Name: fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein
Uploaded: 2020-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein at JoVE.com

ونحن نعترف بدعم الاستنساخ والتعبير من كاريسا غروس ، جين ميلهالكو ، ومات درو في مختبر تعبير البروتين ، مختبر فريدريك الوطني لأبحاث السرطان. وقد تم تمويل هذا المشروع كليا أو جزئيا مع الأموال الاتحادية من المعهد الوطني للسرطان ، والمعاهد الوطنية للصحة ، ببموجب العقد رقم HHSN261200800001E. لا يعكس محتوي هذا المنشور بالضرورة اراء أو سياسات أداره الصحة والخدمات الانسانيه ، كما انه لا يشير إلى الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية أو المنظمات التي تنطوي علي تاييد حكومة الولايات الامريكيه

1. تنقيه البروتين
<ol><li>اعداد المخازن المؤقتة A-H ، كما هو الراي في الجدول 1.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>حل المخزن المؤقت</td>
			<td>عامل التخزين المؤقت (كل 20 مم)</td>
			<td>
pH
</td>
			<td>كلوريد الصوديوم (مم)</td>
			<td><...

<ol>
	<li>Cox, A. D., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation:+more+than+just+glue.">Protein prenylation: more than just glue.</a> Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).</li><li>Zhang, F. L., Casey, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Prenylation:+Molecular+Mechanisms+and+Functional+Consequences.">Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).</li><li>Hottman, D. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation+and+synaptic+plasticity:+implications+for+Alzheimer's+disease.">Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease.</a> Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).</li><li>Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+and+cognition+in+neurodegenerative+disorders.">HDL and cognition in neurodegenerative disorders.</a> Neurobiology of Disease. 72, 22-36 (2014).</li><li>Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pleiotropic+effect+of+statins:+prevention+of+cardiac+hypertrophy+by+cholesterol-independent+mechanisms.">A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms.</a> Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).</li><li>Kohnke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPase+prenylation+hierarchy+and+its+potential+role+in+choroideremia+disease.">Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease.</a> PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).</li><li>Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+prenylation+for+cancer+therapy.">Targeting protein prenylation for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).</li><li>Kho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tagging-via-substrate+technology+for+detection+and+proteomics+of+farnesylated+proteins.">A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).</li><li>Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAAX+geranylgeranyl+transferase+transfers+farnesyl+as+efficiently+as+geranylgeranyl+to+RhoB.">CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).</li><li>Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dragging+ras+back+in+the+ring.">Dragging ras back in the ring.</a> Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+in+Membrane+Biochemistry+and+Biophysics.">Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics.</a> Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).</li><li>Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Step-by-step+Method+for+the+Reconstitution+of+an+ABC+Transporter+into+Nanodisc+Lipid+Particles.">A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).</li><li>Dementiev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-Ras4B+lipoprotein+synthesis:+biochemical+characterization,+functional+properties,+and+dimer+formation.">K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation.</a> Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+recombinant+human+Kirsten-ras+(4B)+p21+produced+at+high+levels+in+Escherichia+coli+and+insect+baculovirus+expression+systems.">Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).</li><li>Gillette, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Farnesylated+and+Methylated+Proteins+in+an+Engineered+Insect+Cell+System.">Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).</li><li>Agamasu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS+Prenylation+Is+Required+for+Bivalent+Binding+with+Calmodulin+in+a+Nucleotide-Independent+Manner.">KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner.</a> Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).</li><li>Talsania, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Assembly+and+Annotation+of+the+Trichoplusia+ni+Tni-FNL+Insect+Cell+Line+Enabled+by+Long-Read+Technologies.">Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies.</a> Genes. 10 (2), 79 (2019).</li><li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RAS+function+through+targeting+an+allosteric+regulatory+site.">Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site.</a> Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+polyisoprenylated+Ras+proteins+in+the+insect/baculovirus+system.">Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system.</a> Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).</li><li>Dharmaiaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+recognition+of+farnesylated+and+methylated+KRAS4b+by+PDE&#948;.">Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDE&#948;.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).</li><li>Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanism+of+drug/Lipid+membrane+interactions+using+Biacore.">Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore.</a> Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).</li><li>Fisher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interactions+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+with+oligonucleotides.">Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).</li><li>Lakshman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+biophysical+analysis+defines+key+components+modulating+recruitment+of+the+GTPase+KRAS+to+the+plasma+membrane.">Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).</li></ol>

وكما لوحظ في قسم النتائج التمثيلية ، فان الخطوة الأكثر اهميه اثناء التنقية هي التعامل مع العينة خلال الوقت الذي يكون فيه الملح السفلي. الحد من الوقت الذي يتعرض العينة إلى اقل من 200 mM NaCl سوف تساعد في الحد من هطول الامطار وزيادة الغلة عينه. ويمكن ان يكون تفسير نتائج اللجنة الخاصة صعبا إذا كان ?...

التعديلات بعد الانتقالية تلعب دورا رئيسيا في تحديد النشاط الوظيفي للبروتينات. التعديلات مثل فوسفولات و glycosylation راسخة جيدا. ومع ذلك ، فان التعديلات الدهنية اقل تميزا. ويقدر ان ما يصل إلى 0.5 ٪ من جميع البروتينات الخلوية قد يكون قبل الزواج1. [برتيلايشن] النقل من [15-كربون] [فرنيسيل] أو [20-كربون] جيرانيلجيرانيل دهن سلسله إلى [اكتور] بروتين يحتوي ال [كاكس] عزر2. وقد تورط البروتينات قبل الزواج في تطور العديد من الامراض البشرية بما في ذلك الشيخوخة المبكرة3, الزهايمر4, العجز القلبي5, تنكس المشيميه6, والسرطان7. الصغيرة GTPases ، HRAS ، NRAS ، و KRAS1، الصفيحات النووية ، والاعمال الروتينية cenp-E و F هي البروتينات farnesylated تحت الشرط القاعدي. GTPases الصغيرة الأخرى ، وهي الروا ، RhoC ، Rac1 ، cdc-42 ، و RRAS geranylgeranylated8، في حين يمكن ان يكون الموقد farnesylated أو geranylgeranylated9.
الصغيرة GTPase KRAS4b يعمل كمفتاح الجزيئية ، ونقل أساسا عامل النمو خارج الخلية يشير إلى مسارات محول الاشاره داخل الخلايا التي تحفز نمو الخلايا والانتشار ، عن طريق التفاعلات بروتين البروتين متعددة. هناك نوعان من الجوانب الرئيسية لKRAS4b الكيمياء الحيوية التي هي ضرورية لنشاطها. أولا ، دورات البروتين بين الناتج المحلي الإجمالي غير النشط والدولة النشطة GTP ملزمه حيث يتفاعل بنشاط مع المستجيبين. الثانية ، وهو C-المحطة الطرفية بولي يسين المنطقة وسيستين فارنيسلاتيد وكربوكسيميثياتيد مباشره البروتين إلى غشاء البلازما ، وتمكين التوظيف وتفعيل المستجيبين المصب. متحولة KRAS4b هو سائق اونكوغينيك في البنكرياس, القولون والمستقيم, وسرطان الرئة10, وعلي هذا النحو, التدخل العلاجي سيكون لها فائده سريريه ضخمه. إنتاج البروتين المؤتلف المعدل بشكل أصلي والذي هو farnesylated و كربوكسيميثليتيد من شانه تمكين الفحص البيوكيميائية باستخدام KRAS4b في تركيبه مع البدائل غشاء مثل الدهنية أو الدهون نانوديسك11،12.
فرينسريل ترانسفيتاز (FNT) يحفز أضافه بيروفوسفات فارنيسيل إلى C-الطرفية السيستين في عزر CAAX في KRAS4b. بعد الزواج ، يتم الاتجار بالبروتين إلى الشبكية الاندوبلازميه (ER) حيث يلتصق انزيم راس التحويل (RCE1) بالبقايا الثلاثة للمحطة C. الخطوة الاخيره في معالجه هو ميثيل من الجديدة ج-الطرفية farnesylcysteine بقايا من البروتين الغشاء ER ، ايزوريزيلسيستين ميثيل ترانسفيرتاز (ICMT). التعبير عن KRAS4b المؤتلف في e. القولونية النتائج في إنتاج بروتين غير معدله. وكانت المحاولات السابقة لإنتاج الKRAS4b المجهزة محدوده بسبب عدم كفاية الغلة لتجارب الفحص الهيكلي أو الدوائي أو فشلت في تلخيص البروتين الناضج الأصلي الكامل الطول13,14. البروتوكول المعروض هنا يستخدم نظام التعبير خليه الحشرات المستندة إلى الفيروسات التي تعتمد علي البكتيريا وطريقه تنقيه التي تولد تنقيه عاليه ، ومعالجتها بالبالكامل KRAS4b في غله من 5 ملغ/لتر من ثقافة الخلية.
وصف البروتين الدقيق ضروري للتحقق من جوده البروتينات المؤتلف قبل الشروع في البيولوجيا الانشائيه أو دراسات فحص المخدرات. اثنين من المعلمات الرئيسية للمعالجة بالبالكامل KRAS4b هي التحقق من التعديل الصحيح قبل الزواج وتوافر فارنيسلاتيد و الكربوكسيميثيلتيد C-المحطة (FMe) للتفاعل مع بدائل الغشاء أو الدهون. وقد استخدم مقياس الطيف الكتلي للتاين بالكهرباء (ESI-MS) لKRAS4b لقياس الوزن الجزيئي والتاكد من وجود التعديلات التي أدخلت علي فارنيسيل وكربوكسيل الميثيل. واستخدم قياس الطيف الكتلي الأصلي ، حيث يتم رش العينات بالمذيبات غير المستخدمة ، لإثبات ان KRAS4b كانت ملزمه أيضا بالعامل المساعد للناتج المحلي الإجمالي. وأخيرا ، تم استخدام الطيفية صدي البلازما السطحية لقياس الربط المباشر لل KRAS4b مع الدهنيات المعبئة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>30211SS-1232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>850457</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>840034</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5427R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A998-1 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09689-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>ARUP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate 384</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore T200 Instrument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Snap-It Seals, T/S</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-54B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonic Bath</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-336-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation Exchange Chromatography (CEX) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018183</td>
			<td>HiPrep SP Sepharose High Performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyna Pro Plate Reader</td>
			<td>Wyatt Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exactive Plus EMR Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0507-500Ml</td>
			<td>Use Reagent Grade or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson vials 7x14 mm Tubes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass screw thread vials with PTFE foam liners</td>
			<td>Scientific Specialities</td>
			<td>B69302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed/benchtop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>05-112-114D</td>
			<td>capable of up to 4,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>92414</td>
			<td>Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9365-51</td>
			<td>HisPrep FF 16/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-House Water Supply, Arium Advance</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td></td>
			<td>Resistivity of 18 M&#937;0-cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid extruder set with holder</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI-DEWAR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M110-EH microfluidizer</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 &#197;, 2.1 x 150 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagTran software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC Grade</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>BDH20864.400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>78880002</td>
			<td>NGC QuestTM 100 Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Caps type 3</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series S Sensor Chip L1</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29104993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>13-400-519</td>
			<td>Absorbace at 280nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>PES membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima - L80K</td>
			<td>capable of 100,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733-1L</td>
			<td>May use in-house water source (see below)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter</td>
			<td>GE Healthcare - Whatman</td>
			<td>6994-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur QualBrowser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>proteomics software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein

البروتين قبل الزواج هو تعديل المفتاح الذي هو المسؤول عن استهداف البروتينات لاغشيه داخل الخلايا. KRAS4b, الذي تحور في 22% من السرطانات البشرية, يتم معالجتها من قبل farnesylation و كربوكسيميثييون بسبب وجود ' CAAX ' عزر مربع في C-المحطة. تم استخدام نظام الفيروسات التي تمت هندستها للتعبير عن KRAS4b في خلايا الحشرات وتم وصفه سابقا. هنا ، ونحن وصف مفصله وعمليه تنقيه وتوصيف البيوكيميائية للبروتين. وعلي وجه التحديد ، استخدمت التقارب واللوني تبادل الأيونات لتنقيه البروتين إلى التجانس. واستخدم قياس الطيف الكتلي السليم والأصلي للتحقق من صحة التعديل الصحيح لKRAS4b وللتحقق من ربط النيوكليوتيد. وأخيرا ، تم قياس جمعيه غشاء من farnesylated و KRAS4b الكربوكسيميثيد إلى الجسيمات الشحمية باستخدام البلازما الطيفية الرنين السطحي.

واحد من أكبر المتغيرات في البروتوكول هو كميه البروتين المستهدف المعرب عنه (His6-KRAS4b). تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام عزل من خط Trichoplusia ni الخلية ، قوات التحرير الاندونيسي17، تكييفها لنمو التعليق والمشتكي من المصل. ونظرا لطائفه واسعه من النتائج المبلغ عنها عبر مختلف خطوط الخ...

Watch this Scientific Journal Video about Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein at JoVE.com

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

[برتيلايشن] تعديل مهمة علي طرفيه غشاء يربط بروتينات. يمكن التلاعب بخلايا الحشرات لإنتاج KRAS4b بكميات من البروتينات والبروتينات والدهون البروتينية والتي تمكن من القياسات البيوفيزيائية.

KRAS4b المؤتلف المجهزة بالبالكامل: عزل وتوصيف البروتين فارنيسلاتيد وميثيل

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

بروتوكول لدينا يسمح لعزل وفصل KRAS المجهزة بشكل صحيح في العائد العالي. إنتاج رقة فرقة أصيلة وcarboxymethylated يجعل من الممكن إجراء التجارب التي لديها KRAS في غشاء تماما كما هو الحال في خلايا الثدييات. ارتفاع العائد من البروتوكول يميزه عن العمل السابق.نحن عادة تنقية ثلاثة إلى خمسة ملليغرام من البروتين لكل لتر من مواد التعبير. وهذا يسمح لنا بإجراء مجموعة متنوعة من التجارب البيولوجية الفيزيائية والهيكلية. تحور KRAS في 20٪ من السرطانات و 90٪ في سرطان البنكرياس.لذا فإن وجود بروتوكول لإنتاج بروتين مُعالج بشكل أصلي مفيد جدًا لتطوير شاشات الأدوية بحيث يمكنك دراسة البروتين الفعلي كما سيكون على غشاء الخلايا السرطانية. هذا البروتوكول هو أيضا مفيدة جدا لدراسة البروتينات الأخرى التي هي فارينيلات ومعالجتها بشكل كامل في الخلايا. وعلى هذا النحو، كل ما عليك القيام به هو مبادلة خارج KRAS مع البروتين من الفائدة ووضعها في فيروس الباكولو.الخطوات الحاسمة هي تلك حول تبادل اللونية الموجبة. استخدام العمود السليم والحد من الوقت البروتين هو في انخفاض العازلة الملح ضرورية للنجاح. فهم أن هطول الأمطار ليست نوع من العالم الثلجي الحدث يساعد على توجيه تلك الجديدة إلى البروتوكول.يتم تعزيز هذا بإظهار الحاجة إلى تقسيم تحميل عمود تبادل الموجبة إلى عدة أحمال أصغر. بعد lysing الخلايا، وتوضيح lysate، وتنقية البروتين الهدف من قبل IMAC، وتحليل كسور البروتين باستخدام صفحة SDS وتلطيخ Coomassie. تجمع الكسور الذروة وs dialyze تجمع بين عشية وضحاها ضد اثنين من لترات من العازلة D في أربع درجات مئوية.في اليوم التالي، قم بإزالة العينة من غسيل الكلى والطرد المركزي عند 4,000 مرة ز لمدة 10 دقائق لإزالة أي ترسب. العينة النهائية التي تم توضيحها و اضحة غالبا ما تكون ضبابية ولكن يمكن تطبيقها على العمود CEX دون مزيد من المعالجة. إعداد 20 ملليلتر تبادل العمود عن طريق غسله مع ثلاثة مجلدات العمود من العازلة G، ثم مع ثلاثة مجلدات العمود من F.Next العازلة، وتمييع 20 ملليلتر من عينة dialyzed إلى تركيز كلوريد الصوديوم النهائي من 100 ملليمولار عن طريق إضافة 20 ملليلتر من المخزن E وتطبيق العينة على عمود تبادل.ومن الأهمية بمكان للتخفيف من كمية صغيرة من العينة بدلا من جميع مرة واحدة، وينبغي تطبيق العينات المخففة على العمود مباشرة بعد التخفيف للحد من هطول للبروتين. استمر في تحميل العمود مع عينة مخففة حديثاً حيث يقترب التخفيف السابق من نهاية الحمل. ثم غسل العمود إلى امتصاص خط الأساس 280 مع العازلة F التي تتطلب عادة وحدات التخزين ثلاثة أعمدة.Elute البروتين من العمود مع التدرج 400 ملليلتر من العازلة F إلى 65٪ العازلة G، وجمع eluent في ستة كسور ملليلتر. بمجرد اكتمال التدرج ، استمر في غسل العمود للحصول على وحدات تخزين أعمدة إضافية 1.5 من 65٪ من العازلة G.Choose الكسور الإيجابية استنادًا إلى كل من صفحة SDS وتحليل البقع الزرقاء Coomassie وكذلك فحص أثر الأشعة فوق البنفسجية للكروماتوغرام. ثم قم بتجميع البروتين وهضمه مع Protease His6 TEV وفقًا لاتجاهات المخطوطات.بعد الهضم وغسيل الكلى، قم بتحميل البروتين على عمود IMAC 20 ملليلتر مع المخزن المؤقت A عند ثلاثة ملليلتر في الدقيقة. جمع سبعة كسور ملليلتر خلال هذا الكروماتوغرافيا وغسل العمود مع ما مجموعه ثلاثة مجلدات العمود من العازلة A أو حتى يتم الوصول إلى امتصاص خط الأساس. Elute البروتين الهدف مع خمسة تدرج حجم العمود من المخزن المؤقت C من 0٪ إلى 10٪، وجمع سبعة كسور ملليلتر.ثم تحديد الكسور الموجبة مع صفحة SDS. عند تحليلها مع صفحة SDS ، يجب أن تحتوي على شريط داكن يهاجر إلى حوالي 65 كيلودالتون الذي يتوافق مع بروتين الانصهار His6-MBP-tev-KRAS4b. ويهاجر الاتحاد المشترك بين البلدان وشركة FNTAb إلى 48 كيلودالطن.خطوة CEX ضمن تنقية أمر بالغ الأهمية لأنه يقلل من مدى تحلل البروتي وإثراء البروتين المجهزة بالكامل، ولكن هو الجزء الأكثر تعقيدا من البروتوكول. نتيجة نموذجية من هذه الخطوة لها ثلاثة الذروة البارزة مع KRAS4b-FMe ولكن يمكن أن تكون ملفات تعريف elution متغير. تحليل الكتلة سليمة باستخدام ESIMS تأكيد الكتلة الجزيئية الدقيقة للبروتينات، وبالتالي نسبة النسبية من farnesylation أو carboxymethylation.في حين أن القرعة النهائية النموذجية تحتوي على بعض KRAS4b-FARN القابلة للكشف ، كانت هذه النسبة أقل من 15٪ من حيث ذروة الارتفاع من هذا التحليل. تم استخدام التحليل الشامل الأصلي لتحديد كتلة KRAS4b المرتبطة الناتج المحلي الإجمالي. تم استبدال المذيبات العينة خلات الأمونيوم لضمان ليونة التأين مما يسمح للمجمع الأصلي بالبقاء سليمة.تم قياس التفاعل بين KRAS4b-FMe والليبوسومات مع الرنين البلازمون السطحي للتحقق من الفرقينيلية وcarboxymethylation مطلوبة لـ KRAS4b-FMe للارتباط بالأغشية. كما هو متوقع، KRAS4b-FMe ملزمة liposomes بينما لم تتم معالجة KRAS4b. تقليل الوقت الذي يتعرض فيه البروتين لملح منخفض هو الجانب الأكثر أهمية من البروتوكول الذي يؤثر على العائد.البروتين هو فقط لفترة وجيزة في هذا تركيز الملح المنخفض بعد التخفيف في العازلة E.The البروتين يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التجارب الفيزيائية الحيوية التي تستخدم المحاكاة الغشاء مثل liposomes أو نانوديسك للتحقيق في الدهون التي تتفاعل مع KRAS. باستخدام هذه البيانات، يمكننا البدء في استقراء كيفية تفاعل KRAS مع غشاء البلازما للخلية. باستخدام تنقية KRAS-FMe، كان زملاؤنا قادرين على حل هيكل الكريستال الأشعة السينية من KRAS في مجمع مع مرافق محدد لشكل من هذا البروتين farnesylated والميثيل.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

إعداد وتسليم Microcrystals البروتين في المرحلة مكعب شحمي عن المسلسل الفيمتو ثانية البلورات

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

دراسة الجمعية proteasome ومع المؤتلف Archaeal جسيم بروتيني وNondenaturing الصفحة: حالة لنهج موحد

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

تعبير البروتين المؤتلف، التبلور، والدراسات البيوفيزيائية ل<em&gt; العصوية</em&gt; -conserved النيوكليوتيد بيروفوسفوريلاس، بكمازغ

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 في 1: انجذاب تطهير لتحليل مواز للبروتين-بروتين والبروتين-المستقلب المجمعات من خطوة واحدة

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

توصيف مستقلة تماما وجمع البيانات من بلورات جزيئات البيولوجية

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

التبادل الأيوني اللوني (المستوى) بالإضافة إلى تشتت الضوء زاوية المتعددة (مالس) لفصل البروتين وتوصيف

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

وصف مجاميع البروتين الفردية عن طريق الفحص النانوي بالأشعة تحت الحمراء والفحص المجهري للقوة الذرية

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...