Name: combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales
Uploaded: 2020-11-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales at JoVE.com

Vi erkänner hjälp av Antoine Wiedmer med installationen av robotautomaten och dispenser.py skriptet.

1. Bakteriekulturens villkor
<ol><li>Arbeta under en laminär flöde huva, använd 100 μL av ett glycerol lager av GFP-taggade Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 mL-1, lagras vid -80 °C) att inokulera 5 mL Luria-Bertani (LB) medium. Inkubera vid 30 °C medan du skakar vid 250 rpm över natten.</li>
	<li>Nästa dag, återanvänd 100 μL av övernattningskulturen i 5 mL LB-medium och inkubera under samma förhållanden för 5h (exponentiell fas). Provsök en 1 mL alikvot i ett 2 mL-rör,...

<ol>
	<li>Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+and+removal+of+pathogenic+bacteria+in+wastewater+percolating+through+porous+media:+a+review.">Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review.</a> Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).</li><li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues.">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li><li>Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processes+in+microbial+transport+in+the+natural+subsurface.">Processes in microbial transport in the natural subsurface.</a> Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).</li><li>Tufenkji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+microbial+transport+in+porous+media:+Traditional+approaches+and+recent+developments.">Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments.</a> Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).</li><li>Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+modelling+straining+of+Escherichia+coli+in+saturated+porous+media.">Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media.</a> Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).</li><li>Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+and+biogeochemistry+of+stream+biofilms.">The ecology and biogeochemistry of stream biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).</li><li>Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+biophysical+underpinnings+to+the+success+of+multispecies+biofilms+in+porous+environments.">Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments.</a> The ISME Journal. 1, (2019).</li><li>Carrel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+in+3D+porous+media:+Delineating+the+influence+of+the+pore+network+geometry,+flow+and+mass+transfer+on+biofilm+development.">Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development.</a> Water Research. 134, 280-291 (2018).</li><li>Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+hopping+and+trapping+in+porous+media.">Bacterial hopping and trapping in porous media.</a> Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).</li><li>Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trait-specific+dispersal+of+bacteria+in+heterogeneous+porous+environments:+from+pore+to+porous+medium+scale.">Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale.</a> Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).</li><li>Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+preferential+flow+paths+perpetuated+by+microbial+activity+in+the+soil+matrix?+A+review.">Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review.</a> Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).</li><li>Creppy, A., Cl&#233;ment, E., Douarche, C., D'Angelo, M. V., Auradou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+motility+on+the+transport+of+bacteria+populations+through+a+porous+medium.">Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium.</a> Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).</li><li>Camesano, T. A., Logan, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Fluid+Velocity+and+Cell+Concentration+on+the+Transport+of+Motile+and+Nonmotile+Bacteria+in+Porous+Media.">Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media.</a> Environmental Science &amp; Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).</li><li>Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+surface+characteristics+on+the+transport+of+multiple+Escherichia+coli+isolates+in+large+scale+columns+of+quartz+sand.">The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand.</a> Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).</li><li>Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+biofilm+on+bacterial+transport+and+deposition+in+porous+media.">Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media.</a> Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).</li><li>Long, T., Ford, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Transverse+Migration+of+Bacteria+by+Chemotaxis+in+a+Porous+T-Sensor.">Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor.</a> Environmental Science &amp; Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).</li><li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+Expanding+the+Frontiers+of+Microbial+Ecology.">Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology.</a> Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Digital+Video+Microscopy+for+Colloidal+Studies.">Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+determination+of+bacterial+abundance+in+lake+plankton+with+the+green+nucleic+acid+stain+SYTO+13.">Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13.</a> Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).</li></ol>

Här föreslår vi två sätt att studera transport av mikrober genom porösa system på encells- och populationsnivå. Medan studiet av transportfenomen med hjälp av BTC-modellering har gett värdefulla insikter om spridningen av patogener eller föroreningar vid ekosystemskalorna, finns det fortfarande svårigheter att skala från laboratorieexperiment till fältförhållanden. De verktyg som beskrivs här gör det möjligt för forskare att experimentellt lösa de rumsliga och tidsmässiga skalorna för att bättre f...

Studier som syftar till att förstå transport av mikrober genom porösa medier har främst drivits av oro förkontaminering 1, överföring avsjukdom 2 och bioremediering3. I detta avseende har bakterier mestadels behandlats som partiklar i transportmodeller4 och processer som filtrering, sila, gravitationell sedimentering eller remobilisering från biofilmer har identifierats som förare av retention eller transport av mikrober5. Men att studera transport av bakterier genom porösa landskap kan också informera oss om de ekologiska strategier som ligger till grund för deras framgång i dessa komplexa miljöer. Ändå kräver detta nya experiment och matematiska modeller som verkar på encell, befolkning eller mikrobiell gemenskap nivå.
Naturliga porösa miljöer, såsom de som finns i hyporézonen av bäckar och floder, är tätt koloniserade av olika samhällen av biofilmbildande mikrober6. Biofilmer bildar strukturer som modifierar flödet och därmed transport och spridning av bakterier ivätskefasen 7,8. Transport av bakterier i porskala beror på den begränsade utrymme tillgängligheten i den porösa matrisen och motility-relaterade spridning kan vara ett effektivt sätt att öka den individuella konditionen genom minskad konkurrens om resurser i mindre tätbefolkade områden. Å andra sidan kan motila bakterier också nå mer isolerade regioner i den porösa matrisen och den utökade utforskningen av sådana områden kan ge ekologiska möjligheter att motila populationer10. Vid större rumsliga skalor, avleder biofilm tillväxt flödet vägar också leder till (partiell) igensättning av porer och, därmed, till inrättandet av ännu mer kanaliseras och heterogena flödesförhållanden11. Detta får konsekvenser för näringstillförsel och spridningsförmåga, frekvens och avstånd. Förmånsflöde, till exempel, kan generera så kallade "fast-tracks" och motila bakterier kan uppnå ännu högre hastigheter än det lokala flödet längs dessa spår12. Detta är ett effektivt sätt att öka utforskningen av nya livsmiljöer.
En mängd olika verktyg begagar sig för studier av transport av motila och icke-motila bakterier (och partiklar) i porösa medier. Numeriska modeller har stora prediktiva kapaciteter som är viktiga för tillämpningar, dock ofta begränsas av inneboende antaganden4. Experiment i laboratorieskala13,14 i kombination med modellering av genombrottskurva (BTC) har gett viktiga insikter i betydelsen av bakteriella cellytegenskaper för att fastna effektivitet15. Vanligtvis erhålls BTCs (dvs. gånger serie av partikelkoncentration på en fast plats) via konstant-rate releaser och mätning av cellnummer vid utflödet av den experimentella enheten. I detta sammanhang, BTCs återspeglar advection-dispersion dynamiken hos bakterier i den porösa matrisen och kan förlängas med en diskbänk sikt redovisning av kvarstad. Modellering av BCC ensam inte lösa dock rollen av rumslig organisation av det porösa substrat eller biofilm för transportprocesser. Andra makroskopiska observables som dispersivity eller deposition profiler har visat sig ge viktig information om den rumsliga fördelningen eller de bevarade partiklar eller växande samhällen. Microfluidics är en teknik som gör det möjligt att studera transporter i porösa medier genom mikroskopi undersökning9,12,16, och utom en nyligen arbete10, experimentella system är vanligtvis begränsas till en enda längd skala av upplösning, det vill säga porskalan eller hela fluidic enhet skala.
Här introducerar vi en svit av kombinerade metoder för att studera transporten av motila och icke-motila bakterier i porösa landskap i olika skalor. Vi kombinerar observationer av bakterietransport i porskalan med information i större skala, med hjälp av BTC-analys. Mikrofluidiska anordningar byggda av mjuk litografi med hjälp av polydimetylsiloxan (PDMS) är biokompatibla, resistenta mot en rad kemikalier, möjliggör replikerbarhet till låga kostnader och ger utmärkt optisk transparens samt låg autofluorescens som är kritisk för mikroskopisk observation. Mikrofluidik baserad på PDMS har tidigare använts för att studera transport av mikrober i enkla kanaler17 eller i mer komplexa geometrier12. Men typiskt mikrofluidik experiment fokus på kortsiktiga horisonter och epi-fluorescens mikroskopisk observation av levande celler är vanligen begränsad till genetiskt modifierade stammar (t.ex. GFP-taggade stammar). Här presenterar vi verktyg för att studera bakteriell transport med hjälp av PDMS-baserade mikrofluidiska enheter i kombination med mikroskopi och större enheter som är tillverkade av poly(metylmetakrylat) (PMMA, även känd som plexiglas) i kombination med flödescytometri. PDMS och PMMA skiljer sig åt i gaspermeabilitet och ytegenskaper, vilket ger komplementära möjligheter att studera bakterietransport. Medan den mikrofluidiska enheten ger en mer kontrollerad miljö, den större enheten möjliggör experiment under längre tidsperioder eller med hjälp av naturliga bakteriesamhällen. Mikroskopi som räknar med hög temporal upplösning i ett dedikerat område används för att erhålla BTC i den PDMS-baserade mikrofluidiska enheten. För att erhålla cellantal för BTC-modellering från den PMMA-baserade enheten introducerar vi en egenkonstruerad automatiserad vätskedispenser i kombination med flödescytometri. I denna inställning passerar celler den fluidiska enheten och lämnas i följd ut i 96 brunnsplattor. Den tidsmässiga upplösningen begränsas av den minsta volym som kan avdistlades exakt och därmed medelflödet genom den fluidiska enheten. Fixativ i brunnarna förhindrar tillväxt och underlättar DNA-färgning för nedströms flödes-cytometrisk uppräkning. För att förhindra bakterietillväxt under transport experiment vi använder en minimal medium (termed motility buffert).
Eftersom protokoll för beredning av fluidiska enheter i olika skalor är lätt tillgängliga, vi bara kortfattat införa tekniker för att producera sådana enheter och snarare fokusera på experimentella förfaranden för att spela in BTCs. På samma sätt finns olika rutiner för flödet cytometric uppräkning av mikrober och användare kräver expertkunskap för att tolka resultat som erhållits genom flödescytometri. Vi rapporterar den nya användningen av mikrofluidiska enheter i kombination med mikroskopisk avbildning för att registrera BTCs av fluorescently-taggade celler. I porskalan erhålls lokala hastigheter och banor med hjälp av bildbehandling. Vidare visar vi användningen av en PMMA-baserade fluidic enhet i kombination med flöde-cytometric räkna att observera bakteriell transport av motila och icke-motila celler i porösa miljöer koloniseras av en native stream biofilm.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastomer Sylgard 184</td>
			<td>Dowsil</td>
			<td>101697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer NovoCyte</td>
			<td>Acea</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit</td>
			<td>makeblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axio Imager</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope AxioZoom v16</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 75 mm &#215; 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 3 peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma bonder Corona SB</td>
			<td>BlackHole Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump New Era NE 4000</td>
			<td>New Era</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF31SA universal milling machine</td>
			<td>Mikron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining fluidic devices with microscopy and flow cytometry to study microbial transport in porous media across spatial scales

Att förstå mikroorganismers transport, spridning och nedfall i porösa medier är en komplex vetenskaplig uppgift som omfattar så skilda ämnen som hydrodynamik, ekologi och miljöteknik. Att modellera bakterietransport i porösa miljöer på olika rumsliga skalor är avgörande för att bättre förutsäga konsekvenserna av bakterietransport, men nuvarande modeller misslyckas ofta till att upp-skala från laboratoriet till fältförhållanden. Här introducerar vi experimentella verktyg för att studera bakterietransport i porösa medier i två rumsliga skalor. Syftet med dessa verktyg är att få makroskopiska observabler (såsom genombrottskurvor eller depositionsprofiler) av bakterier som injiceras i genomskinliga porösa matriser. I den lilla skalan (10-1000 μm) kombineras mikrofluidiska anordningar med optisk videomikroskopi och bildbehandling för att få genombrottskurvor och samtidigt spåra enskilda bakterieceller i porskalan. I större skala kombineras flödescytometri med en egentillverkad robotdispenser för att få genombrottskurvor. Vi illustrerar nyttan av dessa verktyg för att bättre förstå hur bakterier transporteras i komplexa porösa medier som hyporheic zon av strömmar. Eftersom dessa verktyg ger samtidiga mätningar över skalor, bana de väg för mekanism-baserade modeller, kritiskt viktigt för uppskalning. Tillämpning av dessa verktyg kan inte bara bidra till utvecklingen av nya bioremediering applikationer men också kasta nytt ljus över de ekologiska strategier mikroorganismer kolonisera porösa substrat.

För att illustrera funktionaliteten i det presenterade arbetsflödet utförde vi experiment med hjälp av genetiskt modifierade Pseudomonas putida KT2440, en gramnegativ motilbakterie som är viktig för bioremediering och bioteknik. Genetiskt modifierade versioner av denna stam som uttrycker GFP-produktion är kommersiellt tillgängliga. En icke-motil stam av P. putida KT2440 som saknar de relevanta strukturella och reglerande gener för motilitet finns också. Använd...

Watch this Scientific Journal Video about Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales at JoVE.com

Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

Genombrottskurvor (BTCs) är effektiva verktyg för att studera transport av bakterier i porösa medier. Här introducerar vi verktyg baserade på fluidiska enheter i kombination med mikroskopi och flödescytometrisk räkning för att erhålla BTC.

Kombinera fluidiska enheter med mikroskopi och flödescytometri för att studera mikrobiell transport i porösa medier över rumsliga skalor

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

Att studera transport av bakterier i porösa system är viktigt med avseende på kontaminering, spridning av sjukdomar, och bioremediering. För dessa experiment i matematiska modeller som verkar på den enda cellen, befolkningen och den mikrobiella gemenskap nivå krävs. Här presenterar vi verktyg för att studera bakterietransport med hjälp av mikrofluidiska anordningar och mikroskopi, samt större enheter i kombination med flödescytometri.Kombinationen av mikrofluidiska enheter med mikroskopi och flödescytometri erbjuder en rad möjligheter att studera bakteriella transportfenomen i olika rumsliga skalor. För att fullt ut utforska detta protokoll, föreslås det att ha tidigare erfarenhet av mikroskopi, grundläggande bildbehandling, utforma mikrofluidiska enheter, och behärska flödescytometri. Denna video beskriver två metoder för att studera bakteriell transport på olika rumsliga skalor.Den första metoden, baserad på mikrofluidiska enheter, bygger på mikroskopi för att räkna enskilda celler. Detta system kan användas för att studera bakteriell transport över flera rumsliga skalor från poren till hela den porösa systemskalan. Den andra metoden, med användning av större fluidiska enheter kopplade till en automatiserad dispenser och flödescytometri, kan användas för att studera bakteriell transportfenomen i skala av hela porösa system.Sådana metoder kan också sättas in i laboratorieskala kolumnstudier, liksom små fältundersökningar. Till att börja designa önskad porös geometri som består av en matris av cirklar. Baserat på den valda geometrin, förbereda en form med hjälp av standard SU-8 fotolitografi.Förbered 50 gram PDMS genom att lägga till 90%av elastomer till 10%av härdningsmedel till 90%av elastomer i vikt i en ren engångsbehållare och blanda de två reagenserna med ett rent verktyg. Applicera ett vakuum på 100 millibar i 30 minuter för att avlägsna upplöst luft och bubblor. Placera formen i en Petriskål och häll PDMS på formen till önskad höjd mellan två och fem millimeter.Täck petriskålen med lock och håll den på 60 grader Celsius i minst fyra timmar. Därefter låter du den mikrofluidiska enheten svalna till rumstemperatur. När den är kyld, ta försiktigt bort den önskade delen av PDMS med en skalpell.Tillfälligt försegla botten av PDMS-kanalen med tejp. Med en 0,5 millimeter diameter puncher, pierce kanaler för att skapa ett inlopp och ett utlopp. Ta bort bandet från PDMS-kanalen och placera kanalen med den porösa sidan uppåt.Behandla glasglaset och PDMS-ytorna med plasma i ca 45 sekunder vardera i rumstemperatur. Placera den förbehandlade PDMS-kanalen på den förbehandlade glasrutschbanan och värm vid 100 grader Celsius i 30 minuter på en värmeplatta, ta sedan ut den mikrofluidiska enheten från värmeplattan och kyl den till rumstemperatur. Applicera vakuum i 30 minuter för att avlägsna luft från PDMS.För att producera basen som innehåller porfacket, använd högprecision mikro fräsning för att ta bort 0,5 millimeter från basen PMMA lager och fräs ett spår med storleken på 1,1 av 1,1 millimeter för en gummi O-ring. Borra två gängade hål för ett in- och utlopp i den övre delen av den fluidiska enheten och 12 hål för skruvar. Detta fungerar som locket på den fluidiska enheten.Efter rengöring av fluidic enheten, skruva ihop bas och lock med hjälp av de 12 gängade hålen. Ta bort mikrofluidiken från vakuum och placera den på mikroskopstadiet. Använd sprutan pumpen mätta den med motilitet buffert.Med hjälp av Brightfield-mikroskopi eller faskontrast justerar du förstoringen för att visualisera enskilda bakterieceller och fokusera på observationskanalens centrum. Växla ljusbanans inställningar till fluorescensmikroskopi. Justera fokus genom en förskjutning och kamerans exponeringstid för att lösa enskilda bakterieceller.I det här fallet 100 millisekunder. Därefter för in inloppslangen i ett två milliliterrör som innehåller bakterieupphängningen. Backa pumpriktningen och börja dra tillbaka upphängningen med en flödeshastighet på en mikroliter per minut.Skanna tvärsnittet av hela observationskanalen, spela in en bild varje minut. Importera bilder till en önskad mjukvaruplattform. Spela in bakgrunden som medelvärde för de första bilderna när inga partiklar har registrerats.Subtrahera bakgrunden från varje bild för att ta bort kamerabrus och optisk avvikelse. Beskär bilderna till en region av intresse. Identifiera ett tröskelvärde som är lika med cellens fluorescenspixelintensitet så att värden som är större än tröskelvärdet omfattar bakterieceller.Använd bildbehandling för att subtrahera tröskelvärdet från varje bild. Binarize den resulterande bilden så att bakterieceller tar ett värde av en, medan bakgrunden tar ett värde på noll. Ta bort kluster av pixel med ett område som är mindre än den minsta bakteriecellstorleken i pixlar.Summera den binarerade bilden för att få fram det totala antalet pixlar för de återstående klustren. Dividera antalet pixlar med den genomsnittliga storleken på en bakteriecell i pixlar för att få en uppskattning av antalet celler. Omvandla antalet till koncentration i partiklar per milliliter.För att identifiera koncentrationen av den injicerade bakterieupphängningen, injicera bakterieupphängningen i observationskanalen för en ren mikrofluidisk anordning med en spruta. Antjäna bilden och beräkna den influenta bakteriekoncentrationen som tidigare visats. Visualisera genombrottskurvor genom att normalisera den utflödesbakteriella koncentrationen C med den influenta bakteriekoncentrationen C0 och rita C över C0 kontra tid.För att analysera de lokala hastigheter och banor av bakterier som transporteras genom den porösa matrisen, flytta mikroskopet scenen till en region av intresse och justera fokus till centrum av den mikrofluidiska enheten. Ställ in den optiska konfigurationen på faskontrast eller fluorescensmikroskopi. Registrera timelapse-bilder och en exponeringstid kort nog för att fånga bakterieförskjutning.I det här fallet 50 millisekunder. Spela in bilder över en tillräcklig tid, till exempel tre minuter. Om du vill ta bort brus från varje bild subtraherar du bakgrunden, vilket är medelvärdet av summan av alla inspelade bilder.Bestäm modulus av den numeriska gradienten och normalisera den genom dess maximala värde. Hitta och registrera bakteriella koordinater och tiden för bildförvärv i en fil med tre kolumner. Utför partikelspårningsanalys för att bearbeta de registrerade data och beräkna trajektorerna.För att få deposition profiler, spela in en sammansatt bild av hela porösa kanalen innan, det är bakgrunden, och efter injektion av bakteriell suspension genom mikrofluidiska enheten. Ta bort bakgrund från de bilder som spelats in efter bakteriell injektion. Beräkna depositionsprofilen D som summan av den bakteriella fluorescenssignalen längs transversala sektioner av längd x av den porösa kanalen.Visualisera depositionsprofilen som den lokala fluorescenssignalen kontra den porösa kanallängden. För att ställa in den automatiserade dispensern, placera robotdispensern nära den fluidiska enheten. Anslut robotdispensern till datorn som kör BCNC och identifiera rätt com-port.I BCNC klickar du på hemknappen för att återföra robotautomaten till hempositionen. Anslut peristaltiska pumpen med inloppet med hjälp av 50 centimeter lång, en millimeter innerdiameter slangar, och utflödet med den automatiserade dispensern med hjälp av samma slang. Pumpa odlingsmedium genom den fluidiska enheten.Notera ankomsten av medium vid utloppsslangen fast på robotautomaten och placera en 96-brunnsplatta som kommer att samla utflödet. Aktivera samtidigt robotdispensern och injicera bakterieupphängningen genom PMMA-fluidikapparaten med en flödeshastighet på 0,2 milliliter per minut. Injicera bakterie suspension motsvarande flera porvolymer.Till exempel 30 gånger volymen av den fluidiska enheten. Efter injektion, byt till steril odlingsmedium fram till slutet av experimentet. När en 96-brunnsplatta är klar, täck plattan och förvara på fyra grader Celsius tills flödescytometrianalys.Analysera prover med flödescytometri och visualisera genombrottskurvor genom att normalisera den utflytande bakteriekoncentrationen C med den influenta bakteriekoncentrationen C0 och plotta C över C0 kontra tid. I denna studie, med hjälp av både motila och icke-motila Pseudomonas putida KT2440, utfördes sekventiella experiment i PDMS mikrofluidiska enheter med en slumpmässig matris av pelare. Genombrottskurvor normaliserade till koncentrationen av injicerade celler, liksom bakteriebanor vid porskalan visas här.Experiment med storskaliga fluidiska enheter som slipats från PMMA utfördes också. Motila och icke-motila Pseudomonas putida KT2440 injicerades i en regelbundet fördelade porösa matris. Slående, i en porös miljö saknar biofilm, motila och icke-motila Pseudomonas putida KT2440 visade en markant olika transport beteende baserat på genombrott kurvor.I en porös matris koloniserade i 48 timmar med en komplex ström biofilm gemenskap, dessa skillnader i genombrott kurvor mellan motila och icke-motila Pseudomonas putida KT2440 försvann. Vi använder detta system för att studera bakterietransport i strömmarna, men dessa verktyg kan lätt justeras för att studera bakteriella transportfenomen i andra konstruerade och miljösystem. Bakterietransport genom hydratiserade porösa medier kapslar in processer över flera rumsliga skalor.Den metod som här presenteras möjliggör länkning av den lokala förskjutningen av bakterier i porskalan till den mikroskopiska transporten på hela det porösa mediet.

Research

JoVE Journal

Environment

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Framställning och testning av impedans-baserade fluid Biochips med RTgill-W1 celler för snabb utvärdering av dricksvatten Prover för toxicitet

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Utvinning och analys av mikrobiell Phospholipid fettsyror i jordar

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems (PEMS) for the Real-driving Emissions (RDE) Regulation in Europe

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems PEMS for the Real-driving Emissions RDE Regulation in Europe

Genomförande av bärbara Utsläpp mätsystem (PEMS) för Real-körning Utsläpp (RDE) förordning i Europa

Vehicles are tested in controlled and relatively narrow laboratory conditions to determine their official emission values and reference fuel consumption. ...

Using Pharmacological Manipulation and High-precision Radio Telemetry to Study the Spatial Cognition in Free-ranging Animals

Använda Farmakologisk manipulation och med hög precision Radio Telemetry att studera Spatial Cognition i frigående djur

An animal&#39;s ability to perceive and learn about its environment plays a key role in many behavioral processes, including navigation, migration, ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

Spridning av nanomaterial i vattenhaltigt medium: mot protokollet optimering

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Microfluidic Devices for Characterizing Pore-scale Event Processes in Porous Media for Oil Recovery Applications

Mikroflödessystem enheter för kännetecknar Pore-skala händelse processer i porösa medier för olja återvinning program

Microfluidic devices are versatile tools for studying transport processes at a microscopic scale. A demand exists for microfluidic devices that are ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Karakterisering av vattenlevande biofilmer med flödescytometri

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Metal Corrosion and the Efficiency of Corrosion Inhibitors in Less Conductive Media

Metall korrosion och effektiviteten av korrosionsinhibitorer i mindre ledande Media

Material corrosion can be a limiting factor for different materials in many applications. Thus, it is necessary to better understand corrosion processes, ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Isolering och analys av mikrobiella samhällen i jord, odlingsbädden och rötter i perenna gräs experiment

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Characterizing Microbiome Dynamics ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œ Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Kännetecknar mikrobiomet Dynamics – flödescytometri baserade arbetsflöden från rena kulturer till naturliga samhällen

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...