Name: ubiquitin chain analysis by parallel reaction monitoring
Uploaded: 2020-06-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Селин Джинти за помощь в создании клеточных гранул с лечением MG-132, как описано в репрезентативных результатах, и Элизе Моммертс за ее предоставление гранул кишечной палочки, используемых в протоколе.

1. Подготовка тяжелого пептидного стандарта
<ol><li>В зависимости от поставщика и качества закупаемых тяжелых пептидов, тяжелые пептиды необходимо будет разбавить. Этот протокол использовал пептидные последовательности, о которые сообщалось в таблице 1,с аминокислотой C-термин?...

<ol>
	<li>Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+post-translational+modification+statistics:+frequency+analysis+and+curation+of+the+swiss-prot+database.">Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database.</a> Scientific Reports. 1, 90 (2011).</li><li>Goldstein, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+polypeptide+that+has+lymphocyte-differentiating+properties+and+is+probably+represented+universally+in+living+cells.">Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).</li><li>Glickman, M. H., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway:+Destruction+for+the+sake+of+construction.">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: Destruction for the sake of construction.</a> Physiol. Rev. 82, 373-428 (2002).</li><li>Pickart, C. M., Eddins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin:+structures,+functions,+mechanisms.">Ubiquitin: structures, functions, mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1695 (1-3), 55-72 (2004).</li><li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance.">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li><li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+Code.">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li><li>Mattern, M., Sutherland, J., Kadimisetty, K., Barrio, R., Rodriguez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Ubiquitin+Binders+to+Decipher+the+Ubiquitin+Code.">Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).</li><li>Newton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+editing+revealed+by+polyubiquitin+linkage-specific+antibodies.">Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies.</a> Cell. 134 (4), 668-678 (2008).</li><li>Spence, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle-regulated+modification+of+the+ribosome+by+a+variant+multiubiquitin+chain.">Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain.</a> Cell. 102 (1), 67-76 (2000).</li><li>Borr&#224;s, E., Sabid&#243;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+targeted+proteomics?+A+concise+revision+of+targeted+acquisition+and+targeted+data+analysis+in+mass+spectrometry.">What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry.</a> PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).</li><li>Lesur, A., Domon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+high-resolution+accurate+mass+spectrometry+application+to+targeted+proteomics.">Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics.</a> PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).</li><li>Longworth, J., Dittmar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Ubiquitin+Chain+Topology+by+Targeted+Mass+Spectrometry.">Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1977, 25-34 (2019).</li><li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry.">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li><li>Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+proteasome+reduce+the+accelerated+proteolysis+in+atrophying+rat+skeletal+muscles.">Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Collision+Energy+Optimization+on+the+Measurement+of+Peptides+by+Selected+Reaction+Monitoring+(SRM)+Mass+Spectrometry.">Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).</li></ol>

Анализ состояния убиквитина в протеоме имеет все большее значение для широкого спектра биологических вопросов. Описание состояния убиквитина образца должно быть сосредоточено не только на профиле убиквитинированных белков, но и на топологии такого убиквитина. Оценка этой топологии ?...

Тесная регуляции белковой функции и стабильности имеет первостепенное значение, поскольку они являются основными факторами фенотипического контроля биологии. Функция белка построена из двух компонентов: его внутренней полипептидной последовательности и любых посттрансляционных модификаций (ПТМ). Были выявлены различные химические ПТС, включая гликозилирование, фосфорилирование, ацетилирование и метилирование1. В 1975 году Гольдштейн и др.2 определили небольшой белок и назвали его убиквитином из-за его вездесущей природы. Убиквитин оказался важным в деградации белка3. Однако с тех пор было установлено, что функция убиквитина как сигнальной молекулы выходит далеко за рамки регуляции белковой стабильности. Убиквитин сигнализации участвует в широком спектре других биологических функций, таких как стабилизация белка, аутофагия, контроль клеточного цикла, и торговлябелками 4.
В то время как другие ПТМ, как правило, двоичные (т.е. белок изменяется или остается неизмененным) для данного сайта, убиквитин может модифицировать белок как мономер, так и как полимерную цепь, при этом сам убиквитин прикрепляется. Кроме того, эта цепочка полиубикитинации может развиваться в нескольких топологиях с убиквититацией предыдущего убиквитина, прикрепляемого к одному извосьми мест связи 5,6. Убиквитин передается многоступенчатым энзиматический процесс (Рисунок 1), где C-терминус убиквитина связан с одним из семи остатков лизина (K06, K11, K27, K29, K33, K48, или K63) или N-терминал предыдущего убиквитина (называется M1 или линейной убиквитина)5. Эта топология цепи является ключом к судьбе белка в модификации. Например, модификация с цепочкой K48 или K11 приводит к деградации модифицированного белка у протеасомы, в то время как линейная цепь необходима для активации сигнализации NF-kB. Таким образом, относительное распределение этих цепных топологий имеет отношение к широкому кругу биологических вопросов.
Использование масс-спектрометрии (MS) имеет особое значение для анализа топологии цепи убиквитина, поскольку она не зависит от антител на основе или сродства наоснове взаимодействий 7,8, многие из которых имеют ограниченную специфичность и не различают различные типы цепи. Другая возможность обнаружения использует генетически модифицированных мутантов убиквитина. Здесь на аргинин обменивается специфический лизин, который не может поддерживать модификацию убиквитином. Отсутствие образования цепи убиквитина на субстратовый белок затем интерпретируется как доказательство для конкретной топологии9.
MS-идентификация убиквитинированных белков основана на том факте, что C-терминус убиквитина содержит остатки аргинина в положении 74, который распознается трипсином во время протеолитического приготовления образцов для анализа MS, отделяя C-терминальный двойной глицин. Этот GlyGly (-GG) остается ε к группе аминокислот лизина остатков субстрата белка. Для анализа топологии убиквитина, модификация происходит на одном из семи остатков лизина убиквитина. Это создает набор из семи ключевых пептидов, которые несут остатки лизина, который изменяется GG, специфичный для каждой из топологий(рисунок 2). Например, с K06 топологии, лизин на позиции 6 на аминокислотной последовательности будут защищены от триптического пищеварения с -GG модификации 114 Da добавил к этому лизин.
Идентификация конкретных предопределенных пептидов MS называется целевой протеомией, или, более конкретно, целевым приобретением пептида10. В зависимости от производительности используемого масс-спектрометра разработаны два метода. Это отдельный мониторинг реакции (SRM), также называемый множественным мониторингом реакции (MRM), и параллельный мониторинг реакции (PRM). SRM включает в себя выбор переходов, состоящий из прекурсора m/z и продукта ион m/z. И наоборот, PRM требует только прекурсора m/z. После выбора выполняется полное обследование ионов продукта. Это имеет то преимущество, что никакой выбор соответствующих ионов продукта для количественной оценки на конкретный масс-спектрометр не требуется доизмерения 11. И SRM, и PRM могут, в зависимости от инструмента, быть запланированы. Планирование – это практика присвоения тайм-окну, в течение которого определенный ион будет включен для анализа, так как пептиды eluting в определенное время удержания из хроматографической системы. Сокращение числа ионов, допрашиваемых в любой момент времени, увеличивает частоту допросов тех ионов, которые были запланированы в то время, тем самым повышая точность данных.
В целом, применение целевой протеомики для убиквитин топологии такой же, как и любой другой целенаправленный эксперимент протеомика. Однако важны два ключевых отличия: во-первых, необходимо учитывать стабильность убиквитиных цепей. Существует несколько мощных деубикитинирующих ферментов (ДУБ), которые быстро деградируют цепи при клеточномлизе. Протеазы, специфичные для убиквитина, подразнятся на две категории: тиоэстеразы и металлопротеазы. Большинство убиквитин-гидролазы являются тиоэстеразы и нести остатки цистеина в их активном центре. Путем alkylating этот остаток цистеин, они могут быть инактивированы. Таким образом, использование буферов стабилизации убиквитина, содержащих алкилатные агенты, такие как N-этилмалеимид (NEM), и высоко денатурированных химических веществ, и сохранение образцов охлажденными имеет жизненно важное значение для успешного анализа. Во-вторых, в отличие от других целевых экспериментов, выбор пептида фиксируется. В типичном целевом эксперименте протеотипический пептид может быть выбран для хорошей хроматографической и ионизации. Для некоторых топологически-характерных пептидов, таких как K48 эти свойства хороши, в то время как для других, они менее желательны. Например, хроматография K33 в типичной установке обратной фазы плоха из-за формирования растянутого профиля элюции, а плохие свойства ионизации пептида K27 снижают его видимость на MS12.
В этом протоколе мы описываем, как выполнить туплологическую оценку убиквитина биологического образца PRM. Примерные данные для процедуры представлены с использованием возмущения протеасомы с помощью ингибитора MG-132 лечения в нескольких различных типов клеток.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (ABC)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroacetamide (CAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBind</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heavy Peptides</td>
			<td>JPT Peptide Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Ulitimate 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lys C</td>
			<td>Wako</td>
			<td>125-05061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q-Exactive Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide (NEM)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>156100050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain K48</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain K63</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-340-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain M1</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-710B-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier</td>
			<td>Branson sonifier</td>
			<td>SFX 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigam</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V1511A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters &#956;Elution C18 plates</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002318</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ubiquitin chain analysis by parallel reaction monitoring

Оценка глобального профиля топологий убиквитиных цепочек в протеоме представляет интерес для ответа на широкий спектр биологических вопросов. Протокол, изложенный здесь, использует модификацию диглицина (-GG), оставленную после триптического пищеварения убиквитина, включенного в цепочку. Путем количественной оценки этих топологически-характерных пептидов можно определить относительное изобилие каждой топологии цепи убиквитина. Сообщается о шагах, необходимых для количественной оценки этих пептидов путем параллельного мониторинга реакции с учетом стабилизации убиквитиных цепей. Подготовка тяжелых элементов управления, клеточный лиз и пищеварение описаны вместе с соответствующей установкой масс-спектрометра и рабочим процессом анализа данных. Представлен пример набора данных с возмущениями в топологии убиквитина, сопровождаемый примерами того, как оптимизация протокола может повлиять на результаты. Следуя изложенным шагам, пользователь сможет провести глобальную оценку ландшафта топологии убиквитина в их биологическом контексте.

Чтобы продемонстрировать использование анализа цепи убиквитина PRM, были отобраны три клеточные линии: линия клеток мыши меланомы B16 и две общие линии клеток человека A549 (аденокарциномические альвеолярные базальные эпителиальные клетки) и HeLa (раковые клетки шейки матки). Эти культуры вы...

Watch this Scientific Journal Video about Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring at JoVE.com

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Этот метод описывает оценку глобальных изменений в топологии цепи убиквитина. Оценка проводится с помощью подхода, основанного на масс-спектрометрии, целенаправленной протеомики.

Убиквитин Цепной Анализ параллельным мониторингом реакции

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 в 1: один шаг очищение сродства для параллельного анализа протеин протеина и белка метаболит комплексов

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Анализ тилакоидной мембраны белковых комплексов, синий родной гель-электрофорез

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

В реальном времени наблюдения опосредовано Rad51 реакции обмена Strand ДНК

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Гибридный ясный/синий родной электрофорез для разделения и анализа митохондриальных Сверхкомплексов дыхательной цепи

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Высокое разрешение Комплекс Профилирование криосликинг BN-MS Анализ

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Профилирование убиквитин и убиквитин-подобных зависимых посттрансляционных модификаций и выявление значительных изменений

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Функциональная характеристика РИНГ-типа E3 Ubiquitin Ligases in Vitro и В Планте

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Параллельный допрос по набору в лигунд-2 для скрининга в Лиганде по шкале GPCR с использованием PRESTO-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Одноклеточный анализ транскрипционно активных аллелей одной молекулой FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...