Name: fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein
Uploaded: 2020-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein at JoVE.com

Vi anerkender kloning og ekspression støtte fra Carissa Grose, Jen Melhalko, og Matt Drew i protein ekspression laboratorium, Frederick nationale laboratorium for kræftforskning. Dette projekt er blevet finansieret helt eller delvist med føderale midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, under kontrakt nr. HHSN261200800001E. Indholdet af denne publikation ikke nødvendigvis afspejler de synspunkter eller politikker af Department of Health and Human Services, heller ikke nævner handelsnavne, kommercielle produkter, eller organisationer indebærer godkendelse af den amerikanske regering

1. protein rensning
<ol><li>Forbered buffere A – H, som vist i tabel 1.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Buffer løsning</td>
			<td>Buffering agent (alle 20 mM)</td>
			<td>
pH
</td>
			<td>NaCl (mM)</td>
			<td>imidazol (mM)</td>
			<td>MgCl2</td>
			<td>
TCEP</st...

<ol>
	<li>Cox, A. D., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation:+more+than+just+glue.">Protein prenylation: more than just glue.</a> Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).</li><li>Zhang, F. L., Casey, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Prenylation:+Molecular+Mechanisms+and+Functional+Consequences.">Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).</li><li>Hottman, D. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation+and+synaptic+plasticity:+implications+for+Alzheimer's+disease.">Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease.</a> Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).</li><li>Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+and+cognition+in+neurodegenerative+disorders.">HDL and cognition in neurodegenerative disorders.</a> Neurobiology of Disease. 72, 22-36 (2014).</li><li>Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pleiotropic+effect+of+statins:+prevention+of+cardiac+hypertrophy+by+cholesterol-independent+mechanisms.">A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms.</a> Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).</li><li>Kohnke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPase+prenylation+hierarchy+and+its+potential+role+in+choroideremia+disease.">Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease.</a> PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).</li><li>Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+prenylation+for+cancer+therapy.">Targeting protein prenylation for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).</li><li>Kho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tagging-via-substrate+technology+for+detection+and+proteomics+of+farnesylated+proteins.">A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).</li><li>Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAAX+geranylgeranyl+transferase+transfers+farnesyl+as+efficiently+as+geranylgeranyl+to+RhoB.">CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).</li><li>Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dragging+ras+back+in+the+ring.">Dragging ras back in the ring.</a> Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+in+Membrane+Biochemistry+and+Biophysics.">Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics.</a> Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).</li><li>Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Step-by-step+Method+for+the+Reconstitution+of+an+ABC+Transporter+into+Nanodisc+Lipid+Particles.">A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).</li><li>Dementiev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-Ras4B+lipoprotein+synthesis:+biochemical+characterization,+functional+properties,+and+dimer+formation.">K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation.</a> Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+recombinant+human+Kirsten-ras+(4B)+p21+produced+at+high+levels+in+Escherichia+coli+and+insect+baculovirus+expression+systems.">Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).</li><li>Gillette, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Farnesylated+and+Methylated+Proteins+in+an+Engineered+Insect+Cell+System.">Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).</li><li>Agamasu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS+Prenylation+Is+Required+for+Bivalent+Binding+with+Calmodulin+in+a+Nucleotide-Independent+Manner.">KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner.</a> Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).</li><li>Talsania, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Assembly+and+Annotation+of+the+Trichoplusia+ni+Tni-FNL+Insect+Cell+Line+Enabled+by+Long-Read+Technologies.">Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies.</a> Genes. 10 (2), 79 (2019).</li><li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RAS+function+through+targeting+an+allosteric+regulatory+site.">Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site.</a> Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+polyisoprenylated+Ras+proteins+in+the+insect/baculovirus+system.">Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system.</a> Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).</li><li>Dharmaiaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+recognition+of+farnesylated+and+methylated+KRAS4b+by+PDE&#948;.">Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDE&#948;.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).</li><li>Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanism+of+drug/Lipid+membrane+interactions+using+Biacore.">Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore.</a> Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).</li><li>Fisher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interactions+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+with+oligonucleotides.">Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).</li><li>Lakshman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+biophysical+analysis+defines+key+components+modulating+recruitment+of+the+GTPase+KRAS+to+the+plasma+membrane.">Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).</li></ol>

Som nævnt i afsnittet om repræsentative resultater er det mest kritiske trin i rensningen håndteringen af prøven i den tid, det er i lavere salt. Begrænse den tid, at prøven er udsat for mindre end 200 mM NaCl vil bidrage til at reducere nedbør og øge prøve udbyttet. Det kan være vanskeligt at fortolke resultaterne af CEX, hvis profilen ikke svarer til forventningerne (Se figur 2). Indtil protokollen er blevet rutine, tilrådes det, at CEX elueringsfraktioner, der ikke videreføres...

Posttranslationelle modifikationer spiller en central rolle i definitionen af proteiners funktionelle aktivitet. Ændringer såsom fosforylering og glykosylering er veletablerede. Lipid modifikationer er mindre velkarakteriseret, dog. Det anslås, at så meget som 0,5% af alle cellulære proteiner kan være prenylated1. Prenylation er overførslen af en 15-Carbon at eller en 20-Carbon geranylgeranyl lipid kæde til en acceptor protein, der indeholder caax Motif2. Prenylated proteiner har været impliceret i progression af flere menneskelige sygdomme, herunder for tidlig aldring3, Alzheimers4, kardiel dysfunktion5, choroideremia6, og kræft7. De små GTPases, HRAS, NTM og KRAS1, nukleare lamininer og kinetochores cenp-E og F er farnesylerede proteiner under basal tilstand. Andre små GTPases, nemlig RhoA, RhoC, Rac1, CDC-42, og RRAS er geranylgeranylated8, hvorimod rhob kan være farnesylated eller geranylgeranylated9.
Den lille GTPase KRAS4b fungerer som en molekylær switch, hovedsagelig sender ekstracellulære vækstfaktor signalering til intracellulære signal transduktionsveje, der stimulerer cellevækst og spredning, via flere protein-protein interaktioner. Der er to centrale aspekter af KRAS4b biokemi, der er afgørende for dens aktivitet. For det første er protein cyklusserne mellem et inaktivt BNP og en aktiv GTP-bundet tilstand, hvorved det aktivt engagerer sig i effektorer. For det andet dirigere en C-terminale poly-lysin-region og en farnesyleret og carboxymethyleret cystein direkte proteinet til plasma membranen, hvilket muliggør rekruttering og aktivering af downstream-effektorer. Mutant KRAS4b er en onkogene driver i bugspytkirtlen, kolorektal, og lungekræft10, og som sådan, terapeutisk intervention ville have en enorm klinisk fordel. Fremstilling af autentisk modificeret rekombinant protein, der er farnesyleret og carboxymethyleret, vil muliggøre biokemisk screening ved hjælp af KRAS4b i kombination med membran surrogater såsom Liposomer eller lipid nanodiske11,12.
Farnesyltransferase (FNT) katalyserer tilsætning af at-pyrophosphat til C-terminalens cystein i caax-motivet i KRAS4b. Efter prenylering handles proteinet til endoplasmatiske reticulum (er), hvor RAS-konverterende enzym (RCE1) kløver de tre C-terminale rester. Det sidste trin i forarbejdningen er methylering af den nye C-Terminal farnesylcystein rest af ER membran protein, isoprenylcystein carboxylgrupper methyltransferase (ICMT). Udtryk for rekombinant KRAS4b i E. coli resulterer i produktion af et umodificeret protein. Tidligere forsøg på at producere forarbejdede KRAS4b har været begrænset på grund af utilstrækkelige udbytter for strukturelle eller Drug screening forsøg eller har undladt at rekapitulere den indfødte fuld længde modne protein13,14. Protokollen præsenteres her udnytter en manipuleret baculovirus-baserede insekt celle ekspressionssystem og rensning metode, der genererer højt renset, fuldt forarbejdet KRAS4b på udbytter af 5 mg/L cellekultur.
Omhyggelig protein karakterisering er afgørende for at validere kvaliteten af rekombinante proteiner forud for påbegyndelse af strukturel biologi eller Drug screening undersøgelser. To nøgleparametre for fuldt forarbejdet KRAS4b er validering af den korrekte prenyl modifikation og tilgængeligheden af farnesylated og carboxymethylated C-Terminus (FMe) for interaktion med membran erstatninger eller lipider. Elektro spray ioniserings massespektrometri (ESI-MS) af KRAS4b-FME blev anvendt til at måle molekylvægten og bekræfte tilstedeværelsen af at-og natriumcarboxymethylcellulose-modifikationer. Native massespektrometri, hvor prøverne sprøjtes med ikke-denatureringsmidler, blev brugt til at påvise, at KRAS4b-FMe også var bundet til sin BNP-cofactor. Endelig blev overflade Plasmon resonansspektroskopi anvendt til at måle den direkte binding af KRAS4b-FMe med immobiliserede Liposomer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>30211SS-1232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>850457</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>840034</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5427R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A998-1 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09689-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>ARUP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate 384</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore T200 Instrument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Snap-It Seals, T/S</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-54B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonic Bath</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-336-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation Exchange Chromatography (CEX) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018183</td>
			<td>HiPrep SP Sepharose High Performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyna Pro Plate Reader</td>
			<td>Wyatt Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exactive Plus EMR Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0507-500Ml</td>
			<td>Use Reagent Grade or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson vials 7x14 mm Tubes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass screw thread vials with PTFE foam liners</td>
			<td>Scientific Specialities</td>
			<td>B69302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed/benchtop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>05-112-114D</td>
			<td>capable of up to 4,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>92414</td>
			<td>Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9365-51</td>
			<td>HisPrep FF 16/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-House Water Supply, Arium Advance</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td></td>
			<td>Resistivity of 18 M&#937;0-cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid extruder set with holder</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI-DEWAR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M110-EH microfluidizer</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 &#197;, 2.1 x 150 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagTran software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC Grade</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>BDH20864.400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>78880002</td>
			<td>NGC QuestTM 100 Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Caps type 3</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series S Sensor Chip L1</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29104993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>13-400-519</td>
			<td>Absorbace at 280nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>PES membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima - L80K</td>
			<td>capable of 100,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733-1L</td>
			<td>May use in-house water source (see below)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter</td>
			<td>GE Healthcare - Whatman</td>
			<td>6994-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur QualBrowser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>proteomics software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein

Protein prenylation er en vigtig modifikation, der er ansvarlig for at målrette proteiner til intracellulære membraner. KRAS4b, som er muteret i 22% af de menneskelige kræftformer, behandles ved farnesylering og carboxymethylering på grund af tilstedeværelsen af et ' CAAX ' boks motiv ved C-terminalen. En konstrueret og system blev brugt til at udtrykke farnesylated og carboxymethylated KRAS4b i insekt celler og er blevet beskrevet tidligere. Her beskriver vi den detaljerede, praktiske rensning og biokemiske karakterisering af proteinet. Specifikt, affinitet og ionbytningskromatografi blev brugt til at rense proteinet til homogenitet. Intakt og Native massespektrometri blev anvendt til at validere den korrekte modifikation af KRAS4b og til at verificere nukleotidbinding. Endelig blev membran Association af farnesylated og carboxymethylated KRAS4b til Liposomer målt ved hjælp af overflade Plasmon resonansspektroskopi.

En af de største variabler i protokollen er mængden af udtrykt målprotein (His6-MBP-TEV-KRAS4b). Denne protokol blev udviklet ved hjælp af et isolat fra en Trichoplusia ni -cellelinje, TNI-FNL17, tilpasset til suspension vækst og fravænnet fra serum. I betragtning af den brede vifte af resultater, der rapporteres på tværs af de forskellige insekt cellelinjer med det og ekspressionssystem, tilrådes det, at TNI-FNL i det mindste i første omgang anvendes til fremstillet KRAS4b-FME....

Watch this Scientific Journal Video about Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein at JoVE.com

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Prenylation er en vigtig modifikation på ydre membran bindende proteiner. Insekt celler kan manipuleres til fremstilling af farnesylerede og carboxymethylerede KRAS4b i mængder, der muliggør biofysiske målinger af protein-protein-og protein-lipid-interaktioner

Fuldt forarbejdet rekombinant KRAS4b: isolering og karakterisering af det Farnesylerede og methylerede protein

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Vores protokol giver mulighed for isolering og adskillelse af korrekt behandlet KRAS ved højt udbytte. Produktionen af autentisk farnesyleret og carboxymethyleret KRAS gør det muligt at udføre eksperimenter, der har KRAS i deres membran ligesom i pattedyrceller. Det høje udbytte af protokollen adskiller det fra tidligere arbejde.Vi renser typisk tre til fem milligram protein pr. liter ekspressionsmateriale. Dette giver os mulighed for at udføre en række biofysiske og strukturelle biologi eksperimenter. KRAS er muteret i 20% af kræft og 90% i bugspytkirtlen kræft.Så at have en protokol til at producere autentisk forarbejdet protein er ganske nyttigt for at udvikle narkotika skærme, så du kan studere den faktiske protein, som det ville være på membranen af kræftceller. Denne protokol er også meget nyttig til at studere andre proteiner, der er farnesylated og fuldt forarbejdet i cellerne. Og som sådan, alt hvad du skal gøre er at bytte ud KRAS med protein af interesse og sætte det ind i baculovirus.De kritiske trin er dem omkring kation udveksling kromatografi. Brug af den korrekte kolonne og begrænse den tid, proteinet er i lavt salt buffer er afgørende for succes. Forståelse af, at nedbøren ikke er en snekugle type begivenhed hjælper guide dem nye til protokollen.Dette forstærkes ved at vise behovet for at opdele kationbytterkolonnebelastningen i flere mindre belastninger. Efter lysning celler, afklaring af lysatet, og rense målet protein ved IMAC, analysere proteinfraktioner ved hjælp af SDS side og Coomassie farvning. Pool toppen fraktioner og dialyze puljen natten mod to liter buffer D ved fire grader Celsius.Den næste dag fjernes prøven fra dialyse og centrifugeres ved 4.000 gange g i 10 minutter for at fjerne bundfald. Den endelige dialysede og afklarede prøve er ofte stadig uklar, men kan anvendes på CEX-kolonnen uden yderligere behandling. Der forberedes 20 milliliterkteringskolonne ved at vaske den med tre kolonnevolumener af buffer G. Derefter fortyndes 20 milliliter af den dialyzed prøve til en endelig natriumchloridkoncentration på 100 millimolar ved at tilsætte 20 milliliter buffer E og anvende prøven på udvekslingskolonnen.Det er afgørende at fortynde den lille mængde af prøven i stedet for alle på én gang, og de fortyndede prøver skal påføres kolonnen umiddelbart efter fortyndingen for at begrænse udfældningen af proteinet. Kolonnen med nyfortyndet prøve, efterhånden som den forrige fortynding nærmer sig enden af belastningen. Derefter vaskes kolonnen til baseline absorbans 280 med buffer F, som typisk kræver tre kolonnevolumener.Eluter proteinet fra kolonnen med en 400 milliliter gradient fra buffer F til 65%buffer G, indsamle eluering i seks milliliter fraktioner. Når gradienten er færdig, skal du fortsætte med at vaske kolonnen for yderligere 1,5 kolonnemængder på 65%buffer G.Vælg de positive brøker baseret på både SDS-side og Coomassie Blue pletanalyse samt inspektion af UV-spor af kromatogrammet. Derefter samle protein og fordøje det med His6 TEV protease i henhold til manuskript retninger.Efter fordøjelse og dialyse indlæses proteinet på en 20 milliliter IMAC-kolonne, der er ligevægtet med buffer A, med tre milliliter pr. minut. Der opsaml syv milliliterfraktioner under denne kromatografi, og kolonnen vaskes med i alt tre kolonnevolumener af buffer A, eller indtil baseline absorbansen er nået. Eluter målproteinet med fem kolonnevolumengradient af buffer C fra 0% til 10% og opsaml syv milliliterfraktioner.Identificer derefter de positive brøker med SDS-siden. Når det analyseres med SDS side, bør det afklarede lysat indeholde et mørkt bånd, der migrerer til omkring 65 kilodaltons, hvilket svarer til fusionsproteinet His6-MBP-tev-KRAS4b. Den co-udtrykte FNTAb migrerer til 48 kilodaltons.CEX-trinnet inden for rensningen er kritisk, fordi det reducerer omfanget af proteolyse og beriger det fuldt forarbejdede protein, men er den mest komplicerede del af protokollen. Et typisk resultat fra dette trin har en fremtrædende top tre med KRAS4b-FMe, men elution profiler kan være variabel. Intakt masseanalyse ved hjælp af ESIMS bekræfter proteinets præcise molekylære masse og dermed den relative andel af farnesylation eller carboxymethylering.Mens typiske endelige partier indeholdt nogle påviselige KRAS4b-FARN, denne andel var mindre end 15%i form af peak højde fra denne analyse. Native masse analyse blev brugt til at bestemme massen af KRAS4b bundet til BNP. Prøveopløsningsmidlet blev vekslet til ammoniumacetat for at sikre en blødere ionisering, så det oprindelige kompleks kunne forblive intakt.Samspillet mellem KRAS4b-FMe og liposomer blev målt med overflade plasmon resonans at validere farnesylation og carboxymethylation er nødvendige for KRAS4b-FMe at binde sig til membraner. Som forventet, KRAS4b-FMe bundet til liposomer, mens uforarbejdede KRAS4b ikke. Minimering af den tid, proteinet udsættes for lavt saltindhold, er det mest kritiske aspekt af protokollen, der påvirker udbyttet.Proteinet er kun kortvarigt ved denne lave saltkoncentration efter fortyndingen i bufferen E.Proteinet kan bruges til en række biofysiske eksperimenter, der bruger membranmemetics som liposomer eller nanodiscs til at undersøge, hvilke lipider KRAS interagerer med. Ved hjælp af disse data kan vi begynde at ekstrapolere, hvordan KRAS interagerer med cellens plasmamembran. Ved hjælp af renset KRAS-FMe, vores kolleger var i stand til at løse x-ray krystal struktur KRAS i kompleks med en chaperone, der er specifik for farnesylated og methyleret form af dette protein.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Udarbejdelse og levering af Protein Mikrokrystaller i lipide Cubic fase for Serial Femtosekund Krystallografi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Undersøgelse Proteasome Montering med rekombinant arke Proteasomer og denaturerende SIDE: The Case for en kombineret fremgangsmåde

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Rekombinant Protein Ekspression, Krystallisering og Biofysiske Studier af a<em&gt; Bacillus</em&gt; -konserveret nucleotidpyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: et-trins affinitet rensning for den parallelle analyse af Protein-Protein og Protein-metabolit komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse af proteinfoldning, Transport og nedbrydning i levende celler af radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Fuldt autonome karakterisering og indsamling af Data fra krystaller af biologiske makromolekyler

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Ionbytning kromatografi (IEX) koblet til multi-vinkel lysspredning (MALS) for Protein adskillelse og karakterisering

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakterisering af individuelle protein aggregater ved infrarød Nanospektroskopi og atomkraften mikroskopi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...