Name: fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein
Uploaded: 2020-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein at JoVE.com

Nous reconnaissons le soutien au clonage et à l'expression de Carissa Grose, Jen Melhalko et Matt Drew du Protein Expression Laboratory, Frederick National Laboratory for Cancer Research. Ce projet a été financé en totalité ou en partie par des fonds fédéraux de l'Institut national du cancer, National Institutes of Health, dans le cadre du contrat no. HHSN261200800001E. Le contenu de cette publication ne reflète pas nécessairement les points de vue ou les politiques du ministère de la Santé et des Services sociaux, et la mention des noms commerciaux, des produits commerciaux ou des organisations n'implique pas nécessairement l'approbation par le gouvernement des États-Unis.

1. Purification des protéines
<ol><li>Préparer les tampons A-H, comme on le voit dans le tableau 1.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Solution tampon</td>
			<td>Agent tampon (tous les 20 mM)</td>
			<td>
pH
</td>
			<td>NaCl (mM)</td>
			<td>imidazole (mM)</td>
			<td>MgCl2</td>
			<td>
<st...

<ol>
	<li>Cox, A. D., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation:+more+than+just+glue.">Protein prenylation: more than just glue.</a> Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).</li><li>Zhang, F. L., Casey, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Prenylation:+Molecular+Mechanisms+and+Functional+Consequences.">Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).</li><li>Hottman, D. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation+and+synaptic+plasticity:+implications+for+Alzheimer's+disease.">Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease.</a> Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).</li><li>Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+and+cognition+in+neurodegenerative+disorders.">HDL and cognition in neurodegenerative disorders.</a> Neurobiology of Disease. 72, 22-36 (2014).</li><li>Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pleiotropic+effect+of+statins:+prevention+of+cardiac+hypertrophy+by+cholesterol-independent+mechanisms.">A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms.</a> Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).</li><li>Kohnke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPase+prenylation+hierarchy+and+its+potential+role+in+choroideremia+disease.">Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease.</a> PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).</li><li>Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+prenylation+for+cancer+therapy.">Targeting protein prenylation for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).</li><li>Kho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tagging-via-substrate+technology+for+detection+and+proteomics+of+farnesylated+proteins.">A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).</li><li>Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAAX+geranylgeranyl+transferase+transfers+farnesyl+as+efficiently+as+geranylgeranyl+to+RhoB.">CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).</li><li>Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dragging+ras+back+in+the+ring.">Dragging ras back in the ring.</a> Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+in+Membrane+Biochemistry+and+Biophysics.">Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics.</a> Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).</li><li>Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Step-by-step+Method+for+the+Reconstitution+of+an+ABC+Transporter+into+Nanodisc+Lipid+Particles.">A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).</li><li>Dementiev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-Ras4B+lipoprotein+synthesis:+biochemical+characterization,+functional+properties,+and+dimer+formation.">K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation.</a> Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+recombinant+human+Kirsten-ras+(4B)+p21+produced+at+high+levels+in+Escherichia+coli+and+insect+baculovirus+expression+systems.">Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).</li><li>Gillette, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Farnesylated+and+Methylated+Proteins+in+an+Engineered+Insect+Cell+System.">Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).</li><li>Agamasu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS+Prenylation+Is+Required+for+Bivalent+Binding+with+Calmodulin+in+a+Nucleotide-Independent+Manner.">KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner.</a> Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).</li><li>Talsania, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Assembly+and+Annotation+of+the+Trichoplusia+ni+Tni-FNL+Insect+Cell+Line+Enabled+by+Long-Read+Technologies.">Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies.</a> Genes. 10 (2), 79 (2019).</li><li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RAS+function+through+targeting+an+allosteric+regulatory+site.">Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site.</a> Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+polyisoprenylated+Ras+proteins+in+the+insect/baculovirus+system.">Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system.</a> Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).</li><li>Dharmaiaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+recognition+of+farnesylated+and+methylated+KRAS4b+by+PDE&#948;.">Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDE&#948;.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).</li><li>Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanism+of+drug/Lipid+membrane+interactions+using+Biacore.">Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore.</a> Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).</li><li>Fisher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interactions+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+with+oligonucleotides.">Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).</li><li>Lakshman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+biophysical+analysis+defines+key+components+modulating+recruitment+of+the+GTPase+KRAS+to+the+plasma+membrane.">Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).</li></ol>

Comme indiqué dans la section Résultats représentatifs, l'étape la plus critique pendant la purification est la manipulation de l'échantillon pendant le temps qu'il est dans le sel inférieur. Limiter le temps d'exposition de l'échantillon à moins de 200 mM NaCl contribuera à réduire les précipitations et à augmenter le rendement de l'échantillon. L'interprétation des résultats du CEX peut être difficile si le profil ne correspond pas aux attentes (voir la figure 2). Jusqu'à ...

Les modifications post-traductionnelle jouent un rôle clé dans la définition de l'activité fonctionnelle des protéines. Les modifications telles que la phosphorylation et la glycosylation sont bien établies. Les modifications lipidiques sont moins bien caractérisées, cependant. On estime que jusqu'à 0,5 % de toutes les protéines cellulaires peuvent être prénylées1. La prénylation est le transfert d'un farnesyl de 15 carbone ou d'une chaîne lipidique geranylgeranyl de 20 carbone à une protéine accepteur contenant le motif CAAX2. Les protéines prénylées ont été impliquées dans la progression de plusieurs maladies humaines, y compris le vieillissement prématuré3, Alzheimer4, dysfonction cardiaque5, chorroideremia6, et le cancer7. Les petits GTPases, HRAS, NRAS et KRAS1, les laminins nucléaires, et les kinétochores CENP-E et F sont des protéines farnédylated sous l'état basal. D'autres petits GTPases, à savoir RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42, et RRAS sont geranylgeranylated8, tandis que RhoB peut être farnétatif ou geranylgeranylated9.
Le petit GTPase KRAS4b fonctionne comme un interrupteur moléculaire, transmettant essentiellement le facteur de croissance extracellulaire signalant aux voies intracellulaires de transduction de signal qui stimulent la croissance et la prolifération de cellules, par l'intermédiaire des interactions multiples de protéine-protéine. Il y a deux aspects clés de la biochimie KRAS4b qui sont essentiels à son activité. Tout d'abord, les cycles protéiques entre un PIB inactif et un état lié gtP actif par lequel il s'engage activement avec les effecteurs. Deuxièmement, une région de polylysine C-terminal et une cystéine farnédilate et carboxymethylated dirigent la protéine à la membrane de plasma, permettant le recrutement et l'activation des effecteurs en aval. Mutant KRAS4b est un conducteur oncogène dans le cancer du pancréas, colorectal et du poumon10, et en tant que tel, l'intervention thérapeutique aurait un énorme avantage clinique. La production de protéines recombinantes authentiquement modifiées qui sont farnésylated et carboxymethylated permettrait le criblage biochimique utilisant KRAS4b en combination avec des substituts de membrane tels que des liposomes ou des nanodisques lipidiques11,12.
Farnesyl transferase (FNT) catalyse l'ajout de pyrophosphate de farnesyl à la cystéine C-terminale dans le motif CAAX dans KRAS4b. Après la prénylation, la protéine est trafiquée vers le réticulum endoplasmique (ER) où l'enzyme de conversion Ras (RCE1) fend les trois résidus c-terminaux. La dernière étape dans le traitement est la méthylation du nouveau résidu de farnesylcystéine C-terminal par la protéine de membrane d'ER, isoprenylcysteine carboxyl méthyltransferase (ICMT). L'expression du KRAS4b recombinant dans E. coli entraîne la production d'une protéine non modifiée. Les tentatives précédentes de produire du KRAS4b transformé ont été limitées en raison de rendements insuffisants pour des expériences structurelles ou de dépistage de médicaments ou n'ont pas réussi à récapituler la protéine mature pleine longueur indigène13,14. Le protocole présenté ici utilise un système d'expression et de purification d'insectes à base de baculovirus qui génère un KRAS4b hautement purifié et entièrement traité à des rendements de 5 mg/L de culture cellulaire.
Une caractérisation prudente des protéines est essentielle pour valider la qualité des protéines recombinantes avant de se lancer dans des études de biologie structurelle ou de dépistage des médicaments. Deux paramètres clés du KRAS4b entièrement traité sont la validation de la modification correcte de prenyl et la disponibilité du C-terminus (FMe) farnesylated et carboxymethylated pour l'interaction avec des substituts de membrane ou des lipides. La spectrométrie de masse d'ionisation d'électrospray (ESI-MS) du KRAS4b-FMe a été employée pour mesurer le poids moléculaire et confirmer la présence des modifications de farnesyl et de carboxymethyl. La spectrométrie de masse indigène, où les échantillons sont pulvérisés avec des solvants non dénaturants, a été utilisée pour démontrer que KRAS4b-FMe était également lié à son cofactor de PIB. Enfin, la spectroscopie de résonance de plasmon de surface a été employée pour mesurer la liaison directe de KRAS4b-FMe avec des liposomes immobilisés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>30211SS-1232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>850457</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>840034</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5427R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A998-1 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09689-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>ARUP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate 384</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore T200 Instrument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Snap-It Seals, T/S</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-54B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonic Bath</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-336-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation Exchange Chromatography (CEX) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018183</td>
			<td>HiPrep SP Sepharose High Performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyna Pro Plate Reader</td>
			<td>Wyatt Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exactive Plus EMR Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0507-500Ml</td>
			<td>Use Reagent Grade or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson vials 7x14 mm Tubes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass screw thread vials with PTFE foam liners</td>
			<td>Scientific Specialities</td>
			<td>B69302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed/benchtop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>05-112-114D</td>
			<td>capable of up to 4,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>92414</td>
			<td>Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9365-51</td>
			<td>HisPrep FF 16/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-House Water Supply, Arium Advance</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td></td>
			<td>Resistivity of 18 M&#937;0-cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid extruder set with holder</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI-DEWAR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M110-EH microfluidizer</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 &#197;, 2.1 x 150 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagTran software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC Grade</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>BDH20864.400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>78880002</td>
			<td>NGC QuestTM 100 Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Caps type 3</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series S Sensor Chip L1</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29104993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>13-400-519</td>
			<td>Absorbace at 280nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>PES membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima - L80K</td>
			<td>capable of 100,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733-1L</td>
			<td>May use in-house water source (see below)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter</td>
			<td>GE Healthcare - Whatman</td>
			<td>6994-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur QualBrowser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>proteomics software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein

La prénylation des protéines est une modification clé qui est responsable du ciblage des protéines vers les membranes intracellulaires. KRAS4b, qui est muté dans 22% des cancers humains, est traité par farnesylation et carboxymethylation en raison de la présence d'un motif de boîte 'CAAX' au terminus C. Un système de baculovirus machiné a été employé pour exprimer kraS4b farnésylated et carboxymethylated dans des cellules d'insecte et a été décrit précédemment. Ici, nous décrivons la purification détaillée et pratique et la caractérisation biochimique de la protéine. Plus précisément, l'affinité et la chromatographie d'échange d'ions ont été utilisées pour purifier la protéine à l'homogénéité. La spectrométrie de masse intacte et indigène a été utilisée pour valider la modification correcte de KRAS4b et pour vérifier la liaison nucléotide. Enfin, l'association de membrane de KRAS4b farnesylated et carboxymethylated aux liposomes a été mesurée utilisant la spectroscopie de résonance de plasmon de surface.

L'une des variables les plus importantes du protocole est la quantité de protéines cibles exprimées (His6-MBP-tev-KRAS4b). Ce protocole a été développé à l'aide d'un isolat d'une lignée de cellules Trichoplusia ni, Tni-FNL17, adapté pour la croissance de la suspension et scié à partir de sérum. Étant donné la vaste gamme de résultats rapportés à travers les différentes lignées de cellules d'insectes avec le système d'expression du baculovirus, il est conseillé que Tn...

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Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

La prénylation est une modification importante sur les protéines de liaison de membrane périphérique. Les cellules d'insectes peuvent être manipulées pour produire des KRAS4b farnédées et carboxyméthylées en quantités qui permettent des mesures biophysiques des interactions protéines-protéines et protéines-lipides

KRAS4b recombinant entièrement transformé : Isoler et caractériser les protéines farnestées et méthylées

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Notre protocole permet l’isolement et la séparation des KRAS correctement traités à haut rendement. La production de KRAS authentiquement farnesylated et carboxyméthylated permet d’effectuer des expériences qui ont KRAS dans leur membrane tout comme dans les cellules mammifères. Le rendement élevé du protocole le distingue des travaux antérieurs.Nous purifions généralement trois à cinq milligrammes de protéines par litre de matériau d’expression. Cela nous permet de mener une variété d’expériences biophysiques et de biologie structurale. Kras est muté dans 20% des cancers et 90% dans les cancers du pancréas.Donc, avoir un protocole pour produire des protéines authentiquement traitées est très utile pour développer des écrans de médicaments afin que vous puissiez étudier la protéine réelle comme il serait sur la membrane des cellules cancéreuses. Ce protocole est également très utile pour étudier d’autres protéines qui sont farnylées et entièrement traitées dans les cellules. Et en tant que tel, tout ce que vous devez faire est d’échanger le KRAS avec la protéine d’intérêt et de le mettre dans le baculovirus.Les étapes critiques sont celles autour de la chromatographie d’échange de cation. L’utilisation de la colonne appropriée et la limitation du temps de la protéine est dans le tampon de sel faible sont essentiels pour le succès. Comprendre que les précipitations ne sont pas un type d’événement globe de neige aide à guider ceux qui sont nouveaux dans le protocole.Ceci est renforcé en montrant la nécessité de diviser la charge de colonne d’échange de cation en plusieurs charges plus petites. Après avoir lysé les cellules, clarifié le lysate et purifié la protéine cible par l’IMAC, analyser les fractions protéiques à l’aide de la page SDS et de la coloration Coomassie. Mettre en commun les fractions de pointe et dialyser la piscine pendant la nuit contre deux litres de tampon D à quatre degrés Celsius.Le lendemain, retirez l’échantillon de la dialyse et centrifugez-le à 4000 fois g pendant 10 minutes pour enlever tout précipité. L’échantillon final dialysé et clarifié est souvent encore flou, mais peut être appliqué à la colonne CEX sans autre traitement. Préparez une colonne d’échange de cation de 20 millilitres en la lavant avec trois volumes de colonne de G tampon, puis avec trois volumes de colonne de tampon F.Next, diluez 20 millilitres de l’échantillon dialysé à une concentration finale de chlorure de sodium de 100 millimolaires en ajoutant 20 millilitres de tampon E et appliquez l’échantillon sur la colonne d’échange.Il est essentiel de diluer la petite quantité de l’échantillon au lieu de tout à la fois et les échantillons dilués doivent être appliqués à la colonne immédiatement après la dilution pour limiter les précipitations de la protéine. Continuez à charger la colonne avec de l’échantillon fraîchement dilué à mesure que la dilution précédente approche de la fin de la charge. Lavez ensuite la colonne à l’absorption de base 280 avec le tampon F qui nécessite généralement trois volumes de colonnes.Elute la protéine de la colonne avec un gradient de 400 millilitres de la zone tampon F à 65% tampon G, la collecte de l’élitiste en six fractions millilitres. Une fois le gradient terminé, continuer à laver la colonne pour un volume supplémentaire de 1,5 colonne de 65% tampon G.Choisissez les fractions positives basées à la fois sur la page SDS et coomassie blue analyse des taches ainsi que l’inspection de la trace UV du chromatogramme. Puis mettre en commun la protéine et la digérer avec la protéase His6 TEV selon les directives manuscrites.Après digestion et dialyse, chargez la protéine sur une colonne IMAC de 20 millilitres équilibrée avec le tampon A à trois millilitres par minute. Recueillir sept fractions millilitres au cours de cette chromatographie et laver la colonne avec un total de trois volumes de colonne de tampon A ou jusqu’à ce que l’absorption de base soit atteinte. Elute la protéine cible avec un gradient de volume de cinq colonnes de C tampon de 0% à 10% et de recueillir sept fractions millilitres.Identifiez ensuite les fractions positives avec la page SDS. Lorsqu’il est analysé avec la page SDS, le lysate clarifié doit contenir une bande sombre qui migre vers environ 65 kilodaltons qui correspond à la protéine de fusion His6-MBP-tev-KRAS4b. Le FNTAb co-exprimé migre vers 48 kilodaltons.L’étape CEX dans la purification est essentielle parce qu’elle réduit l’étendue de la protéolyse et enrichit la protéine entièrement traitée, mais est la partie la plus compliquée du protocole. Un résultat typique de cette étape a un pic proéminent trois avec le KRAS4b-FMe, mais les profils d’élitution peuvent être variables. L’analyse de masse intacte à l’aide de l’ESIMS confirme la masse moléculaire précise des protéines et donc la proportion relative de farnesylation ou de carboxyméthylation.Bien que les lots finaux typiques contenaient certains KRAS4b-FARN détectables, cette proportion était inférieure à 15 % en termes de hauteur maximale à partir de cette analyse. L’analyse de masse indigène a été utilisée pour déterminer la masse du KRAS4b lié au PIB. Le solvant d’échantillon a été échangé contre de l’acétate d’ammonium pour assurer une ionisation plus douce permettant au complexe indigène de rester intact.L’interaction de KRAS4b-FMe et liposomes a été mesurée avec la résonance plasmon de surface pour valider la farnesylation et la carboxyméthylation sont nécessaires pour KRAS4b-FMe de se lier aux membranes. Comme prévu, KRAS4b-FMe lié aux liposomes tandis que KRAS4b non transformé n’a pas. Réduire au minimum le temps d’exposition de la protéine à un faible teneur en sel est l’aspect le plus critique du protocole qui affecte le rendement.La protéine n’est que brièvement à cette faible concentration de sel après la dilution dans le tampon E.La protéine peut être utilisée pour une variété d’expériences biophysiques qui utilisent des mimétiques membranaires comme les liposomes ou les nanodiscs pour étudier quels lipides KRAS interagit avec. En utilisant ces données, nous pouvons commencer à extrapoler comment KRAS interagit avec la membrane plasmatique de la cellule. En utilisant kras-FMe purifié, nos collègues ont été en mesure de résoudre la structure cristalline aux rayons X de KRAS dans le complexe avec un chaperon qui est spécifique pour la forme farnétique et méthylé de cette protéine.

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