton+with+the+green+nucleic+acid+stain+SYTO+13.">Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13.</a> Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).</li></ol>

Her foreslår vi to måter å studere transport av mikrober gjennom porøse systemer på encellet og befolkningsnivå. Mens studien av transportfenomener ved hjelp av BTC-modellering har gitt verdifull innsikt i spredningen av patogener eller forurensninger på økosystemskalaene, eksisterer det fortsatt vanskeligheter med å skalere fra laboratorieeksperimenter til feltforhold. Verktøyene som er beskrevet her, gjør det mulig for forskere å eksperimentelt løse de romlige og timelige skalaene for å bedre forstå mikr...

Studier som tar sikte på å forstå transport av mikrober gjennom porøse medier har hovedsakelig vært drevet av bekymringer for forurensning1,overføring avsykdom 2 og bioremediation3. I denne forbindelse har bakterier for det meste blitt behandlet som partikler i transportmodeller4, og prosesser som filtrering, belastning, gravitasjonsoppgjør eller remobilisering fra biofilmer har blitt identifisert som drivere for oppbevaring eller transport av mikrober5. Men å studere transport av bakterier gjennom porøs landskap kan også informere oss om de økologiske strategiene som underbygger deres suksess i disse komplekse miljøene. Likevel krever dette nye eksperimenter og matematiske modeller som opererer på enkeltcelle, befolkning eller mikrobiell samfunnsnivå.
Naturlige porøse miljøer, som de som finnes i den hyporheiske sonen av bekker og elver, koloniseres tett av ulike samfunn av biofilmdannende mikrober6. Biofilmer danner strukturer som endrer strømmen og dermed transport og spredning av bakterier i væskefase7,8. Transport av bakterier i poreskalaen avhenger av begrenset plasstilgjengelighet i porøs matrise og motilitetsrelatert spredning kan være en effektiv måte å øke den individuelle formen gjennom redusert konkurranse om ressurser i mindre tett befolkede områder. På den annen side kan motile bakterier også nå mer isolerte områder av porøs matrise, og den utvidede utforskningen av slike områder kan gi økologiske muligheter til motilepopulasjoner 10. Ved større romlige skalaer avleder biofilmveksten strømningsbanene som også fører til (delvis) tilstopping av porer og dermed til etablering av enda mer kanaliserte og heterogene strømningsforhold11. Dette har konsekvenser for næringsforsyning og spredningskapasitet, frekvens og avstand. Fortrinnsrett flyt, for eksempel, kan generere såkalte "fast-spor" og motile bakterier kan oppnå enda høyere hastigheter enn den lokale flyten langs dissesporene 12. Dette er en effektiv måte å øke utforskningen av nye habitater på.
En rekke verktøy benytte seg for studiet av transport av motile og ikke-motile bakterier (og partikler) i porøse medier. Numeriske modeller har stor prediktiv kapasitet som er viktige for applikasjoner, men er ofte begrenset av iboende antagelser4. Laboratorieskala eksperimenter13,14 kombinert med banebrytende kurve (BTC) modellering har gitt viktig innsikt i viktigheten av bakterielle celle overflateegenskaper for å stikke effektivitet15. Vanligvis oppnås BTCer (det vil vil vil vil at tider serie med partikkelkonsentrasjon på et fast sted) oppnås via konstanthastighetsutgivelser og måling av celletall ved utløpet av den eksperimentelle enheten. I denne sammenheng reflekterer BTCene adveksjonsspredningsdynamikken til bakterier i porøs matrise og kan utvides med et synkebelegg som står for vedlegg. Modellering av BTCer alene løser imidlertid ikke rollen som romlig organisering av porøs substrat eller biofilm for transportprosesser. Andre makroskopiske observerbare enheter som dispersivitet eller deponeringsprofiler har vist seg å gi viktig informasjon om romlig fordeling eller de beholdt partiklene eller voksende samfunnene. Microfluidics er en teknologi som gjør det mulig å studere transport i porøse medier ved mikroskopiundersøkelse9,,12,,16,og bortsett fra et nylig arbeid10,er eksperimentelle systemer vanligvis begrenset til en enkelt lengde skala av oppløsning, det vil si poreskalaen eller hele fluidisk enhetsskala.
Her introduserer vi en rekke kombinerte metoder for å studere transport av motile og ikke-motile bakterier i porøs landskap i forskjellige skalaer. Vi kombinerer observasjoner av bakteriell transport i poreskalaen med informasjon i større skala, ved hjelp av BTC-analyse. Mikrofluidiske enheter bygget av myk litografi ved hjelp av polydimetylsiloxane (PDMS) er biokompatibele, motstandsdyktige mot en rekke kjemikalier, tillater replikerbarhet til lave kostnader og gir utmerket optisk gjennomsiktighet samt lav autofluorescens kritisk for mikroskopisk observasjon. Mikrofluidics basert på PDMS har tidligere blitt brukt til å studere transport av mikrober i enklekanaler 17 eller i mer komplekse geometrier12. Imidlertid fokuserer typisk mikrofluidics eksperimenter på kortsiktige horisonter og epi-fluorescens mikroskopisk observasjon av levende celler er ofte begrenset til genmodifiserte stammer (f.eks GFP-merkede stammer). Her presenterer vi verktøy for å studere bakteriell transport ved hjelp av PDMS-baserte mikrofluidiske enheter i kombinasjon med mikroskopi og større enheter fabrikkert fra poly(metylmetakkrylat) (PMMA, også kjent som plexiglass) i kombinasjon med strømningscytometri. PDMS og PMMA varierer i gasspermeabilitet og overflateegenskaper, og gir dermed komplementære muligheter til å studere bakteriell transport. Mens den mikrofluidiske enheten gir et mer kontrollert miljø, gjør den større enheten mulighet for eksperimenter over lengre perioder eller bruk av naturlige bakterielle samfunn. Mikroskopitelling ved høy temporal oppløsning i et dedikert område brukes til å skaffe BTC i den PDMS-baserte mikrofluidiske enheten. For å få celletellinger for BTC-modellering fra den PMMA-baserte enheten, introduserer vi en selvkonstruert automatisert væskedispenser i kombinasjon med strømningscytometri. I dette oppsettet passerer cellene den fluidiske enheten og blir etterfølgende dispensert i 96 brønnplater. Den timelige oppløsningen er begrenset av minimumsvolumet som kan dispenseres nøyaktig og dermed middels strømningshastighet gjennom den fluidiske enheten. Fikseringsmiddel i brønnene forhindrer vekst og letter DNA-farging for nedstrøms strømningscytokometriske opplisting. For å forhindre bakteriell vekst under transporteksperimenter bruker vi en minimal medium (be sikt motilitetsbuffer).
Siden protokoller for fremstilling av fluidiske enheter i forskjellige skalaer er lett tilgjengelige, introduserer vi bare kort teknikkene for å produsere slike enheter og heller fokusere på eksperimentelle prosedyrer for å registrere BTCer. På samme måte finnes det ulike rutiner for flytcytokometrisk opplisting av mikrober og brukere krever ekspertkunnskap for å tolke resultater oppnådd ved strømningscytometri. Vi rapporterer den nye bruken av mikrofluidiske enheter i kombinasjon med mikroskopisk bildebehandling for å registrere BTCer av fluorescerende merkede celler. På poreskalaen oppnås lokale hastigheter og baner ved hjelp av bildebehandling. Videre demonstrerer vi bruken av en PMMA-basert fluidisk enhet i kombinasjon med flow-cytometrisk telling for å observere bakteriell transport av motile og ikke-motile celler i porøse miljøer kolonisert av en innfødt stream biofilm.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastomer Sylgard 184</td>
			<td>Dowsil</td>
			<td>101697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer NovoCyte</td>
			<td>Acea</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit</td>
			<td>makeblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axio Imager</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope AxioZoom v16</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 75 mm &#215; 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 3 peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma bonder Corona SB</td>
			<td>BlackHole Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump New Era NE 4000</td>
			<td>New Era</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF31SA universal milling machine</td>
			<td>Mikron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales

Å forstå transport, spredning og avsetning av mikroorganismer i porøse medier er en kompleks vitenskapelig oppgave bestående av emner så forskjellige som hydrodynamikk, økologi og miljøteknikk. Modellering av bakteriell transport i porøse miljøer i ulike romlige skalaer er avgjørende for å bedre forutsi konsekvensene av bakteriell transport, men dagens modeller klarer ofte ikke å oppskalere fra laboratorie-til-feltforhold. Her introduserer vi eksperimentelle verktøy for å studere bakteriell transport i porøse medier på to romlige skalaer. Målet med disse verktøyene er å oppnå makroskopiske observerbare (for eksempel gjennombruddskurver eller avsetningsprofiler) av bakterier injisert i gjennomsiktige porøse matriser. I liten skala (10-1000 μm) kombineres mikrofluidiske enheter med optisk videomikroskopi og bildebehandling for å oppnå gjennombruddskurver og samtidig spore individuelle bakterielle celler i poreskalaen. I større skala kombineres strømningscytometri med en selvskapt robotdispenser for å oppnå gjennombruddskurver. Vi illustrerer nytten av disse verktøyene for å bedre forstå hvordan bakterier transporteres i komplekse porøse medier som den hypoheiske sonen av bekker. Etter hvert som disse verktøyene gir samtidige målinger på tvers av skalaer, baner de vei for mekanismebaserte modeller, kritisk viktige for oppskalering. Anvendelse av disse verktøyene kan ikke bare bidra til utviklingen av nye bioremediation applikasjoner, men også kaste nytt lys over de økologiske strategiene for mikroorganismer kolonisere porøse substrater.

For å illustrere funksjonaliteten til den presenterte arbeidsflyten utførte vi eksperimenter ved hjelp av genmodifiserte Pseudomonas putida KT2440, en gram negativ motil bakterie som er viktig for bioremediering og bioteknologi. Genmodifiserte versjoner av denne stammen som uttrykker GFP-produksjon er kommersielt tilgjengelige. En ikke-motil stamme av P. putida KT2440 som mangler relevante strukturelle og regulatoriske gener for motilitet er også tilgjengelig. Ved hje...

Watch this Scientific Journal Video about Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales at JoVE.com

Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

Banebrytende kurver (BTCer) er effektive verktøy for å studere transport av bakterier i porøse medier. Her introduserer vi verktøy basert på fluidiske enheter i kombinasjon med mikroskopi og flytcytokometrisk telling for å oppnå BTCer.

Kombinere fluidiske enheter med mikroskopi og strømningscytometri for å studere mikrobiell transport i porøse medier på tvers av romlige skalaer

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

Å studere transport av bakterier i porøse systemer er viktig med hensyn til forurensning, spredning av sykdom og bioremediering. For disse eksperimentene i matematiske modeller som opererer på enkeltcelle, er befolkningen og mikrobiell samfunnsnivå nødvendig. Her presenterer vi verktøy for å studere bakteriell transport ved hjelp av mikrofluidiske enheter og mikroskopi, samt større enheter i kombinasjon med strømningscytometri.Kombinasjonen av mikrofluidiske enheter med mikroskopi og strømningscytometri gir en rekke muligheter til å studere bakterielle transportfenomener på forskjellige romlige skalaer. For å fullt ut utforske denne protokollen, er det foreslått å ha tidligere erfaring i mikroskopi, grunnleggende bildebehandling, design av mikrofluidiske enheter og mestring flyt cytometri. Denne videoen beskriver to metoder for å studere bakteriell transport på forskjellige romlige skalaer.Den første metoden, basert på mikrofluidiske enheter, er avhengig av mikroskopi for å telle individuelle celler. Dette systemet kan brukes til å studere bakteriell transport på tvers av flere romlige skalaer fra porene til hele porøse systemskalaen. Den andre metoden, ved hjelp av større fluidiske enheter kombinert med en automatisert dispenser og strømningscytometri, kan brukes til å studere bakteriell transportfenomen på skalaen av hele porøse systemer.Slike metoder kan også distribueres i laboratorieskala kolonnestudier, samt små feltundersøkelser. For å begynne, designe ønsket porøs geometri som består av en matrise av sirkler. Basert på den valgte geometrien, lag en mold ved hjelp av standard SU-8 fotolitografi.Forbered 50 gram PDMS ved å tilsette 90 % av elastomer til 10 % av herdingsmiddelet til 90 % av elastomer etter vekt i en ren engangsbeholder og bland de to reagensene med et rent verktøy. Påfør et vakuum på 100 millibar i 30 minutter for å fjerne oppløst luft og bobler. Legg formen i en petriskål og hell PDMS på formen til ønsket høyde mellom to og fem millimeter.Dekk petriskålen med et lokk og hold den på 60 grader Celsius i minst fire timer. Deretter lar mikrofluidisk enhet avkjøles til romtemperatur. Når den er avkjølt, fjern forsiktig den ønskede delen av PDMS med en skalpell.Tet midlertidig bunnen av PDMS-kanalen med tape. Med en 0,5 millimeter diameter puncher, pierce kanaler for å skape et innløp og et uttak. Fjern båndet fra PDMS-kanalen og plasser kanalen med den porøse siden vendt opp.Behandle glasssklie og PDMS overflater med plasma i ca 45 sekunder hver ved romtemperatur. Plasser den forbehandlede PDMS-kanalen på det forbehandlede glassskliet og varm ved 100 grader Celsius i 30 minutter på en kokeplate, fjern deretter mikrofluidisk enhet fra kokeplaten og avkjøl den til romtemperatur. Påfør vakuum i 30 minutter for å fjerne luft fra PDMS.For å produsere basen som inneholder porerommet, bruk høypresisjons mikrofresing for å fjerne 0,5 millimeter fra det grunnleggende PMMA-laget og male et spor på størrelse med 1,1 med 1,1 millimeter for en gummi O-ring. Bor to gjengede hull for et innløp og utløp i den øverste delen av den fluidiske enheten og 12 hull for skruer. Dette fungerer som lokket på den fluidiske enheten.Etter rengjøring av den fluidiske enheten skrur du bunnen og lokket sammen ved hjelp av de 12 gjengede hullene. Fjern mikrofluidikken fra vakuum og plasser den på mikroskopstadiet. Bruk sprøytepumpen til å mette den med motilitetsbuffer.Bruk Brightfield-mikroskopi eller fasekontrast, juster forstørrelsen for å visualisere individuelle bakterielle celler og fokusere på midten av observasjonskanalen. Sett lysbaneinnstillingene til fluorescensmikroskopi. Juster fokus gjennom en forskyvning og kameraets eksponeringstid for å løse individuelle bakterieceller.I dette tilfellet, 100 millisekunder. Deretter setter du inn innløpsslangen i et to milliliter rør som inneholder bakteriesuspensjonen. Snu pumperetningen og begynn å trekke fjæringen med en strømningshastighet på én mikroliter per minutt.Skann tverrsnittet av hele observasjonskanalen, og ta opp et bilde hvert minutt. Importer bilder til en ønsket programvareplattform. Ta opp bakgrunnen som gjennomsnittet av de første bildene når ingen partikler er registrert.Trekk bakgrunnen fra hvert bilde for å fjerne kamerastøy og optisk avvik. Beskjær bildene til et område av interesse. Identifiser en terskelverdi som er lik cellefluorescenspikselintensiteten, slik at verdier som er større enn terskelen, inkluderer bakterielle celler.Bruk bildebehandling til å trekke terskelverdien fra hvert bilde. Binarize det resulterende bildet slik at bakterielle celler tar en verdi av en, mens bakgrunnen tar en verdi på null. Fjern klynger av piksel med et område som er mindre enn den minste bakterielle cellestørrelsen i piksler.Summer det binariserte bildet for å få det totale antallet piksler for de gjenværende klyngene. Del antall piksler med den gjennomsnittlige størrelsen på en bakteriell celle i piksler for å få et estimat av antall celler. Forvandle tellingene til konsentrasjon i partikler per milliliter.For å identifisere konsentrasjonen av den injiserte bakteriesuspensjonen, injiser bakteriesuspensjonen i observasjonskanalen til en ren mikrofluidisk enhet med en sprøyte. Ta opp bildet og beregn den influent bakterielle konsentrasjonen som tidligere vist. Visualiser gjennombruddskurver ved å normalisere den avløpsbakterielle konsentrasjonen C med den influent bakterielle konsentrasjonen C0 og plotting C over C0 versus tid.For å analysere de lokale hastighetene og banene til bakterier som transporteres gjennom den porøse matrisen, flytt mikroskopstadiet til et interesseområde og juster fokuset til midten av mikrofluidisk enhet. Sett den optiske konfigurasjonen til fasekontrast eller fluorescensmikroskopi. Ta opp tidsforløpsbilder og en eksponeringstid kort nok til å fange bakteriell forskyvning.I dette tilfellet, 50 millisekunder. Ta opp bilder over tilstrekkelig tid, for eksempel tre minutter. Hvis du vil fjerne støy fra hvert bilde, trekker du bakgrunnen, som er gjennomsnittet av summen av alle innspilte bilder.Bestem modulen til den numeriske graderingen og normaliser den med maksimumsverdien. Finn og registrer bakterielle koordinater og tidspunktet for bildeinnhenting i en fil med tre kolonner. Utfør partikkelsporingsanalyse for å behandle de registrerte dataene og beregne banene.For å få deponeringsprofiler, ta opp et sammensatt bilde av hele porøs kanal før, det vil si bakgrunnen, og etter injeksjon av bakteriell suspensjon gjennom mikrofluidisk enhet. Fjern bakgrunn fra bildene som er tatt opp etter bakteriell injeksjon. Beregne avsetningsprofilen D som summen av bakteriefluorescenssignalet langs tverrgående deler av lengden x av den porøse kanalen.Visualiser avsetningsprofilen som det lokale fluorescenssignalet kontra porøs kanallengde. For å sette opp den automatiske dispenseren plasserer du robotdispenseren nær den fluidiske enheten. Koble robotdispenseren til datamaskinen som kjører BCNC, og identifiser riktig com-port.I BCNC klikker du på hjem-knappen for å returnere robotdispenseren til hjemmeposisjonen. Koble den peristaltiske pumpen til innløpet ved hjelp av 50 centimeter lang, en millimeter indre diameter rør, og utstrømningen med den automatiserte dispenseren ved hjelp av samme slange. Pump dyrkingsmedium gjennom den fluidiske enheten.Legg merke til at mediet kommer ved utløpsslangen som er festet til robotdispenseren, og plasser en 96-brønnsplate som samler utstrømningen. Samtidig aktiverer du robotdispenseren og injiserer bakteriesuspensjonen gjennom PMMA-fluidenheten med en strømningshastighet på 0,2 milliliter per minutt. Injiser bakteriell suspensjon tilsvarende flere porevolumer.For eksempel 30 ganger volumet av den fluidiske enheten. Etter injeksjon, bytt til steril dyrking medium til slutten av eksperimentet. Når en 96-brønns plate er fullført, dekk platen og oppbevar ved fire grader Celsius til strømningscytometrianalyse.Analyser prøver med strømningscytometri og visualiser gjennombruddskurver ved å normalisere den avløpsbakterielle konsentrasjonen C med den influent bakterielle konsentrasjonen C0 og plotte C over C0 versus tid. I denne studien, ved hjelp av både motile og ikke-motile Pseudomonas putida KT2440, ble sekvensielle eksperimenter utført i PDMS mikrofluidiske enheter med et tilfeldig utvalg av søyler. Gjennombruddskurver normalisert til konsentrasjonen av injiserte celler, samt bakterielle baner på poreskalaen er vist her.Eksperimenter med store fluidiske enheter malt fra PMMA ble også utført. Motile og ikke-motile Pseudomonas putida KT2440 ble injisert i en regelmessig fordelt porøs matrise. Påfallende, i et porøs miljø blottet for biofilm, motil og ikke-motile Pseudomonas putida KT2440 viste en markant annen transport atferd basert på gjennombrudd kurver.I en porøs matrise kolonisert i 48 timer med et komplekst stream biofilmsamfunn, forsvant disse forskjellene i gjennombruddskurver mellom motile og ikke-motile Pseudomonas putida KT2440. Vi bruker dette systemet til å studere bakteriell transport i bekkene, men disse verktøyene kan lett justeres for å studere bakterielle transportfenomener i andre konstruerte og miljømessige systemer. Bakteriell transport gjennom hydrerte porøse medier innkapsler prosesser over flere romlige skalaer.Metodikken her som presenteres gjør det mulig å knytte den lokale forskyvningen av bakterier i poreskalaen til mikroskopisk transport på hele porøs medium.

Research

JoVE Journal

Environment

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Utarbeidelse og testing av Impedans baserte fluidic biochips med RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluering av drikkevann Prøver for Toxicity

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Utvinning og analyse av Microbial fosfolipid fettsyrer i jordsmonn

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems (PEMS) for the Real-driving Emissions (RDE) Regulation in Europe

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems PEMS for the Real-driving Emissions RDE Regulation in Europe

Implementering av bærbare Utslipp Measurement Systems (PEM) for Real-kjøre utslipp (rde) forordning i Europa

Vehicles are tested in controlled and relatively narrow laboratory conditions to determine their official emission values and reference fuel consumption. ...

Using Pharmacological Manipulation and High-precision Radio Telemetry to Study the Spatial Cognition in Free-ranging Animals

Bruke Farmakologisk Manipulasjon og høy presisjon Radio Telemetri å studere Spatial Cognition i frittgående dyr

An animal&#39;s ability to perceive and learn about its environment plays a key role in many behavioral processes, including navigation, migration, ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

Spredning av nanomaterialer i vandige Media: mot protokollen optimalisering

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Microfluidic Devices for Characterizing Pore-scale Event Processes in Porous Media for Oil Recovery Applications

Microfluidic enheter for å karakterisere Pore skala hendelse prosesser i porøse medier for olje utvinning programmer

Microfluidic devices are versatile tools for studying transport processes at a microscopic scale. A demand exists for microfluidic devices that are ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Karakteristikk av akvatiske biofilm med flowcytometri

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Metal Corrosion and the Efficiency of Corrosion Inhibitors in Less Conductive Media

Metall korrosjon og effektiviteten av korrosjonshemmere i mindre ledende medier

Material corrosion can be a limiting factor for different materials in many applications. Thus, it is necessary to better understand corrosion processes, ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Isolering og analyse av mikrobielle samfunn i jord, Rhizosphere og røtter i staude gresset eksperimenter

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Characterizing Microbiome Dynamics ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œ Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Karakterisere Microbiome Dynamics-flowcytometri basert arbeidsflyter fra ren kulturer naturlig samfunn

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...