Name: combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales
Uploaded: 2020-11-25T14:00:00
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Reconocemos la ayuda de Antoine Wiedmer con la configuración del dispensador robótico y el guión dispenser.py.

1. Condiciones de cultivo bacteriano
<ol><li>Trabajando bajo una campana de flujo laminar, utilice 100 l de una población de glicerol de Pseudomonas putida KT2440 con etiquetas GFP (1 ×10 7 mL-1,almacenada a -80 oC) para inocular 5 ml de luria-Bertani (LB) medio. Incubar a 30oC mientras se agita a 250 rpm durante la noche.</li>
	<li>Al día siguiente, resuspender 100 l del cultivo nocturno en 5 ml de LB medio e incubar en las mismas condiciones durante 5h (fase exponencial). Muestre una...

<ol>
	<li>Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+and+removal+of+pathogenic+bacteria+in+wastewater+percolating+through+porous+media:+a+review.">Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review.</a> Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).</li><li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues.">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li><li>Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. 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H., Schijven, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+modelling+straining+of+Escherichia+coli+in+saturated+porous+media.">Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media.</a> Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).</li><li>Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+and+biogeochemistry+of+stream+biofilms.">The ecology and biogeochemistry of stream biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).</li><li>Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+hopping+and+trapping+in+porous+media.">Bacterial hopping and trapping in porous media.</a> Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).</li><li>Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trait-specific+dispersal+of+bacteria+in+heterogeneous+porous+environments:+from+pore+to+porous+medium+scale.">Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale.</a> Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).</li><li>Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+preferential+flow+paths+perpetuated+by+microbial+activity+in+the+soil+matrix?+A+review.">Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review.</a> Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).</li><li>Creppy, A., Cl&#233;ment, E., Douarche, C., D'Angelo, M. V., Auradou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+motility+on+the+transport+of+bacteria+populations+through+a+porous+medium.">Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium.</a> Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).</li><li>Camesano, T. A., Logan, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Fluid+Velocity+and+Cell+Concentration+on+the+Transport+of+Motile+and+Nonmotile+Bacteria+in+Porous+Media.">Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media.</a> Environmental Science &amp; Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).</li><li>Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+surface+characteristics+on+the+transport+of+multiple+Escherichia+coli+isolates+in+large+scale+columns+of+quartz+sand.">The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand.</a> Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).</li><li>Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+biofilm+on+bacterial+transport+and+deposition+in+porous+media.">Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media.</a> Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).</li><li>Long, T., Ford, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Transverse+Migration+of+Bacteria+by+Chemotaxis+in+a+Porous+T-Sensor.">Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor.</a> Environmental Science &amp; Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).</li><li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+Expanding+the+Frontiers+of+Microbial+Ecology.">Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology.</a> Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Digital+Video+Microscopy+for+Colloidal+Studies.">Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+determination+of+bacterial+abundance+in+lake+plankton+with+the+green+nucleic+acid+stain+SYTO+13.">Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13.</a> Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).</li></ol>

Aquí sugerimos dos medios para estudiar el transporte de microbios a través de sistemas porosos a nivel de una sola célula y población. Si bien el estudio de los fenómenos de transporte utilizando el modelado BTC ha proporcionado información valiosa sobre la propagación de patógenos o contaminantes a escalas de ecosistemas, todavía existen dificultades para escalar de experimentos de laboratorio a condiciones de campo. Las herramientas descritas aquí permiten a los investigadores resolver experimentalmente las ...

Los estudios enca de comprender el transporte de microbios a través de medios porosos han sido impulsados principalmente por preocupaciones de contaminación1, la transmisión de la enfermedad2 y la biorremediación3. En este sentido, las bacterias han sido tratadas principalmente como partículas en los modelos de transporte4 y se han identificado procesos como filtración, tensión, sedimentación gravitacional o removilización de biopelículas como conductores de retención o transporte de microbios5. Sin embargo, el estudio del transporte de bacterias a través de paisajes porosos también puede informarnos sobre las estrategias ecológicas que sustentan su éxito en estos entornos complejos. Sin embargo, esto requiere nuevos experimentos y modelos matemáticos que operan a nivel de una sola célula, población o comunidad microbiana.
Los ambientes porosos naturales, como los que se encuentran en la zona hiporreica de arroyos y ríos, son densamente colonizados por diversas comunidades de microbios formadores de biopelículas6. Las biopelículas forman estructuras que modifican el caudal y, por tanto, el transporte y dispersión de bacterias en la fase líquida7,,8. El transporte de bacterias a escala de poros depende de la disponibilidad de espacio restringido en la matriz porosa y la dispersión relacionada con la motilidad puede ser una manera eficaz de aumentar la aptitud individual a través de una menor competencia por recursos en áreas menos densamente pobladas. Por otro lado, las bacterias móviles también pueden llegar a regiones más aisladas de la matriz porosa y la exploración prolongada de estas áreas puede proporcionar oportunidades ecológicas a las poblaciones móviles10. A escalas espaciales más grandes, el crecimiento de la biopelícula desvía las trayectorias de flujo que también conducen a la obstrucción (parcial) de los poros y, por lo tanto, al establecimiento de condiciones de flujo aún más canalizadas y heterogéneas11. Esto tiene consecuencias para el suministro de nutrientes y la capacidad de dispersión, frecuencia y distancia. El flujo preferencial, por ejemplo, puede generar las llamadas "vías rápidas" y las bacterias móviles pueden alcanzar velocidades aún mayores que el flujo local a lo largo de estas pistas12. Esta es una manera eficaz de aumentar la exploración de nuevos hábitats.
Una variedad de herramientas sirven para el estudio del transporte de bacterias (y partículas) móviles y no móviles en medios porosos. Los modelos numéricos tienen grandes capacidades predictivas importantes para las aplicaciones, sin embargo, a menudo están limitados por supuestos inherentes4. Experimentos a escala de laboratorio13,14 combinados con el modelado de curvas de avance (BTC) han proporcionado información importante sobre la importancia de las propiedades de la superficie celular bacteriana para la eficiencia de pegado15. Típicamente, los BTC (es decir, las series de tiempos de concentración de partículas en un lugar fijo) se obtienen mediante liberaciones de velocidad constante y la medición de números de celda en la salida del dispositivo experimental. En este contexto, los BTC reflejan la dinámica de advección-dispersión de bacterias en la matriz porosa y pueden extenderse por un término de sumidero que tenga en cuenta la unión. Sin embargo, el modelado de BTC por sí solo no resuelve el papel de la organización espacial del sustrato poroso o biopelícula para los procesos de transporte. Se ha demostrado que otros observables macroscópicos como la dispersión o los perfiles de deposición proporcionan información importante sobre la distribución espacial o las partículas retenidas o las comunidades en crecimiento. Microfluidics es una tecnología que permite estudiar el transporte en medios porosos mediante la investigación de microscopía9,12,16, y excepto un trabajo reciente10, los sistemas experimentales suelen estar restringidos a una escala de sola longitud de resolución, es decir, la escala de poros o toda la escala de dispositivos fluidos.
Aquí, presentamos un conjunto de métodos combinados para estudiar el transporte de bacterias móviles y no móviles en paisajes porosos a diferentes escalas. Combinamos observaciones de transporte bacteriano a escala de poros con información a mayor escala, mediante análisis BTC. Los dispositivos microfluídicos construidos a partir de litografía blanda con polidimetilsiloxano (PDMS) son biocompetibles, resistentes a una gama de productos químicos, permiten replicabilidad a bajo costo y proporcionan una excelente transparencia óptica, así como baja autofluorescencia crítica para la observación microscópica. Los microfluídicos basados en PDMS se han utilizado previamente para estudiar el transporte de microbios en canales simples17 o en geometrías más complejas12. Sin embargo, los experimentos típicamente microfluídicos se centran en horizontes a corto plazo y la observación microscópica de epifluorescencia de células vivas se limita comúnmente a cepas modificadas genéticamente (por ejemplo, cepas etiquetadas por GFP). Aquí presentamos herramientas para estudiar el transporte bacteriano utilizando dispositivos microfluídicos basados en PDMS en combinación con microscopía y dispositivos más grandes fabricados a partir de poli(metil metacrilato) (PMMA, también conocido como plexiglás) en combinación con la citometría de flujo. PDMS y PMMA difieren en la permeabilidad al gas y las propiedades superficiales, proporcionando así oportunidades complementarias para estudiar el transporte bacteriano. Mientras que el dispositivo microfluídico proporciona un ambiente más controlado, el dispositivo más grande permite experimentos durante largos períodos de tiempo o el uso de comunidades bacterianas naturales. El recuento de microscopía a alta resolución temporal en un área dedicada se utiliza para obtener BTC en el dispositivo microfluídico basado en PDMS. Para obtener recuentos de células para el modelado BTC a partir del dispositivo basado en PMMA, introducimos un dispensador de líquido automatizado autoconstruido en combinación con la citometría de flujo. En esta configuración, las células pasan el dispositivo fluido y se dispensan consecutivamente en 96 placas de pozo. La resolución temporal está restringida por el volumen mínimo que se puede dispensar con precisión y, por lo tanto, el caudal medio a través del dispositivo fluido. El fijador en los pozos previene el crecimiento y facilita la tinción del ADN para la enumeración citométrica de flujo aguas abajo. Para prevenir el crecimiento bacteriano durante los experimentos de transporte utilizamos un medio mínimo (tampón de motilidad a) a) según el término.
Dado que los protocolos para la preparación de dispositivos fluidos a diferentes escalas están fácilmente disponibles, sólo introducimos brevemente las técnicas para producir tales dispositivos y más bien nos centramos en los procedimientos experimentales para grabar LOS BTC. Del mismo modo, existen varias rutinas para la enumeración citométrica de flujo de microbios y los usuarios requieren conocimientos expertos para interpretar los resultados obtenidos por citometría de flujo. Informamos del nuevo uso de dispositivos microfluídicos en combinación con imágenes microscópicas para registrar los BTC de células con etiquetas fluorescentes. A escala de poros, las velocidades y trayectorias locales se obtienen mediante el procesamiento de imágenes. Además, demostramos el uso de un dispositivo fluido basado en PMMA en combinación con el recuento citométrico de flujo para observar el transporte bacteriano de células móviles y no móviles en ambientes porosos colonizados por una biopelícula de flujo nativo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastomer Sylgard 184</td>
			<td>Dowsil</td>
			<td>101697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer NovoCyte</td>
			<td>Acea</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit</td>
			<td>makeblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axio Imager</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope AxioZoom v16</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 75 mm &#215; 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 3 peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma bonder Corona SB</td>
			<td>BlackHole Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump New Era NE 4000</td>
			<td>New Era</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF31SA universal milling machine</td>
			<td>Mikron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales

Comprender el transporte, dispersión y deposición de microorganismos en medios porosos es una tarea científica compleja que comprende temas tan diversos como la hidrodinámica, la ecología y la ingeniería ambiental. Modelar el transporte bacteriano en entornos porosos a diferentes escalas espaciales es fundamental para predecir mejor las consecuencias del transporte bacteriano, pero los modelos actuales a menudo no logran escalar de laboratorio a condiciones de campo. Aquí, introducimos herramientas experimentales para estudiar el transporte bacteriano en medios porosos a dos escalas espaciales. El objetivo de estas herramientas es obtener observables macroscópicos (como curvas de ruptura o perfiles de deposición) de bacterias inyectadas en matrices porosas transparentes. A pequeña escala (10-1000 m), los dispositivos microfluídicos se combinan con video-microscopía óptica y procesamiento de imágenes para obtener curvas de ruptura y, al mismo tiempo, para rastrear células bacterianas individuales a escala de poros. A mayor escala, la citometría de flujo se combina con un dispensador robótico hecho a sí mismo para obtener curvas de ruptura. Ilustramos la utilidad de estas herramientas para entender mejor cómo se transportan las bacterias en medios porosos complejos como la zona hiporheica de los arroyos. Como estas herramientas proporcionan mediciones simultáneas a través de escalas, allanan el camino para modelos basados en mecanismos, de vital importancia para la ampliación. La aplicación de estas herramientas puede no sólo contribuir al desarrollo de nuevas aplicaciones de biorremediación, sino que también arrojar nueva luz sobre las estrategias ecológicas de los microorganismos colonizando sustratos porosos.

Para ilustrar la funcionalidad del flujo de trabajo presentado, realizamos experimentos utilizando Pseudomonas putida KT2440 modificada genéticamente, una bacteria móvil gram negativa importante para la biorremediación y la biotecnología. Las versiones modificadas genéticamente de esta cepa que expresan la producción de GFP están disponibles comercialmente. También está disponible una cepa no móvil de P. putida KT2440 que carece de los genes estructurales y reg...

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Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

Las curvas innovadoras (BTC) son herramientas eficientes para estudiar el transporte de bacterias en medios porosos. Aquí introducimos herramientas basadas en dispositivos fluidos en combinación con microscopía y conteo citométrico de flujo para obtener BTC.

Combinación de dispositivos fluidos con microscopía y citometría de flujo para estudiar el transporte microbiano en medios porosos a través de escalas espaciales

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

El estudio del transporte de bacterias en sistemas porosos es importante en lo que respecta a la contaminación, la propagación de enfermedades y la biorremediación. Para estos experimentos en modelos matemáticos que operan en la célula única, se requiere la población y el nivel de la comunidad microbiana. Aquí presentamos herramientas para estudiar el transporte bacteriano utilizando dispositivos microfluídicos y microscopía, así como dispositivos más grandes en combinación con la citometría de flujo.La combinación de dispositivos microfluídicos con microscopía y citometría de flujo ofrece una gama de posibilidades para estudiar fenómenos de transporte bacteriano a diferentes escalas espaciales. Con el fin de explorar completamente este protocolo, se sugiere tener experiencia previa en microscopía, procesamiento básico de imágenes, diseño de dispositivos microfluídicos y masterización de la citometría de flujo. Este video describe dos métodos para estudiar el transporte bacteriano a diferentes escalas espaciales.El primer método, basado en dispositivos microfluídicos, se basa en la microscopía para contar células individuales. Este sistema se puede utilizar para estudiar el transporte bacteriano a través de múltiples escalas espaciales desde el poro hasta toda la escala del sistema poroso. El segundo método, utilizando dispositivos fluidos más grandes acoplados a un dispensador automatizado y citometría de flujo, se puede utilizar para estudiar el fenómeno del transporte bacteriano a escala de sistemas porosos enteros.Estos métodos también se pueden implementar en estudios de columnas a escala de laboratorio, así como pequeñas encuestas de campo. Para empezar, diseñe la geometría porosa deseada que consta de una matriz de círculos. En función de la geometría elegida, prepare un molde utilizando una fotolitografía SU-8 estándar.Preparar 50 gramos de PDMS añadiendo el 90% de elastómero al 10% del agente de curado al 90% del elastómero en peso en un recipiente desechable limpio y mezclar los dos reactivos con una herramienta limpia. Aplicar un vacío de 100 milibar durante 30 minutos para eliminar el aire disuelto y las burbujas. Coloque el molde en una placa De Petri y vierta el PDMS sobre el molde a la altura deseada entre dos y cinco milímetros.Cubra el plato de Petri con una tapa y manténgalo a 60 grados centígrados durante al menos cuatro horas. Después de eso, deje que el dispositivo microfluídico se enfríe a temperatura ambiente. Una vez enfriado, retire cuidadosamente la porción deseada de PDMS con un bisturí.Selle temporalmente la parte inferior del canal PDMS con cinta. Con un perforador de 0,5 milímetros de diámetro, perfora los canales para crear una entrada y una salida. Retire la cinta del canal PDMS y coloque el canal con el lado poroso hacia arriba.Trate el portaobjetos de vidrio y las superficies PDMS con plasma durante unos 45 segundos cada una a temperatura ambiente. Coloque el canal PDMS pretratado en el portaobjetos de vidrio pretratado y caliente a 100 grados centígrados durante 30 minutos en una placa caliente, luego retire el dispositivo microfluídico de la placa caliente y enfríe hasta la temperatura ambiente. Aplique vacío durante 30 minutos para eliminar el aire de PDMS.Para producir la base que contiene el compartimiento de poros, utilice micro fresado de alta precisión para eliminar 0,5 milímetros de la capa PMMA base y fresar una ranura del tamaño de 1,1 por 1,1 milímetros para una junta tórica de goma. Taladre dos orificios roscados para una entrada y salida en la parte superior del dispositivo fluido y 12 orificios para tornillos. Esto sirve como tapa del dispositivo fluido.Después de limpiar el dispositivo fluido, atornille la base y la tapa con los 12 orificios roscados. Retire el microfluídico del vacío y colóquelo en la etapa del microscopio. Utilice la bomba de jeringa para saturarla con tampón de motilidad.Con la microscopía Brightfield o el contraste de fase, ajuste el aumento para visualizar las células bacterianas individuales y concéntrese en el centro del canal de observación. Cambie los ajustes de la trayectoria de la luz a la microscopía de fluorescencia. Ajuste el enfoque a través de un desplazamiento y el tiempo de exposición de la cámara para resolver las células bacterianas individuales.En este caso, 100 milisegundos. A continuación, inserte el tubo de entrada en un tubo de dos mililitros que contenga la suspensión bacteriana. Invierta la dirección de la bomba y comience a retirar la suspensión a un caudal de un microlitro por minuto.Escanee la sección transversal de todo el canal de observación, grabando una imagen cada minuto. Importe imágenes a una plataforma de software deseada. Grabe el fondo como el promedio de las primeras imágenes cuando no se hayan grabado partículas.Restar el fondo de cada imagen para eliminar el ruido de la cámara y la aberración óptica. Recorte las imágenes a una región de interés. Identifique un valor de umbral igual a la intensidad de píxeles de fluorescencia de celda para que los valores superiores al umbral incluyan celdas bacterianas.Utilice el procesamiento de imágenes para restar el valor de umbral de cada imagen. Binarize la imagen resultante para que las células bacterianas tomen un valor de uno, mientras que el fondo toma un valor de cero. Elimine los grupos de píxeles con un área más pequeña que el tamaño de celda bacteriana más pequeño en píxeles.Sume la imagen binarizada para obtener el número total de píxeles de los clústeres restantes. Divida el número de píxeles por el tamaño medio de una célula bacteriana en píxeles para obtener una estimación del número de celdas. Transforme los recuentos en concentración en partículas por mililitro.Para identificar la concentración de la suspensión bacteriana inyectada, inyecte la suspensión bacteriana en el canal de observación de un dispositivo microfluídico limpio con una jeringa. Registre la imagen y calcule la concentración bacteriana influente como se muestra anteriormente. Visualice las curvas de ruptura normalizando la concentración bacteriana de efluentes C con la concentración bacteriana influente C0 y trazando C sobre C0 frente a tiempo.Para analizar las velocidades y trayectorias locales de las bacterias transportadas a través de la matriz porosa, mueva la etapa del microscopio a una región de interés y ajuste el enfoque al centro del dispositivo microfluídico. Ajuste la configuración óptica a la microscopía de contraste de fase o fluorescencia. Grabe imágenes de lapso de tiempo y un tiempo de exposición lo suficientemente corto como para capturar el desplazamiento bacteriano.En este caso, 50 milisegundos. Grabe imágenes durante un período de tiempo suficiente, por ejemplo tres minutos. Para eliminar el ruido de cada imagen, reste el fondo, que es el promedio de la suma de todas las imágenes grabadas.Determine el módulo del degradado numérico y normalícese por su valor máximo. Busque y registre las coordenadas bacterianas y la hora de adquisición de la imagen en un archivo de tres columnas. Realice análisis de seguimiento de partículas para procesar los datos registrados y calcular las trayectorias.Para obtener perfiles de deposición, registre una imagen compuesta de todo el canal poroso antes, que es el fondo, y después de la inyección de la suspensión bacteriana a través del dispositivo microfluídico. Retire el fondo de las imágenes grabadas después de la inyección bacteriana. Calcular el perfil de deposición D como la suma de la señal de fluorescencia bacteriana a lo largo de secciones transversales de longitud x del canal poroso.Visualice el perfil de deposición como la señal de fluorescencia local frente a la longitud del canal poroso. Para configurar el dispensador automatizado, coloque el dispensador robótico cerca del dispositivo fluido. Conecte el dispensador robótico al ordenador que ejecuta BCNC e identifique el puerto com correcto.En BCNC, haga clic en el botón de inicio para devolver el dispensador robótico a la posición inicial. Conecte la bomba peristáltica con la entrada utilizando tubos de 50 centímetros de largo, un milímetro de diámetro interior y la salida con el dispensador automatizado utilizando el mismo tubo. Bomba de medio de cultivo a través del dispositivo fluido.Tenga en cuenta la llegada del medio en el tubo de salida fijado al dispensador robótico y coloque una placa de 96 pozos que recogerá la salida. Al mismo tiempo, active el dispensador robótico e inyecte la suspensión bacteriana a través del dispositivo fluido PMMA a un caudal de 0,2 mililitros por minuto. Inyectar suspensión bacteriana equivalente a varios volúmenes de poros.Por ejemplo, 30 veces el volumen del dispositivo fluido. Después de la inyección, cambie al medio de cultivo estéril hasta el final del experimento. Una vez que se haya completado una placa de 96 pozos, cubra la placa y guárdela a cuatro grados Celsius hasta el análisis de citometría de flujo.Analice muestras con citometría de flujo y visualice curvas de ruptura normalizando la concentración bacteriana de efluentes C con la concentración bacteriana influente C0 y trazando C sobre C0 frente al tiempo. En este estudio, utilizando Pseudomonas putida KT2440, tanto móviles como no móviles, se realizaron experimentos secuenciales en dispositivos microfluídicos PDMS con una matriz aleatoria de pilares. Aquí se muestran curvas de ruptura normalizadas a la concentración de células inyectadas, así como trayectorias bacterianas en la escala de poros.También se realizaron experimentos con dispositivos fluidos a gran escala fresados a partir de PMMA. Se inyectaron Pseudomonas putida KT2440 móviles y no móviles en una matriz porosa espaciada regularmente. Sorprendentemente, en un ambiente poroso carente de biopelícula, Pseudomonas putida KT2440 móvil y no móvil mostró un comportamiento de transporte marcadamente diferente basado en curvas revolucionarias.En una matriz porosa colonizada durante 48 horas con una compleja comunidad de biopelículas de flujo, estas diferencias en las curvas de ruptura entre las pseudomonas putida KT2440 móviles y no móviles desaparecieron. Utilizamos este sistema para estudiar el transporte bacteriano en las corrientes, pero estas herramientas se pueden ajustar fácilmente para estudiar fenómenos de transporte bacteriano en otros sistemas de ingeniería y ambientales. El transporte bacteriano a través de medios porosos hidratados encapsula los procesos a través de múltiples escalas espaciales.La metodología aquí presentada permite vincular el desplazamiento local de bacterias a escala de poros con el transporte microscópico en todo el medio poroso.

Research

JoVE Journal

Environment

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Preparación y ensayo de impedancia basada en biochips fluido con células RTgill-W1 para evaluación rápida de muestras de agua potable para la toxicidad

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Investigación

Medio ambiente

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Extracción y análisis de ácidos grasos de fosfolípidos microbiana en suelos

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems (PEMS) for the Real-driving Emissions (RDE) Regulation in Europe

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems PEMS for the Real-driving Emissions RDE Regulation in Europe

Implementación de sistemas portátiles de medición de emisiones (PEMS) para el Reglamento de Emisiones real de conducción (RDE) en Europa

Vehicles are tested in controlled and relatively narrow laboratory conditions to determine their official emission values and reference fuel consumption. ...

Using Pharmacological Manipulation and High-precision Radio Telemetry to Study the Spatial Cognition in Free-ranging Animals

El uso de la manipulación farmacológica y de alta precisión de radio telemetría para estudiar la cognición espacial en animales criados en libertad

An animal&#39;s ability to perceive and learn about its environment plays a key role in many behavioral processes, including navigation, migration, ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

Dispersión de los nanomateriales en medios acuosos: hacia la optimización del Protocolo

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Microfluidic Devices for Characterizing Pore-scale Event Processes in Porous Media for Oil Recovery Applications

Dispositivos de microfluidos para la caracterización de procesos de poro-escala acontecimiento en medios porosos para aplicaciones de recuperación de aceite

Microfluidic devices are versatile tools for studying transport processes at a microscopic scale. A demand exists for microfluidic devices that are ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Caracterización de biopelículas acuáticas con citometría de flujo

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Metal Corrosion and the Efficiency of Corrosion Inhibitors in Less Conductive Media

Corrosión de metales y la eficacia de los inhibidores de la corrosión en medios menos conductivos

Material corrosion can be a limiting factor for different materials in many applications. Thus, it is necessary to better understand corrosion processes, ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Aislamiento y análisis de comunidades microbianas en el suelo, rizosfera y raíces en los experimentos de pastos perennes

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Characterizing Microbiome Dynamics ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œ Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Caracterización dinámica de microbioma-citometría de flujo basado en flujos de trabajo de cultivos puros de las comunidades naturales

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...