Name: ubiquitin chain analysis by parallel reaction monitoring
Uploaded: 2020-06-17T13:00:00
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Os autores agradecem a Céline Jeanty por sua ajuda na criação de pelotas celulares com tratamento da MG-132, conforme descrito nos resultados representativos e Elise Mommaerts por sua provisão de pelotas E. coli utilizadas no protocolo.

1. Preparação de um padrão de peptídeo pesado
<ol><li>Dependendo do fornecedor e da qualidade dos peptídeos pesados comprados, os peptídeos pesados precisarão ser diluídos. Este protocolo utilizou as sequências de peptídeos relatadas na Tabela 1, com o aminoácido terminal C modificado para lisina (13C615N2-lysine) ou Arginina (13C615N4-arginina).<ol>
<li>Misture os peptídeos pesados, diluindo a mistura c...

<ol>
	<li>Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+post-translational+modification+statistics:+frequency+analysis+and+curation+of+the+swiss-prot+database.">Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database.</a> Scientific Reports. 1, 90 (2011).</li><li>Goldstein, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+polypeptide+that+has+lymphocyte-differentiating+properties+and+is+probably+represented+universally+in+living+cells.">Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).</li><li>Glickman, M. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Ubiquitin+Binders+to+Decipher+the+Ubiquitin+Code.">Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).</li><li>Newton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+editing+revealed+by+polyubiquitin+linkage-specific+antibodies.">Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies.</a> Cell. 134 (4), 668-678 (2008).</li><li>Spence, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle-regulated+modification+of+the+ribosome+by+a+variant+multiubiquitin+chain.">Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain.</a> Cell. 102 (1), 67-76 (2000).</li><li>Borr&#224;s, E., Sabid&#243;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+targeted+proteomics?+A+concise+revision+of+targeted+acquisition+and+targeted+data+analysis+in+mass+spectrometry.">What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry.</a> PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).</li><li>Lesur, A., Domon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+high-resolution+accurate+mass+spectrometry+application+to+targeted+proteomics.">Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics.</a> PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).</li><li>Longworth, J., Dittmar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Ubiquitin+Chain+Topology+by+Targeted+Mass+Spectrometry.">Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1977, 25-34 (2019).</li><li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry.">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li><li>Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+proteasome+reduce+the+accelerated+proteolysis+in+atrophying+rat+skeletal+muscles.">Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Collision+Energy+Optimization+on+the+Measurement+of+Peptides+by+Selected+Reaction+Monitoring+(SRM)+Mass+Spectrometry.">Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).</li></ol>

A análise do estado de oniquitina dentro de um proteome é de crescente importância para uma ampla variedade de questões biológicas. A descrição do estado de ubiquiinação de uma amostra deve focar não apenas no perfil das proteínas que estão sendoubiquitinadas, mas também na topologia de tal ubiquiinação. A avaliação dessa topologia por MS direcionada, como descrito aqui, tem um papel em uma ampla gama de investigações biológicas.
Deve-se entender que o protocolo aqui descri...

A regulação estreita da função proteica e da estabilidade é de suma importância, pois são os principais impulsionadores do controle fenotípico da biologia. A função de uma proteína é construída a partir de dois componentes: sua sequência intrínseca de polipeptídeos e quaisquer modificações pós-transicionais (PTMs). Vários PTMs químicos foram identificados, incluindo glicosilação, fosforilação, acetilação e metilação1. Em 1975, Goldstein et al.2 identificaram uma pequena proteína e a chamaram de ubiquitina devido à sua natureza onipresente. A ubiquitina foi considerada importante na degradação da proteína3. No entanto, desde então, foi estabelecido que a função da ubiquitina como molécula de sinalização vai muito além da regulação da estabilidade proteica. A sinalização da ubiquitina está envolvida em uma ampla gama de outras funções biológicas, como estabilização de proteínas, autofagia, controle de ciclo celular e tráfico de proteínas4.
Enquanto outros PTMs são geralmente binários (ou seja, a proteína é modificada ou deixada não modificada) para um determinado local, a ubiquitina pode modificar uma proteína tanto como monômero ou como uma cadeia polimérica, com a própria ubiquitina ligada. Além disso, esta cadeia de poliugenência pode desenvolver-se em várias topologias com a ubiquização da ubiquitina anterior anexando-se a um dos oito locais de ligação5,6. A ubiquitina é transferida por um processo enzimático multipreitado (Figura 1)onde o C-terminus da ubiquitina está ligado a um de seus sete resíduos de liseina (K06, K11, K27, K29, K33, K48 ou K63) ou o terminal N da ubiquitina anterior (referido como ubiquização M1 ou linear)5,6. Esta topologia de cadeia é a chave para o destino da proteína sob modificação. Por exemplo, a modificação com uma cadeia ligada a K48 ou K11 leva à degradação da proteína modificada no proteasome, enquanto uma cadeia linear é necessária para a ativação da sinalização NF-kB. Assim, a distribuição relativa dessas topologias em cadeia é relevante para uma ampla variedade de questões biológicas.
O uso da espectrometria de massa (MS) é de particular benefício para a análise topologia da cadeia de ubiquitina, pois não depende de interações baseadas em anticorpos ou à afinidade7,8, muitas das quais têm especificidade limitada e não diferenciam entre os vários tipos de cadeia. Uma possibilidade diferente de detecção é usar mutantes de ubiquitina geneticamente modificados. Aqui, uma lise específica é trocada por arginina, que não pode suportar a modificação por ubiquitina. A falta de formação da cadeia de ubiquitina na proteína do substrato é então interpretada como evidência para uma topologia específica9.
A identificação baseada em MS de proteínasubiquitinadas baseia-se no fato de que o C-terminus de ubiquitina contém um resíduo de arginina na posição 74 que é reconhecido pela trippsina durante a preparação proteolítica das amostras para análise de MS, separando a glicina dupla terminal C. Este GlyGly (-GG) permanece ligado ao grupo ε-amino do resíduo de liseina da proteína do substrato. Para a análise de topologia da ubiquitina, a modificação ocorre em um dos sete resíduos de ubiqutina. Isso cria um conjunto de sete peptídeos-chave que carregam um resíduo de liseina que é modificado por GG, específico para cada uma das topologias(Figura 2). Por exemplo, com a topologia K06, a lisina na posição 6 na sequência de aminoácidos será protegida da digestão tripptica com uma modificação de -GG de 114 Da adicionada a esta lisina.
A identificação de peptídeos pré-determinados específicos por MS é referida como proteômica direcionada, ou, mais especificamente, aquisição de peptídeos direcionados10. Dois métodos foram desenvolvidos dependendo do desempenho do espectrômetro de massa que está sendo utilizado. São selecionados monitoramento de reação (SRM), também chamado de monitoramento de reação múltipla (MRM) e monitoramento de reação paralela (PRM). O SRM envolve a seleção de transições constituída pelo precursor m/z e pelo produto íon m/z. Por outro lado, o PRM requer apenas o precursor m/z. Seleção de postes, é realizada uma pesquisa completa dos íons do produto. Isso tem a vantagem de que não é necessária seleção de íons de produtos apropriados para quantitação no espectrômetro de massa específico antes da medição11. Tanto o SRM quanto o PRM podem, dependendo do instrumento, ser agendados. O agendamento é a prática de atribuir uma janela de tempo durante a qual um determinado íon será incluído para análise, pois os peptídeos estão eluvando em tempos de retenção definidos do sistema cromatográfico. Reduzir o número de íons sendo interrogados a qualquer momento aumenta a frequência de interrogatório desses íons programados naquele momento, melhorando assim a precisão dos dados.
Em geral, a aplicação de proteômica direcionada para topologia de ubiquína é a mesma de qualquer outro experimento de proteômica direcionado. No entanto, duas diferenças fundamentais são importantes: primeiro, deve-se considerar a estabilidade das cadeias de ubiquitina. Existem múltiplas enzimas debiquitinadas potentes (DUBs) que rapidamente degradam cadeias sobre a lise celular. As proteases específicas da ubiquitina se enquadram em duas categorias, as tioesterases e metaloproteases. A maioria das hidrolases da ubiquiquitina são tiaesterases e carregam um resíduo de cisteína em seu centro ativo. Ao alquilar este resíduo de cisteína, eles podem ser inativados. Como tal, o uso de tampões de estabilização de ubiquitina contendo agentes alquilantes, como n-ethylmaleimida (NEM), e produtos químicos altamente desnaturados, e manter amostras refrigeradas é vital para uma análise bem sucedida. Em segundo lugar, ao contrário de outros experimentos direcionados, a escolha do peptídeo é fixa. Em um experimento típico direcionado, um peptídeo proteotipado pode ser selecionado para um bom desempenho cromatógrafo e ionização. Para alguns peptídeos característicos da topologia, como o K48, essas propriedades são boas, enquanto para outros, são menos desejáveis. Por exemplo, a cromatografia K33 em uma configuração típica de fase inversa é ruim devido à formação de um perfil de elução esticada, e as propriedades de ionização precárias do peptídeo K27 reduzem sua visibilidade pela MS12.
Neste protocolo, descrevemos como realizar a avaliação topologia da ubiquitina de uma amostra biológica por PRM. Exemplos de dados para o procedimento são apresentados utilizando uma perturbação do proteasome utilizando tratamento inibidor MG-132 em vários tipos de células diferentes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (ABC)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroacetamide (CAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBind</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heavy Peptides</td>
			<td>JPT Peptide Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Ulitimate 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lys C</td>
			<td>Wako</td>
			<td>125-05061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q-Exactive Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide (NEM)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>156100050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain K48</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain K63</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-340-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain M1</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-710B-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier</td>
			<td>Branson sonifier</td>
			<td>SFX 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigam</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V1511A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters &#956;Elution C18 plates</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002318</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ubiquitin chain analysis by parallel reaction monitoring

A avaliação do perfil global das topologias da cadeia de ubiquidades dentro de um proteome é de interesse para responder a uma ampla gama de perguntas biológicas. O protocolo aqui delineado aproveita a modificação di-glicina (-GG) deixada após a digestão tripptic da ubiquitina incorporada em uma cadeia. Ao quantificar esses peptídeos característicos da topologia, a abundância relativa de cada topologia da cadeia de ubiquitina pode ser determinada. As etapas necessárias para quantificar esses peptídeos por um experimento paralelo de monitoramento de reação são relatadas levando em consideração a estabilização das cadeias de ubiquitina. A preparação de controles pesados, lise celular e digestão são descritas juntamente com a configuração adequada do espectrômetro de massa e o fluxo de trabalho de análise de dados. Um exemplo de dados com perturbações na topologia da ubiquitina é apresentado, acompanhado de exemplos de como a otimização do protocolo pode afetar os resultados. Seguindo as etapas traçadas, o usuário poderá realizar uma avaliação global do cenário de topologia da ubiquitina dentro de seu contexto biológico.

Para demonstrar o uso de uma análise da cadeia de ubiquitina pela PRM, foram selecionadas três linhas celulares: uma linha celular de melanoma de camundongos B16, e as duas linhas celulares humanas comuns A549 (células epitriliais basoeliares adenocarcinômicas) e HeLa (células cancerígenas cervicais). Essas culturas cresceram para a fase média em mídia adequada antes de serem tratadas com 0, 10 ou 100 mM MG-132 por 4h antes da colheita. MG-132 é um inibidor proteasome que previne a degradação de proteínas con...

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Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Este método descreve a avaliação das mudanças globais na topologia da cadeia de ubiquitina. A avaliação é realizada pela aplicação de uma abordagem de proteômica direcionada baseada em espectrometria de massa.

Análise da cadeia de Ubiquitin por monitoramento de reação paralela

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

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