Name: combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales
Uploaded: 2020-11-25T14:00:00
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Reconhecemos a ajuda de Antoine Wiedmer com a configuração do dispensador robótico e o dispenser.py roteiro.

1. Condições de cultura bacteriana
<ol><li>Trabalhando sob uma capa de fluxo laminar, use 100 μL de um estoque de glicerol de Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 mL-1, armazenado a -80 °C) para inocular 5 mL de meio Luria-Bertani (LB). Incubar a 30 °C enquanto treme a 250 rpm durante a noite.</li>
	<li>No dia seguinte, resuspense 100 μL da cultura noturna em 5 mL LB médio e incubar sob as mesmas condições por 5h (fase exponencial). Prove uma alíquota de 1 mL em um tubo de 2 mL, ...

<ol>
	<li>Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+and+removal+of+pathogenic+bacteria+in+wastewater+percolating+through+porous+media:+a+review.">Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review.</a> Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).</li><li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues.">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li><li>Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processes+in+microbial+transport+in+the+natural+subsurface.">Processes in microbial transport in the natural subsurface.</a> Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).</li><li>Tufenkji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+microbial+transport+in+porous+media:+Traditional+approaches+and+recent+developments.">Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments.</a> Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).</li><li>Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+modelling+straining+of+Escherichia+coli+in+saturated+porous+media.">Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media.</a> Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).</li><li>Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+and+biogeochemistry+of+stream+biofilms.">The ecology and biogeochemistry of stream biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).</li><li>Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+hopping+and+trapping+in+porous+media.">Bacterial hopping and trapping in porous media.</a> Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).</li><li>Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trait-specific+dispersal+of+bacteria+in+heterogeneous+porous+environments:+from+pore+to+porous+medium+scale.">Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale.</a> Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).</li><li>Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+preferential+flow+paths+perpetuated+by+microbial+activity+in+the+soil+matrix?+A+review.">Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review.</a> Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).</li><li>Creppy, A., Cl&#233;ment, E., Douarche, C., D'Angelo, M. V., Auradou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+motility+on+the+transport+of+bacteria+populations+through+a+porous+medium.">Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium.</a> Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).</li><li>Camesano, T. A., Logan, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Fluid+Velocity+and+Cell+Concentration+on+the+Transport+of+Motile+and+Nonmotile+Bacteria+in+Porous+Media.">Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media.</a> Environmental Science &amp; Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).</li><li>Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+surface+characteristics+on+the+transport+of+multiple+Escherichia+coli+isolates+in+large+scale+columns+of+quartz+sand.">The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand.</a> Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).</li><li>Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+biofilm+on+bacterial+transport+and+deposition+in+porous+media.">Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media.</a> Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).</li><li>Long, T., Ford, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Transverse+Migration+of+Bacteria+by+Chemotaxis+in+a+Porous+T-Sensor.">Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor.</a> Environmental Science &amp; Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).</li><li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+Expanding+the+Frontiers+of+Microbial+Ecology.">Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology.</a> Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Digital+Video+Microscopy+for+Colloidal+Studies.">Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+determination+of+bacterial+abundance+in+lake+plankton+with+the+green+nucleic+acid+stain+SYTO+13.">Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13.</a> Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).</li></ol>

Aqui sugerimos dois meios para estudar o transporte de micróbios através de sistemas porosos no nível unicelular e populacional. Embora o estudo dos fenômenos de transporte usando modelagem de BTC tenha fornecido insights valiosos sobre a disseminação de patógenos ou contaminantes nas escalas do ecossistema, as dificuldades de dimensionar de experimentos de laboratório para condições de campo ainda existem. As ferramentas aqui descritas permitem aos pesquisadores resolver experimentalmente as escalas espaciais ...

Estudos com o objetivo de compreender o transporte de micróbios por meio de mídia porosa têm sido impulsionados principalmente por preocupações de contaminação1, transmissão da doença2 e bioremediação3. Nesse sentido, as bactérias têm sido tratadas principalmente como partículas nos modelos de transporte4 e processos como filtragem, tensão, fixação gravitacional ou remobilização de biofilmes têm sido identificados como condutores de retenção ou transporte de micróbios5. No entanto, estudar o transporte de bactérias através de paisagens porosas também pode nos informar sobre as estratégias ecológicas que sustentam seu sucesso nesses ambientes complexos. No entanto, isso requer novos experimentos e modelos matemáticos operando em nível único de célula, população ou comunidade microbiana.
Ambientes porosos naturais, como os encontrados na zona hiporérica de córregos e rios, são densamente colonizados por diversas comunidades de micróbios formadores de biofilmes6. Os biofilmes formam estruturas que modificam o fluxo e, portanto, o transporte e dispersão de bactérias na fase líquida7,8. O transporte de bactérias em escala de poros depende da disponibilidade de espaço restrita na matriz porosa e a dispersão relacionada à motilidade pode ser uma maneira eficaz de aumentar o condicionamento físico individual através da redução da concorrência por recursos em áreas menos densamente povoadas. Por outro lado, as bactérias motile também podem atingir regiões mais isoladas da matriz porosa e a exploração prolongada dessas áreas pode proporcionar oportunidades ecológicas para as populações10. Em escalas espaciais maiores, o crescimento do biofilme desvia os caminhos de fluxo também levando ao entupimento (parcial) dos poros e, assim, ao estabelecimento de condições de fluxo ainda mais canalizadas e heterogêneas11. Isso tem consequências para o fornecimento de nutrientes e capacidade de dispersão, frequência e distância. O fluxo preferencial, por exemplo, pode gerar as chamadas "faixas rápidas" e as bactérias motile podem atingir velocidades ainda mais altas do que o fluxo local ao longo dessas faixas12. Esta é uma maneira eficaz de aumentar a exploração de novos habitats.
Uma variedade de ferramentas se aproveitam para o estudo do transporte de bactérias motile e não-motile (e partículas) em meios porosos. Modelos numéricos têm grandes capacidades preditivas importantes para aplicações, porém muitas vezes são limitados por pressupostos inerentes4. Experimentos em escala de laboratório13,14 combinados com modelagem de curva inovadora (BTC) forneceram insights importantes sobre a importância das propriedades da superfície celular bacteriana para a eficiência da aderência15. Normalmente, os BTCs (ou seja, vezes a série de concentração de partículas em um local fixo) são obtidos através de versões de taxa constante e medição de números de células no fluxo de saída do dispositivo experimental. Nesse contexto, os BTCs refletem a dinâmica de dispersão de advecção das bactérias na matriz porosa e podem ser estendidos por um termo de pia que contabiliza o apego. No entanto, a modelagem de BTCs por si só não resolve o papel da organização espacial do substrato poroso ou biofilme para processos de transporte. Outros observáveis macroscópicos, como perfis de dispersividade ou deposição, provaram fornecer informações importantes sobre a distribuição espacial ou as partículas retidas ou comunidades em crescimento. Microfluidos é uma tecnologia que permite estudar o transporte em mídia porosa por investigação de microscopia9,,12,,16, e exceto um trabalho recente10, sistemas experimentais são tipicamente limitados a uma única escala de comprimento de resolução, ou seja, a escala de poros ou toda a escala de dispositivo fluido.
Aqui, introduzimos um conjunto de métodos combinados para estudar o transporte de bactérias motile e não-motile em paisagens porosas em diferentes escalas. Combinamos observações de transporte bacteriano na escala de poros com informações em maior escala, por meio da análise do BTC. Dispositivos microfluidos construídos a partir da litografia macia usando polidimtilsiloxano (PDMS) são biocompatíveis, resistentes a uma gama de produtos químicos, permitem a replicabilidade a baixo custo e fornecem excelente transparência óptica, bem como baixa autofluorescência crítica para observação microscópica. Microfluidos baseados em PDMS tem sido usado anteriormente para estudar o transporte de micróbios nos canais simples17 ou em geometrias mais complexas12. No entanto, experimentos tipicamente microfluidos se concentram em horizontes de curto prazo e a observação microscópica epi-fluorescência de células vivas é comumente restrita a cepas geneticamente modificadas (por exemplo, cepas marcadas por GFP). Aqui apresentamos ferramentas para estudar o transporte bacteriano usando dispositivos microfluidos baseados em PDMS em combinação com microscopia e dispositivos maiores fabricados a partir de poli (metil methacrilate) (PMMA, também conhecido como plexiglass) em combinação com citometria de fluxo. PDMS e PMMA diferem na permeabilidade do gás e nas propriedades superficiais, proporcionando oportunidades complementares para estudar o transporte bacteriano. Embora o dispositivo microfluido forneça um ambiente mais controlado, o dispositivo maior permite experimentos por longos períodos de tempo ou usando comunidades bacterianas naturais. A contagem de microscopia em alta resolução temporal em uma área dedicada é usada para obter BTC no dispositivo microfluido baseado em PDMS. Para obter contagem de células para modelagem de BTC a partir do dispositivo baseado em PMMA, introduzimos um distribuidor líquido automatizado auto-construído em combinação com citometria de fluxo. Nesta configuração, as células passam o dispositivo fluido e são consecutivamente dispensadas em 96 placas de poço. A resolução temporal é restrita pelo volume mínimo que pode ser dispensado com precisão e, portanto, pela taxa média de fluxo através do dispositivo fluido. Fixação nos poços previne o crescimento e facilita a coloração do DNA para enumeração fluxo-citométrica a jusante. Para evitar o crescimento bacteriano durante os experimentos de transporte, usamos um meio mínimo (tampão de motilidade a termo).
Uma vez que os protocolos para a preparação de dispositivos fluidos em diferentes escalas estão prontamente disponíveis, apenas introduzimos brevemente as técnicas para produzir tais dispositivos e, em vez disso, focamos nos procedimentos experimentais para gravar BTCs. Da mesma forma, existem várias rotinas para a enumeração citométrica de fluxo de micróbios e os usuários exigem conhecimento especializado para interpretar resultados obtidos pela citometria de fluxo. Relatamos o novo uso de dispositivos microfluidos em combinação com imagens microscópicas para registrar BTCs de células fluorescentes marcadas. Na escala de poros, as velocidades e trajetórias locais são obtidas por meio do processamento de imagens. Além disso, demonstramos o uso de um dispositivo fluido baseado em PMMA em combinação com a contagem flutormétrica para observar o transporte bacteriano de células motile e não-motile em ambientes porosos colonizados por um biofilme de fluxo nativo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastomer Sylgard 184</td>
			<td>Dowsil</td>
			<td>101697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer NovoCyte</td>
			<td>Acea</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit</td>
			<td>makeblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axio Imager</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope AxioZoom v16</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 75 mm &#215; 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 3 peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma bonder Corona SB</td>
			<td>BlackHole Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump New Era NE 4000</td>
			<td>New Era</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF31SA universal milling machine</td>
			<td>Mikron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales

Compreender o transporte, dispersão e deposição de microrganismos na mídia porosa é uma tarefa científica complexa que compreende temas tão diversos quanto hidrodinâmica, ecologia e engenharia ambiental. A modelagem do transporte bacteriano em ambientes porosos em diferentes escalas espaciais é fundamental para prever melhor as consequências do transporte bacteriano, mas os modelos atuais muitas vezes não conseguem subir de laboratório para condições de campo. Aqui, introduzimos ferramentas experimentais para estudar o transporte bacteriano em meios porosos em duas escalas espaciais. O objetivo dessas ferramentas é obter observações macroscópicas (como curvas inovadoras ou perfis de deposição) de bactérias injetadas em matrizes porosas transparentes. Na pequena escala (10-1000 μm), os dispositivos microfluidos são combinados com microscopia de vídeo óptico e processamento de imagem para obter curvas inovadoras e, ao mesmo tempo, rastrear células bacterianas individuais na escala de poros. Em maior escala, a citometria de fluxo é combinada com um dispensador robótico auto-fabricado para obter curvas inovadoras. Ilustramos a utilidade dessas ferramentas para entender melhor como as bactérias são transportadas em mídias porosas complexas, como a zona hiporérica dos córregos. Como essas ferramentas fornecem medições simultâneas em escalas, elas abrem caminho para modelos baseados em mecanismos, criticamente importantes para o upscaling. A aplicação dessas ferramentas pode não apenas contribuir para o desenvolvimento de novas aplicações de bioremediação, mas também lançar uma nova luz sobre as estratégias ecológicas dos microrganismos colonizando substratos porosos.

Para ilustrar a funcionalidade do fluxo de trabalho apresentado, realizamos experimentos utilizando pseudomonas putida KT2440 geneticamente modificada, uma bactéria motile negativa grama importante para bioremediação e biotecnologia. Versões geneticamente modificadas desta cepa que expressam a produção de GFP estão disponíveis comercialmente. Uma cepa não motil de P. putida KT2440 que não possui os genes estruturais e regulatórios relevantes para a motilidade ...

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Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

Curvas inovadoras (BTCs) são ferramentas eficientes para estudar o transporte de bactérias em mídia porosa. Aqui introduzimos ferramentas baseadas em dispositivos fluidos em combinação com microscopia e contagem citométrica de fluxo para obter BTCs.

Combinando dispositivos fluidos com microscopia e citometria de fluxo para estudar transporte microbiano em mídia porosa em escalas espaciais

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

Estudar o transporte de bactérias em sistemas porosos é importante no que diz respeito à contaminação, disseminação de doenças e bioremediação. Para esses experimentos em modelos matemáticos que operam em uma única célula, a população e o nível da comunidade microbiana são necessários. Aqui apresentamos ferramentas para estudar o transporte bacteriano utilizando dispositivos microfluidos e microscopia, bem como dispositivos maiores em combinação com citometria de fluxo.A combinação de dispositivos microfluidos com microscopia e citometria de fluxo oferece uma gama de possibilidades para estudar fenômenos de transporte bacteriano em diferentes escalas espaciais. Para explorar plenamente este protocolo, sugere-se ter experiência prévia em microscopia, processamento básico de imagens, concepção de dispositivos microfluidos e citometria de fluxo. Este vídeo descreve dois métodos para estudar o transporte bacteriano em diferentes escalas espaciais.O primeiro método, baseado em dispositivos microfluidos, depende de microscopia para contar células individuais. Este sistema pode ser usado para estudar o transporte bacteriano em múltiplas escalas espaciais desde o poro até toda a escala do sistema poroso. O segundo método, utilizando dispositivos fluidos maiores acoplados a um dispensador automatizado e citometria de fluxo, pode ser usado para estudar fenômenos de transporte bacteriano na escala de sistemas porosos inteiros.Tais métodos também podem ser implantados em estudos de colunas em escala laboratorial, bem como em pequenos inquéritos de campo. Para começar, projete a geometria porosa desejada que consiste em uma matriz de círculos. Com base na geometria escolhida, prepare um molde usando fotolitografia SU-8 padrão.Prepare 50 gramas de PDMS adicionando 90% de elastômero a 10% do agente de cura a 90% de elastômero em peso em um recipiente descartável limpo e misture os dois reagentes com uma ferramenta limpa. Aplique um vácuo de 100 milibar por 30 minutos para remover ar e bolhas dissolvidos. Coloque o molde em uma placa de Petri e despeje o PDMS sobre o molde até a altura desejada entre dois e cinco milímetros.Cubra a placa de Petri com uma tampa e mantenha-a a 60 graus Celsius por pelo menos quatro horas. Depois disso, deixe o dispositivo microfluido esfriar à temperatura ambiente. Uma vez esfriado, remova cuidadosamente a porção desejada de PDMS com um bisturi.Veda temporariamente a parte inferior do canal PDMS com fita. Com um perfurador de 0,5 milímetros de diâmetro, perfure os canais para criar uma entrada e uma tomada. Remova a fita do canal PDMS e coloque o canal com o lado poroso voltado para cima.Trate o escorregador de vidro e as superfícies PDMS com plasma por cerca de 45 segundos cada um em temperatura ambiente. Coloque o canal PDMS pré-tratado no deslizamento de vidro pré-tratado e aqueça a 100 graus Celsius por 30 minutos em uma placa quente, depois remova o dispositivo microfluido da placa quente e esfrie-o à temperatura ambiente. Aplique o vácuo por 30 minutos para remover o ar do PDMS.Para produzir a base contendo o compartimento de poros, use micro fresagem de alta precisão para remover 0,5 milímetros da camada base pmma e moer uma ranhura do tamanho de 1,1 por 1,1 milímetros para um anel O de borracha. Faça dois orifícios roscados para uma entrada e saída na parte superior do dispositivo fluido e 12 orifícios para parafusos. Isso serve como a tampa do dispositivo fluido.Depois de limpar o dispositivo fluido, aparar a base e a tampa juntos usando os 12 orifícios roscados. Remova o microfluido do vácuo e coloque-o no estágio do microscópio. Use a bomba de seringa para saturar com tampão de motilidade.Usando microscopia brightfield ou contraste de fase, ajuste a ampliação para visualizar células bacterianas individuais e foque no centro do canal de observação. Mude as configurações do caminho da luz para microscopia de fluorescência. Ajuste o foco através de um deslocamento e o tempo de exposição da câmera para resolver células bacterianas individuais.Neste caso, 100 milissegundos. Em seguida, insira a tubulação de entrada em um tubo de dois mililitros contendo a suspensão bacteriana. Inverta a direção da bomba e comece a retirar a suspensão a uma taxa de fluxo de um microliter por minuto.Escaneie a seção transversal de todo o canal de observação, gravando uma imagem a cada minuto. Importe imagens para uma plataforma de software desejada. Regisso plano de fundo como a média das primeiras imagens quando nenhuma partícula foi registrada.Subtraia o fundo de cada imagem para remover o ruído da câmera e a aberração óptica. Corte as imagens para uma região de interesse. Identifique um valor limiar igual à intensidade do pixel da fluorescência celular de modo que valores maiores que o limiar incluem células bacterianas.Use o processamento de imagem para subtrair o valor limiar de cada imagem. Binarize a imagem resultante para que as células bacterianas tenham um valor de um, enquanto o fundo tem um valor de zero. Remova clusters de pixels com uma área menor do que o menor tamanho de célula bacteriana em pixels.Soma a imagem binarizada para obter o número total de pixels dos clusters restantes. Divida o número de pixels pelo tamanho médio de uma célula bacteriana em pixels para obter uma estimativa do número de células. Transforme as contagens em concentração em partículas por mililitro.Para identificar a concentração da suspensão bacteriana injetada, injete a suspensão bacteriana no canal de observação de um dispositivo microfluido limpo com uma seringa. Registre a imagem e calcule a concentração bacterianafluente como mostrado anteriormente. Visualize curvas inovadoras normalizando a concentração bacteriana de efluentes C com a concentração bacterianafluente influente C0 e plotando C sobre C0 versus tempo.Para analisar as velocidades locais e trajetórias de bactérias transportadas através da matriz porosa, mova o estágio do microscópio para uma região de interesse e ajuste o foco para o centro do dispositivo microfluido. Defina a configuração óptica como contraste de fase ou microscopia de fluorescência. Registo de tempo e tempo de exposição curto o suficiente para capturar deslocamento bacteriano.Neste caso, 50 milissegundos. Grave imagens ao longo de um tempo suficiente, por exemplo, três minutos. Para remover o ruído de cada imagem, subtraia o fundo, que é a média da soma de todas as imagens gravadas.Determine o módulo do gradiente numérico e normalize-o pelo seu valor máximo. Encontre e regisse coordenadas bacterianas e o tempo de aquisição de imagens em um arquivo de três colunas. Realizar análises de rastreamento de partículas para processar os dados registrados e calcular as trajetórias.Para obter perfis de depoimento, registos uma imagem composta de todo o canal poroso antes, que é o fundo, e após a injeção da suspensão bacteriana através do dispositivo microfluido. Remova o fundo das imagens gravadas após a injeção bacteriana. Calcule o perfil de deposição D como a soma do sinal de fluorescência bacteriana ao longo de seções transversais de comprimento x do canal poroso.Visualize o perfil de depoimento como o sinal de fluorescência local versus o comprimento do canal poroso. Para configurar o dispensador automatizado, coloque o dispensador robótico perto do dispositivo fluido. Conecte o dispensador robótico ao computador que executa o BCNC e identifique a porta com correta.Em BCNC, clique no botão home para retornar o dispensador robótico à posição de casa. Conecte a bomba peristáltica com a entrada usando tubos de 50 centímetros de comprimento, um milímetro de diâmetro interno, e o fluxo de saída com o dispensador automatizado usando o mesmo tubo. Bombear meio de cultivo através do dispositivo fluido.Observe a chegada do meio na tubulação de saída fixada ao dispensador robótico e coloque uma placa de 96 poços que coletará o fluxo de saída. Ao mesmo tempo, ative o dispensador robótico e injete a suspensão bacteriana através do dispositivo fluido PMMA a uma taxa de fluxo de 0,2 mililitros por minuto. Injete suspensão bacteriana equivalente a vários volumes de poros.Por exemplo, 30 vezes o volume do dispositivo fluido. Após a injeção, mude para meio de cultivo estéril até o final do experimento. Uma vez que uma placa de 96 poços seja concluída, cubra a placa e armazene a quatro graus Celsius até a análise da citometria de fluxo.Analise amostras com citometria de fluxo e visualize curvas inovadoras normalizando a concentração bacteriana de efluente C com a concentração bacterianafluente influente C0 e plotando C sobre C0 versus tempo. Neste estudo, utilizando-se tanto o motile quanto o pseudomonas putida KT2440, foram realizados experimentos sequenciais em dispositivos microfluidos PDMS com uma matriz aleatória de pilares. Curvas inovadoras normalizadas para a concentração de células injetadas, bem como trajetórias bacterianas na escala de poros são mostradas aqui.Também foram realizados experimentos com dispositivos fluidos de larga escala moídos a partir de PMMA. Motile e pseudomonas não motile putida KT2440 foram injetados em uma matriz porosa regularmente espaçada. Surpreendentemente, em um ambiente poroso desprovido de biofilme, motile e pseudomonas não motile putida KT2440 mostrou um comportamento de transporte notavelmente diferente baseado em curvas inovadoras.Em uma matriz porosa colonizada por 48 horas com uma complexa comunidade de biofilmes de fluxo, essas diferenças em curvas inovadoras entre motile e pseudomonas não motile putida KT2440 desapareceram. Usamos esse sistema para estudar o transporte bacteriano nos córregos, mas essas ferramentas podem ser prontamente ajustadas para estudar fenômenos de transporte bacteriano em outros sistemas projetados e ambientais. O transporte bacteriano através de meios porosos hidratados encapsula processos em múltiplas escalas espaciais.A metodologia aqui apresentada permite ligar o deslocamento local de bactérias na escala de poros ao transporte microscópico em todo o meio poroso.

Research

JoVE Journal

Environment

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Preparação e Teste de impedância baseado em Biochips fluídicas com células RTgill-W1 para avaliação rápida das amostras de água para a toxicidade

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Ambiente

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Extração e Análise de Microbial Phospholipid Fatty Acids em solos

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems (PEMS) for the Real-driving Emissions (RDE) Regulation in Europe

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems PEMS for the Real-driving Emissions RDE Regulation in Europe

Implementação de Emissões de sistemas portáteis de medição (PEMS) para o Regulamento de Emissões-condução Real (RDE) na Europa

Vehicles are tested in controlled and relatively narrow laboratory conditions to determine their official emission values and reference fuel consumption. ...

Using Pharmacological Manipulation and High-precision Radio Telemetry to Study the Spatial Cognition in Free-ranging Animals

Usando manipulação farmacológica e de alta precisão Radio Telemetry para estudar a cognição espacial em animais livres de variando

An animal&#39;s ability to perceive and learn about its environment plays a key role in many behavioral processes, including navigation, migration, ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

Dispersão de nanomateriais em meios aquosos: para otimização de protocolo

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Microfluidic Devices for Characterizing Pore-scale Event Processes in Porous Media for Oil Recovery Applications

Dispositivos microfluídicos para caracterizar processos de evento Pore-escala em meios porosos para aplicações de recuperação de óleo

Microfluidic devices are versatile tools for studying transport processes at a microscopic scale. A demand exists for microfluidic devices that are ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Caracterização de biofilmes aquáticos com citometria de fluxo

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Metal Corrosion and the Efficiency of Corrosion Inhibitors in Less Conductive Media

Corrosão do metal e a eficiência de inibidores de corrosão em meios menos condutivos

Material corrosion can be a limiting factor for different materials in many applications. Thus, it is necessary to better understand corrosion processes, ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Isolamento e análise de comunidades microbianas na rizosfera, solo e raízes em experiências de grama perene

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Characterizing Microbiome Dynamics ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œ Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Caracterizando Microbiome dinâmica – citometria de fluxo com base em fluxos de trabalho de culturas puras de comunidades naturais

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...