Name: combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales
Uploaded: 2020-11-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales at JoVE.com

Мы признаем помощь Антуана Видмера с установкой роботизированного дозатора и dispenser.py скрипта.

1. Условия бактериальной культуры
<ol><li>Работая под капотом ламинарного потока, используйте 100 л глицеролового запаса GFP-тегами Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 мл-1, хранится при -80 градусах по Цельсию) для прививки 5 мл среды Лурия-Бертани (LB). Инкубировать при 30 градусов по Цельсию при...

<ol>
	<li>Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+and+removal+of+pathogenic+bacteria+in+wastewater+percolating+through+porous+media:+a+review.">Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review.</a> Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).</li><li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues.">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li><li>Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processes+in+microbial+transport+in+the+natural+subsurface.">Processes in microbial transport in the natural subsurface.</a> Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).</li><li>Tufenkji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+microbial+transport+in+porous+media:+Traditional+approaches+and+recent+developments.">Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments.</a> Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).</li><li>Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+modelling+straining+of+Escherichia+coli+in+saturated+porous+media.">Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media.</a> Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).</li><li>Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+and+biogeochemistry+of+stream+biofilms.">The ecology and biogeochemistry of stream biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).</li><li>Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+biophysical+underpinnings+to+the+success+of+multispecies+biofilms+in+porous+environments.">Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments.</a> The ISME Journal. 1, (2019).</li><li>Carrel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+in+3D+porous+media:+Delineating+the+influence+of+the+pore+network+geometry,+flow+and+mass+transfer+on+biofilm+development.">Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development.</a> Water Research. 134, 280-291 (2018).</li><li>Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+hopping+and+trapping+in+porous+media.">Bacterial hopping and trapping in porous media.</a> Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).</li><li>Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trait-specific+dispersal+of+bacteria+in+heterogeneous+porous+environments:+from+pore+to+porous+medium+scale.">Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale.</a> Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).</li><li>Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+preferential+flow+paths+perpetuated+by+microbial+activity+in+the+soil+matrix?+A+review.">Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review.</a> Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).</li><li>Creppy, A., Cl&#233;ment, E., Douarche, C., D'Angelo, M. V., Auradou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+motility+on+the+transport+of+bacteria+populations+through+a+porous+medium.">Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium.</a> Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).</li><li>Camesano, T. A., Logan, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Fluid+Velocity+and+Cell+Concentration+on+the+Transport+of+Motile+and+Nonmotile+Bacteria+in+Porous+Media.">Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media.</a> Environmental Science &amp; Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).</li><li>Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+surface+characteristics+on+the+transport+of+multiple+Escherichia+coli+isolates+in+large+scale+columns+of+quartz+sand.">The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand.</a> Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).</li><li>Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+biofilm+on+bacterial+transport+and+deposition+in+porous+media.">Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media.</a> Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).</li><li>Long, T., Ford, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Transverse+Migration+of+Bacteria+by+Chemotaxis+in+a+Porous+T-Sensor.">Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor.</a> Environmental Science &amp; Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).</li><li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+Expanding+the+Frontiers+of+Microbial+Ecology.">Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology.</a> Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Digital+Video+Microscopy+for+Colloidal+Studies.">Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+determination+of+bacterial+abundance+in+lake+plankton+with+the+green+nucleic+acid+stain+SYTO+13.">Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13.</a> Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).</li></ol>

Здесь мы предлагаем два средства для изучения транспортировки микробов через пористые системы на одноклеточном и популяционные уровни. Хотя изучение транспортных явлений с использованием моделирования БТД дало ценную информацию о распространении патогенных микроорганизмов или заг...

Исследования, направленные на понимание транспортировки микробов через пористые средства массовой информации в основном былиобусловлены опасениями загрязнения 1,передачи болезни 2 и биовосстановления3. В этой связи бактерии в основном рассматриваются как частицы втранспортных моделях 4 и такие процессы, как фильтрация, напряжение, гравитационное оседают или ремобилизации из биопленки были определены в качестве драйверов удержания или транспортировкимикробов 5. Тем не менее, изучение транспортировки бактерий через пористые ландшафты может также информировать нас об экологических стратегиях, лежащих в основе их успеха в этих сложных средах. Тем не менее, это требует новых экспериментов и математических моделей, работающих на уровне одной клетки, популяции или микробного сообщества.
Природные пористые среды, такие как те, которые находятся в гипорхейской зоне ручьев и рек, плотно колонизированы различными сообществами биопленообразующихмикробов 6. Биопленки образуют структуры, которые изменяют поток и, таким образом, транспортировку и рассеивание бактерий в жидкойфазе 7,,8. Транспортировка бактерий в поровом масштабе зависит от ограниченной доступности пространства в пористой матрице, и рассеивание, связанное с подвижностью, может быть эффективным способом повышения физической подготовки отдельных людей за счет снижения конкуренции за ресурсы в менее густонаселенных районах. С другой стороны, подвижные бактерии могут также достигать более изолированных областей пористой матрицы и расширенное исследование таких районов может обеспечить экологические возможности для подвижнойпопуляции 10. В больших пространственных масштабах рост биопленки отвлекает пути потока, также ведущие к (частичному) засорему пор и, таким образом, к созданию еще более ченнелингов и неоднородныхусловий потока 11. Это имеет последствия для способности к поставкам и рассеиванию питательных веществ, частоте и расстоянию. Преференциальный поток, например, может генерировать так называемые "быстрые треки" и пестрые бактерии могут достигать еще более высоких скоростей, чем локальный поток вдоль этихтреков 12. Это эффективный способ увеличить разведку новых мест обитания.
Различные инструменты используются для изучения транспортировки пестрых и недвижимых бактерий (и частиц) в пористых средствах массовой информации. Численные модели имеют большие прогностический потенциал, важный для приложений, однако часто ограничены присущимипредположениям 4. Лабораторные эксперименты13,14 всочетании с прорывом кривой (BTC) моделирования предоставили важные идеи в важности бактериальных свойств поверхности клеток для прилипанияэффективности 15. Как правило, БТК (т.е. серия времени концентрации частиц в фиксированном месте) получаются с помощью постоянных выбросов скорости и измерения числа клеток при оттоке экспериментального устройства. В этом контексте БТК отражают динамику дисперсии бактерий в пористой матрице и могут быть расширены термином раковины, учитывая привязанность. Однако моделирование БТР само по себе не решает роли пространственной организации пористого субстрата или биопленки для транспортных процессов. Было доказано, что другие макроскопические наблюдаемые факторы, такие как дисперсия или профили осаждения, предоставляют важную информацию о пространственном распределении или сохраненных частицах или растущих сообществах. Микрофлюиды это технология, которая позволяет изучать транспорт в пористых средствахмассовой информации с помощью микроскопии исследования 9,12,16, и заисключением недавней работы 10, экспериментальные системы, как правило, ограничены одной шкале длины разрешения, то есть, поры масштаба или всей жидкости масштаба устройства.
Здесь мы представляем набор комбинированных методов для изучения транспортировки подвижных и немостоялых бактерий в пористых ландшафтах в различных масштабах. Мы сочетаем наблюдения за бактериальным транспортом в поровом масштабе с информацией в более широком масштабе с помощью анализа BTC. Микрофлюидные устройства, построенные из мягкой литографии с использованием полидиметилсилоксана (PDMS), биосовместимы, устойчивы к ряду химических веществ, позволяют воспроизводиться при низких затратах и обеспечивают отличную оптическую прозрачность, а также низкую аутофторесценцию, критически важную для микроскопических наблюдений. Микрофлюиды на основе PDMS ранее использовались для изучения транспортировки микробов в простыхканалах 17 или в более сложных геометриях12. Тем не менее, как правило, эксперименты микрофлюиды сосредоточиться на краткосрочных горизонтов и эпи-флуоресценции микроскопического наблюдения живых клеток, как правило, ограничивается генетически модифицированных штаммов (например, GFP-тегами штаммов). Здесь мы представляем инструменты для изучения бактериального транспорта с использованием микрофлюидных устройств на основе PDMS в сочетании с микроскопией и более крупными устройствами, изготовленными из поли (метил-метакрилата) (PMMA, также известного как плексиглас) в сочетании с цитометрией потока. PDMS и PMMA отличаются проницаемостью газа и поверхностными свойствами, тем самым предоставляя дополнительные возможности для изучения бактериального транспорта. В то время как микрофлюидное устройство обеспечивает более контролируемую среду, более крупное устройство позволяет проводить эксперименты в течение длительных периодов времени или с использованием естественных бактериальных сообществ. Микроскопия, подсчитываемая при высоком временном разрешении в выделенной области, используется для получения BTC в микрофлюидных устройствах на основе PDMS. Чтобы получить количество ячеев для моделирования BTC с устройства на основе PMMA, мы вводим самосконструируемый автоматизированный жидкий дозатор в сочетании с цитометрией потока. В этой установке, клетки проходят жидкостное устройство и последовательно распределяется в 96 пластин хорошо. Временное разрешение ограничено минимальным объемом, который можно точно распределить, и, таким образом, средней скоростью потока через жидкое устройство. Фиксация в скважинах предотвращает рост и облегчает окрашивание ДНК для нисходящего потока-цитометрического перечисления. Для предотвращения роста бактерий в ходе транспортных экспериментов мы используем минимальную среду (такую же подвижность буфера).
Поскольку протоколы по подготовке жидкостных устройств в различных масштабах легко доступны, мы лишь кратко вводим методы производства таких устройств и, скорее, сосредоточиваемся на экспериментальных процедурах записи БТК. Аналогичным образом существуют различные процедуры для цитометрического перечисления потока микробов, и пользователи требуют экспертных знаний для интерпретации результатов, полученных с помощью цитометрии потока. Мы сообщаем о новой использовании микрофлюидных устройств в сочетании с микроскопической визуализацией для записи БТК клеток с флуоресцентными тегами. В поровом масштабе локальные скорости и траектории получаются с помощью обработки изображений. Кроме того, мы демонстрируем использование жидкого устройства на основе PMMA в сочетании с потоко-цитометрическим подсчетом для наблюдения за бактериальной транспортировкой подвижных и недвижимых клеток в пористых средах, колонизированных биопленкой родного потока.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastomer Sylgard 184</td>
			<td>Dowsil</td>
			<td>101697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer NovoCyte</td>
			<td>Acea</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit</td>
			<td>makeblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axio Imager</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope AxioZoom v16</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 75 mm &#215; 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 3 peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma bonder Corona SB</td>
			<td>BlackHole Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump New Era NE 4000</td>
			<td>New Era</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF31SA universal milling machine</td>
			<td>Mikron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales

Понимание транспорта, рассеивания и осаждения микроорганизмов в пористых средствах массовой информации является сложной научной задачей, включающей такие разнообразные темы, как гидродинамика, экология и экологическая инженерия. Моделирование бактериального транспорта в пористых средах в различных пространственных масштабах имеет решающее значение для лучшего прогнозирования последствий бактериального транспорта, однако нынешние модели часто не могут масштабироваться от лабораторных к полевым условиям. Здесь мы представляем экспериментальные инструменты для изучения бактериального транспорта в пористых средствах массовой информации в двух пространственных масштабах. Цель этих инструментов состоит в том, чтобы получить макроскопические наблюдаемые (такие как прорыв кривых или осаждения профилей) бактерий, введенных в прозрачные пористые матрицы. В малых масштабах (10-1000 мкм) микрофлюидные устройства сочетаются с оптической видео-микроскопией и обработкой изображений для получения прорывных кривых и, в то же время, для отслеживания отдельных бактериальных клеток в порной шкале. В более широком масштабе цитометрия потока сочетается с самодельным роботизированным дозатором для получения прорывных кривых. Мы иллюстрируют полезность этих инструментов, чтобы лучше понять, как бактерии транспортируются в сложных пористых средствах массовой информации, таких как гипорхейная зона потоков. Поскольку эти инструменты обеспечивают одновременные измерения в масштабах, они прокладывают путь для моделей на основе механизмов, критически важных для перенаписьвания. Применение этих инструментов может не только способствовать разработке новых методов биовосстановления, но и пролить новый свет на экологические стратегии микроорганизмов колонизации пористых субстратов.

Чтобы проиллюстрировать функциональность представленного рабочего процесса, мы провели эксперименты с использованием генетически модифицированных Pseudomonas putida KT2440, грамма отрицательной подвижной бактерии, важной для биовосстановления и биотехнологии. Генетиче...

Watch this Scientific Journal Video about Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales at JoVE.com

Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

Прорыв кривых (BTCs) являются эффективными инструментами для изучения транспортировки бактерий в пористых средств массовой информации. Здесь мы представляем инструменты, основанные на жидкостных устройствах в сочетании с микроскопией и цитометрическим подсчетом потока для получения БТК.

Объединение жидкостных устройств с микроскопией и цитометрией потока для изучения микробного транспорта в пористых средствах массовой информации через пространственные весы

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

Изучение транспортировки бактерий в пористых системах имеет важное значение в отношении загрязнения, распространения болезней и биовосстановления. Для этих экспериментов в математических моделях, работающих на одной клетке, требуется популяция и уровень микробного сообщества. Здесь мы представляем инструменты для изучения бактериального транспорта с использованием микрофлюидных устройств и микроскопии, а также более крупные устройства в сочетании с цитометрией потока.Сочетание микрофлюидных устройств с микроскопией и цитометрией потока предлагает ряд возможностей для изучения бактериальных транспортных явлений в различных пространственных масштабах. Для полного изучения этого протокола предлагается иметь предыдущий опыт в области микроскопии, базовой обработки изображений, проектирования микрофлюидных устройств и освоения цитометрии потока. В этом видео описаны два метода изучения бактериального транспорта в различных пространственных масштабах.Первый метод, основанный на микрофлюидных устройствах, опирается на микроскопию для подсчета отдельных клеток. Эта система может быть использована для изучения бактериального транспорта в нескольких пространственных масштабах от пор до всей пористой системной шкалы. Второй метод, использующий более крупные жидкостные устройства в сочетании с автоматизированной цитометрией и цитометрией потока, может быть использован для изучения бактериального транспортного явления в масштабе целых пористых систем.Такие методы могут также использоваться в лабораторных исследованиях, а также в небольших полевых исследованиях. Для начала спроектировать нужную пористую геометрию, которая состоит из матрицы кругов. На основе выбранной геометрии подготовь форму с использованием стандартной фотолитографии СУ-8.Подготовка 50 граммов PDMS, добавив 90% еластомера до 10% от лечения агента до 90% еластомер по весу в чистом одноразовом контейнере и смешать два реагента с чистым инструментом. Нанесите вакуум 100 миллибар в течение 30 минут, чтобы удалить растворенный воздух и пузырьки. Поместите форму в чашку Петри и вылейте PDMS на форму на нужную высоту от двух до пяти миллиметров.Накройте чашку Петри крышкой и держите ее на уровне 60 градусов по Цельсию в течение по крайней мере четырех часов. После этого дайте микрофлюидное устройство остыть до комнатной температуры. После охлаждения осторожно удалите желаемую порцию PDMS скальпелем.Временно запечатать дно канала PDMS лентой. С перфоратором диаметром 0,5 миллиметра прокалывайте каналы для создания входов и розетки. Удалите ленту с канала PDMS и поместите канал с пористой стороной вверх.Лечить стеклянный слайд и PDMS поверхностей с плазмой около 45 секунд каждый при комнатной температуре. Поместите предварительно обработаемый канал PDMS на предварительно обработаемую стеклянную горку и нагрейте при температуре 100 градусов по Цельсию в течение 30 минут на горячей пластине, затем удалите микрофлюидное устройство из горячей пластины и охладьте его до комнатной температуры. Нанесите вакуум на 30 минут, чтобы удалить воздух из PDMS.Для производства основы, содержащей поры отсека, использовать высокоточные микро фрезерования, чтобы удалить 0,5 миллиметра от базового слоя PMMA и мельницы паз размером 1,1 на 1,1 миллиметра для резиновой O-кольцо. Просверлите два резьбовых отверстия для входного и выходного в верхнюю часть жидкого устройства и 12 отверстий для винтов. Это служит крышкой жидкостного устройства.После очистки жидкостного устройства, винт базы и крышки вместе с помощью 12 резьбовых отверстий. Удалите микрофлюид из вакуума и поместите его на стадии микроскопа. Используйте шприц-насос, чтобы насытить его разношерстным буфером.Используя микроскопию Брайтфилда или фазовую контрастность, отрегулируйте увеличение, чтобы визуализировать отдельные бактериальные клетки и сосредоточьтесь на центре канала наблюдения. Переключите настройки пути света на микроскопию флуоресценции. Отрегулируйте фокус через смещение и время экспозиции камеры, чтобы решить отдельные бактериальные клетки.В этом случае 100 миллисекунд. Затем вставьте входную трубку в двухмилитровую трубку, содержащую бактериальную суспензию. Переверните направление насоса и начните снимать подвеску со скоростью потока одного микролицера в минуту.Сканирование поперечного сечения всего канала наблюдения, запись изображения каждую минуту. Импорт изображений на нужную программную платформу. Зафиксуй фон как среднее значение первых изображений, когда частицы не были записаны.Вычесть фон из каждого изображения, чтобы удалить шум камеры и оптической аберрации. Обрезать изображения в регионе, представляющих интерес. Определите пороговое значение, равное интенсивности пикселей флуоресценции клеток, так что значения, большие, чем порог включают бактериальные клетки.Используйте обработку изображений, чтобы вычесть пороговое значение из каждой картинки. Binarize в результате изображения так, что бактериальные клетки принимают значение одного, в то время как фон занимает значение нуля. Удалите кластеры пикселей с площадью меньше, чем самый маленький размер бактериальных клеток в пикселях.Сумма binarized изображение, чтобы получить общее количество пикселей остальных кластеров. Разделите количество пикселей на средний размер бактериальной клетки на пиксели, чтобы получить оценку количества клеток. Превратите количество в концентрацию частиц на миллилитр.Чтобы определить концентрацию инъекционной бактериальной суспензии, ввисьте бактериальную суспензию в канал наблюдения чистого микрофлюидного устройства со шприцем. Завехать изображение и рассчитать висячей бактериальной концентрации, как показано ранее. Визуализация прорыв кривых путем нормализации сточных вод бактериальной концентрации C с influent бактериальной концентрации C0 и построения C более C0 по сравнению со временем.Для анализа локальных скоростей и траекторий бактерий, транспортируемых через пористую матрицу, переместите стадию микроскопа в область интереса и отрегулируйте фокус к центру микрофлюидного устройства. Установите оптическую конфигурацию для фазового контраста или микроскопии флуоресценции. Рекордные изображения замедленного действия и время экспозиции достаточно короткое, чтобы захватить бактериальное смещение.В этом случае 50 миллисекунд. Запись фотографий в течение достаточного количества времени, например, три минуты. Чтобы удалить шум с каждого изображения, вычесть фон, который является средним от суммы всех записанных изображений.Определите модуль численного градиента и нормализуете его по максимальному значению. Найти и записать бактериальные координаты и время получения изображения в файл с тремя столбцами. Выполните анализ отслеживания частиц для обработки записанных данных и вычисления траекторий.Для получения профилей осаждения замыкаем композитное изображение всего пористого канала раньше, то есть фоном, и после инъекции бактериальной суспензии через микрофлюидное устройство. Удалите фон из изображений, записанных после бактериальной инъекции. Вычислить профиль осаждения D как сумму бактериального сигнала флуоресценции по поперечным участкам длины x пористого канала.Визуализууй профиль осаждения в качестве локального сигнала флуоресценции по сравнению с длиной пористого канала. Чтобы настроить автоматизированный дозатор, поместите роботизированный дозатор рядом с жидкостным устройством. Подключите роботизированный дозатор к компьютеру под управлением BCNC и определите правильный порт com.В BCNC нажмите кнопку «Домой», чтобы вернуть роботизированный дозатор в домашнее положение. Соедините перистальтический насос с водой, используя 50 сантиметров в длину, один миллиметр внутреннего диаметра труб, и отток с автоматизированным дозатором с помощью той же трубки. Насос культивирования среды через жидкое устройство.Обратите внимание на прибытие среды в розетке трубки крепится к роботизированной дозатор и место 96-хорошо пластины, которая будет собирать оттока. В то же время активируйте роботизированный дозатор и вводите бактериальную суспензию через жидкое устройство PMMA со скоростью потока 0,2 миллилитров в минуту. Инъекционная бактериальная суспензия, эквивалентная нескольким объемам пор.Например, в 30 раз больше объема жидкостного устройства. После инъекции переключитесь на стерильную среду культивирования до конца эксперимента. После того, как 96-хорошо пластины завершена, покрыть пластину и хранить при четырех градусах по Цельсию до потока цитометрии анализа.Анализируйте образцы с цитометрией потока и визуализируете прорывные кривые, нормализуя бактериальную концентрацию стоков C с висячей бактериальной концентрацией C0 и планируя C более C0 по сравнению со временем. В этом исследовании, используя как подвижные, так и немольные Pseudomonas putida KT2440, последовательные эксперименты проводились в микрофлюидных устройствах PDMS со случайным набором столбов. Здесь показаны прорывные кривые, нормализуемые к концентрации инъекционных клеток, а также бактериальные траектории в шкале пор.Были также проведены эксперименты с крупномасштабными жидкостными устройствами, измельченными из PMMA. В регулярно размеченную пористую матрицу вводили motile и non-motile Pseudomonas putida KT2440. Поразительно, но в пористой среде, лишенной биопленки, пестрый и не подвижной Pseudomonas putida KT2440 показал заметно иное транспортное поведение, основанное на прорывных кривых.В пористой матрице, колонизированной в течение 48 часов со сложным сообществом биопленки потока, эти различия в кривых прорыва между подвижными и немостойными Pseudomonas putida KT2440 исчезли. Мы используем эту систему для изучения бактериального транспорта в потоках, но эти инструменты могут быть легко скорректированы для изучения бактериальных транспортных явлений в других инженерных и экологических систем. Бактериальный транспорт через гидратированные пористые средства массовой информации инкапсулируют процессы в нескольких пространственных масштабах.Представленная здесь методология позволяет связать локальное перемещение бактерий в поровой шкале с микроскопическим транспортом на всей пористой среде.

Research

JoVE Journal

Environment

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Получение и испытание импеданса на основе струйного биочипов с RTgill-W1 Клетки для быстрой оценки питьевой воды проб на токсичность

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Добыча и анализ микробных фосфолипидов жирных кислот в почвах

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems (PEMS) for the Real-driving Emissions (RDE) Regulation in Europe

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems PEMS for the Real-driving Emissions RDE Regulation in Europe

Внедрение портативных систем измерения выбросов (ПЕМС) для реального вождения выбросов (ПСИ) регулирование в Европе

Vehicles are tested in controlled and relatively narrow laboratory conditions to determine their official emission values and reference fuel consumption. ...

Using Pharmacological Manipulation and High-precision Radio Telemetry to Study the Spatial Cognition in Free-ranging Animals

Использование Фармакологический манипуляция и высокоточный Радиотелеметрия для изучения пространственного познания в свободном выгуле животных

An animal&#39;s ability to perceive and learn about its environment plays a key role in many behavioral processes, including navigation, migration, ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

Дисперсия наноматериалов в средах: на пути к оптимизации протокола

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Microfluidic Devices for Characterizing Pore-scale Event Processes in Porous Media for Oil Recovery Applications

Microfluidic приборы для характеризующие поры масштаба событий процессов в пористых средах для восстановления приложений нефти

Microfluidic devices are versatile tools for studying transport processes at a microscopic scale. A demand exists for microfluidic devices that are ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Характеристика водных биоплёнки с проточной цитометрии

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Metal Corrosion and the Efficiency of Corrosion Inhibitors in Less Conductive Media

Коррозия металла и эффективность ингибиторов коррозии в менее проводящих СМИ

Material corrosion can be a limiting factor for different materials in many applications. Thus, it is necessary to better understand corrosion processes, ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Изоляция и анализ микробных сообществ в почве, ризосфере и корни в экспериментах многолетние травы

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Characterizing Microbiome Dynamics ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œ Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Характеризующих микрофлора динамика – проточной цитометрии на основе рабочих процессов из чистых культур для природных сообществ

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...