Name: fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein
Uploaded: 2020-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein at JoVE.com

Wir würdigen die Unterstützung des Klonens und der Ausdruckshilfe von Carissa Grose, Jen Melhalko und Matt Drew im Protein Expression Laboratory, Frederick National Laboratory for Cancer Research. Dieses Projekt wurde ganz oder teilweise mit Bundesmitteln des National Cancer Institute, National Institutes of Health, im Rahmen des Vertrags Nr. HHSN261200800001E. Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des Department of Health and Human Services wider, noch impliziert die Erwähnung von Handelsnamen, kommerziellen Produkten oder Organisationen eine Billigung durch die US-Regierung.

1. Proteinreinigung
<ol><li>Vorbereiten der Puffer A–H, wie in Tabelle 1zu sehen ist.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Pufferlösung</td>
			<td>Puffer-Agent (alle 20 mM)</td>
			<td>
pH
</td>
			<td>NaCl (mM)</td>
			<td>Imidazol (mM)</td>
			<td>MgCl2</td>
			<td>
TCE<str...

<ol>
	<li>Cox, A. D., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation:+more+than+just+glue.">Protein prenylation: more than just glue.</a> Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).</li><li>Zhang, F. L., Casey, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Prenylation:+Molecular+Mechanisms+and+Functional+Consequences.">Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).</li><li>Hottman, D. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation+and+synaptic+plasticity:+implications+for+Alzheimer's+disease.">Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease.</a> Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).</li><li>Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+and+cognition+in+neurodegenerative+disorders.">HDL and cognition in neurodegenerative disorders.</a> Neurobiology of Disease. 72, 22-36 (2014).</li><li>Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pleiotropic+effect+of+statins:+prevention+of+cardiac+hypertrophy+by+cholesterol-independent+mechanisms.">A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms.</a> Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).</li><li>Kohnke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPase+prenylation+hierarchy+and+its+potential+role+in+choroideremia+disease.">Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease.</a> PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).</li><li>Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+prenylation+for+cancer+therapy.">Targeting protein prenylation for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).</li><li>Kho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tagging-via-substrate+technology+for+detection+and+proteomics+of+farnesylated+proteins.">A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).</li><li>Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAAX+geranylgeranyl+transferase+transfers+farnesyl+as+efficiently+as+geranylgeranyl+to+RhoB.">CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).</li><li>Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dragging+ras+back+in+the+ring.">Dragging ras back in the ring.</a> Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+in+Membrane+Biochemistry+and+Biophysics.">Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics.</a> Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).</li><li>Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Step-by-step+Method+for+the+Reconstitution+of+an+ABC+Transporter+into+Nanodisc+Lipid+Particles.">A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).</li><li>Dementiev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-Ras4B+lipoprotein+synthesis:+biochemical+characterization,+functional+properties,+and+dimer+formation.">K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation.</a> Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+recombinant+human+Kirsten-ras+(4B)+p21+produced+at+high+levels+in+Escherichia+coli+and+insect+baculovirus+expression+systems.">Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).</li><li>Gillette, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Farnesylated+and+Methylated+Proteins+in+an+Engineered+Insect+Cell+System.">Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).</li><li>Agamasu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS+Prenylation+Is+Required+for+Bivalent+Binding+with+Calmodulin+in+a+Nucleotide-Independent+Manner.">KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner.</a> Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).</li><li>Talsania, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Assembly+and+Annotation+of+the+Trichoplusia+ni+Tni-FNL+Insect+Cell+Line+Enabled+by+Long-Read+Technologies.">Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies.</a> Genes. 10 (2), 79 (2019).</li><li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RAS+function+through+targeting+an+allosteric+regulatory+site.">Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site.</a> Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+polyisoprenylated+Ras+proteins+in+the+insect/baculovirus+system.">Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system.</a> Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).</li><li>Dharmaiaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+recognition+of+farnesylated+and+methylated+KRAS4b+by+PDE&#948;.">Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDE&#948;.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).</li><li>Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanism+of+drug/Lipid+membrane+interactions+using+Biacore.">Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore.</a> Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).</li><li>Fisher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interactions+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+with+oligonucleotides.">Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).</li><li>Lakshman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+biophysical+analysis+defines+key+components+modulating+recruitment+of+the+GTPase+KRAS+to+the+plasma+membrane.">Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).</li></ol>

Wie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse erwähnt, ist der wichtigste Schritt während der Reinigung die Handhabung der Probe während der Zeit, in der sie sich in geringerem Salz befindet. Die Begrenzung der Zeit, die die Probe weniger als 200 mM NaCl ausgesetzt ist, trägt dazu bei, die Niederschlagsmenge zu reduzieren und die Probenausbeute zu erhöhen. Die Interpretation der Ergebnisse der CEX kann schwierig sein, wenn das Profil nicht den Erwartungen entspricht (siehe Abbildung 2). B...

Posttranslationale Modifikationen spielen eine Schlüsselrolle bei der Definition der funktionellen Aktivität von Proteinen. Modifikationen wie Phosphorylierung und Glykosylierung sind gut etabliert. Lipidmodifikationen sind jedoch weniger gut charakterisiert. Es wird geschätzt, dass bis zu 0,5% aller zellulären Proteine pränylatiert sein können1. Pränylierung ist die Übertragung eines 15-Kohlenstoff-Farnesyls oder einer 20-Kohlenstoff-Geranylgeranyl-Lipidkette auf ein Akzeptorprotein, das das CAAX-Motiv2enthält. Pränylate Proteine wurden in das Fortschreiten mehrerer menschlicher Krankheiten verwickelt, einschließlich vorzeitiger Alterung3, Alzheimer4, Herzfunktionsstörungen5, Choroiderämie6und Krebs7. Die kleinen GTPases, HRAS, NRAS und KRAS1, Kernlamine und die Kinetochores CENP-E und F sind farnesylierte Proteine unter dem basalen Zustand. Andere kleine GTPases, nämlich RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42 und RRAS sind geranylgeranylated8, während RhoB farnesyliert oder geranylgeranyatd9sein kann.
Der kleine GTPase KRAS4b fungiert als molekularer Schalter und überträgt im Wesentlichen extrazelluläre Wachstumsfaktoren signalet an intrazelluläre Signaltransduktionswege, die das Zellwachstum und die Zellproliferation über mehrere Protein-Protein-Wechselwirkungen stimulieren. Es gibt zwei Schlüsselaspekte der KRAS4b Biochemie, die für ihre Aktivität unerlässlich sind. Erstens, die Proteinzyklen zwischen einem inaktiven BIP und einem aktiven GTP gebundenen Zustand, wobei es aktiv mit Effektoren engagiert. Zweitens leiten eine C-terminale Polylysinregion und ein farnesyliertes und carboxymethyliertes Cystein das Protein auf die Plasmamembran, was die Rekrutierung und Aktivierung nachgeschalteter Effektoren ermöglicht. Mutant KRAS4b ist ein onkogener Treiber bei Bauchspeicheldrüsen-, Dickdarm- und Lungenkrebs10, und als solche, therapeutische Intervention hätte einen großen klinischen Nutzen. Die Herstellung von authentisch modifiziertem rekombinantem Protein, das farnesyliert und carboxymethyliert ist, würde ein biochemisches Screening mit KRAS4b in Kombination mit Membransurrogaten wie Liposomen oder Lipid-Nanoscheibenermöglichen 11,12.
Farnesyltransferase (FNT) katalysiert die Zugabe von Farnesylpyrophosphat zum C-Terminal Cystein im CAAX-Motiv in KRAS4b. Nach der Pränylierung wird das Protein zum endoplasmatischen Retikulum (ER) geschmuggelt, wo das Ras-Converting-Enzym (RCE1) die drei C-Terminal-Rückstände spaltet. Der letzte Schritt in der Verarbeitung ist die Methylierung des neuen C-Terminal-Farnesylcystein-Rückstandes durch das ER-Membranprotein Isoprenylcystein-Carboxylmethyltransferase (ICMT). Die Expression des rekombinanten KRAS4b in E. coli führt zur Produktion eines unveränderten Proteins. Frühere Versuche, verarbeitetes KRAS4b herzustellen, waren aufgrund unzureichender Erträge für Struktur- oder Arzneimittelscreening-Experimente begrenzt oder konnten das native vollwertige ausgereifte Protein13,14nicht rekapitulieren. Das hier vorgestellte Protokoll verwendet ein entwickeltes Baculovirus-basiertes Insektenzellexpressionssystem und Reinigungsmethode, das hochgereinigtes, vollständig verarbeitetes KRAS4b bei einer Ausbeute von 5 mg/L Zellkultur erzeugt.
Eine sorgfältige Proteincharakterisierung ist unerlässlich, um die Qualität rekombinanter Proteine zu validieren, bevor sie mit Strukturbiologie- oder Arzneimittelscreeningstudien beginnen. Zwei wichtige Parameter der vollständig verarbeiteten KRAS4b sind die Validierung der korrekten Pränylmodifikation und die Verfügbarkeit des farnesylierten und carboxymethylierten C-Terminus (FMe) für die Interaktion mit Membranersatzstoffen oder Lipiden. Die Elektrospray-Ionisationsmassenspektrometrie (ESI-MS) des KRAS4b-FMe wurde verwendet, um das Molekulargewicht zu messen und das Vorhandensein der Farnesyl- und Carboxymethylmodifikationen zu bestätigen. Die native Massenspektrometrie, bei der Proben mit nicht denatierenden Lösungsmitteln besprüht werden, wurde verwendet, um zu zeigen, dass KRAS4b-FMe auch an seinen BIP-Kofaktor gebunden war. Schließlich wurde die Oberflächen-Plasmonresonanzspektroskopie verwendet, um die direkte Bindung von KRAS4b-FMe mit immobilisierten Liposomen zu messen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>30211SS-1232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>850457</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>840034</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5427R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A998-1 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09689-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>ARUP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate 384</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore T200 Instrument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Snap-It Seals, T/S</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-54B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonic Bath</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-336-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation Exchange Chromatography (CEX) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018183</td>
			<td>HiPrep SP Sepharose High Performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyna Pro Plate Reader</td>
			<td>Wyatt Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exactive Plus EMR Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0507-500Ml</td>
			<td>Use Reagent Grade or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson vials 7x14 mm Tubes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass screw thread vials with PTFE foam liners</td>
			<td>Scientific Specialities</td>
			<td>B69302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed/benchtop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>05-112-114D</td>
			<td>capable of up to 4,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>92414</td>
			<td>Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9365-51</td>
			<td>HisPrep FF 16/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-House Water Supply, Arium Advance</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td></td>
			<td>Resistivity of 18 M&#937;0-cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid extruder set with holder</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI-DEWAR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M110-EH microfluidizer</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 &#197;, 2.1 x 150 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagTran software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC Grade</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>BDH20864.400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>78880002</td>
			<td>NGC QuestTM 100 Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Caps type 3</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series S Sensor Chip L1</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29104993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>13-400-519</td>
			<td>Absorbace at 280nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>PES membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima - L80K</td>
			<td>capable of 100,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733-1L</td>
			<td>May use in-house water source (see below)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter</td>
			<td>GE Healthcare - Whatman</td>
			<td>6994-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur QualBrowser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>proteomics software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein

Proteinpränylierung ist eine wichtige Modifikation, die für die Ausrichtung von Proteinen auf intrazelluläre Membranen verantwortlich ist. KRAS4b, das bei 22% der menschlichen Krebsarten mutiert ist, wird durch Farnesylierung und Carboxymethylierung durch das Vorhandensein eines CAAX-Boxmotivs am C-Terminus verarbeitet. Ein technisches Baculovirus-System wurde verwendet, um farnesylierte und carboxymethylierte KRAS4b in Insektenzellen auszudrücken und wurde zuvor beschrieben. Hier beschreiben wir die detaillierte, praktische Reinigung und biochemische Charakterisierung des Proteins. Insbesondere wurden Affinität und Ionenaustauschchromatographie verwendet, um das Protein auf Homogenität zu reinigen. Intakte und native Massenspektrometrie wurde verwendet, um die korrekte Modifikation von KRAS4b zu validieren und die Nukleotidbindung zu überprüfen. Schließlich wurde die Membranassoziation von farnesylierter und carboxymethylierter KRAS4b zu Liposomen mittels Oberflächen-Plasmonresonanzspektroskopie gemessen.

Eine der größten Variablen im Protokoll ist die Menge des exprimierenden Zielproteins (His6-MBP-tev-KRAS4b). Dieses Protokoll wurde unter Verwendung eines Isolats aus einer Trichoplusia ni-Zelllinie, Tni-FNL17, entwickelt, das für das Suspensionswachstum angepasst und aus Serum entwöhnt wurde. Angesichts der vielzahl von Ergebnissen, die über die verschiedenen Insektenzelllinien mit dem Baculovirus-Expressionssystem berichtet werden, ist es ratsam, Dass Tni-FNL zumindest anfangs verw...

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Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Prenylierung ist eine wichtige Modifikation an peripheren Membranbindungsproteinen. Insektenzellen können manipuliert werden, um farnesylierte und carboxymethylierte KRAS4b in Mengen zu produzieren, die biophysikalische Messungen von Protein-Protein- und Protein-Lipid-Wechselwirkungen ermöglichen

Vollverarbeitetes rekombinantes KRAS4b: Isoliert und charakterisieren das farnesylierte und methylierte Protein

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Unser Protokoll ermöglicht die Isolierung und Trennung von ordnungsgemäß verarbeitetem KRAS bei hoher Ausbeute. Die Herstellung von authentisch farnesylierten und carboxymethylierten KRAS ermöglicht Experimente, die KRAS in ihrer Membran haben, genau wie in Säugetierzellen. Die hohe Ausbeute des Protokolls hebt es von früheren Arbeiten ab.Wir reinigen in der Regel drei bis fünf Milligramm Protein pro Liter Expressionsmaterial. Dies ermöglicht es uns, eine Vielzahl von biophysikalischen und strukturbiologischen Experimenten durchzuführen. KRAS ist bei 20% der Krebsarten und 90% bei Bauchspeicheldrüsenkrebs mutiert.Ein Protokoll zur Herstellung von authentisch verarbeitetem Protein ist also sehr nützlich für die Entwicklung von Medikamenten-Screens, so dass Sie das eigentliche Protein wie auf der Membran von Krebszellen studieren können. Dieses Protokoll ist auch sehr nützlich für die Untersuchung anderer Proteine, die in den Zellen farnesyliert und vollständig verarbeitet sind. Und als solches, alles, was Sie tun müssen, ist das KRAS mit dem Protein von Interesse tauschen und setzen Sie es in das Baculovirus.Die entscheidenden Schritte sind die rund um die Kationenaustauschchromatographie. Die Verwendung der richtigen Säule und die Begrenzung der Zeit, in der sich das Protein in einem niedrigen Salzpuffer befindet, sind für den Erfolg unerlässlich. Zu verstehen, dass der Niederschlag kein Ereignis vom Typ der Schneekugel ist, hilft, die Neuen zum Protokoll zu führen.Dies wird durch die Notwendigkeit verstärkt, die Ladung der Kationenaustauschsäule in mehrere kleinere Lasten aufzuteilen. Nach dem Lysing von Zellen, der Klärung des Lysats und der Reinigung des Zielproteins durch IMAC, analysieren Sie die Proteinfraktionen mit SDS-Seite und Coomassie-Färbung. Die Spitzenfraktionen bündeln und das Becken über Nacht gegen zwei Liter Puffer D bei vier Grad Celsius dialysieren.Am nächsten Tag die Probe von der Dialyse entfernen und bei 4.000 mal g für 10 Minuten zentrifugieren, um jeglichen Niederschlag zu entfernen. Die endgültige dialyzierte und geklärte Probe ist oft noch trübe, kann aber ohne weitere Verarbeitung auf die CEX-Säule aufgetragen werden. Vorbereiten Sie 20 Milliliter Kationenaustauschsäule, indem Sie sie mit drei Spaltenvolumen Puffer G waschen, dann mit drei Spaltenvolumen Puffer F.Next 20 Milliliter der Dialyseprobe auf eine endgültige Natriumchloridkonzentration von 100 Millimolar verdünnen, indem Sie 20 Milliliter Puffer E hinzufügen und die Probe auf die Austauschsäule auftragen.Es ist wichtig, die kleine Menge der Probe auf einmal zu verdünnen und die verdünnten Proben sollten unmittelbar nach der Verdünnung auf die Säule aufgetragen werden, um die Ausfällung des Proteins zu begrenzen. Fahren Sie mit der Ladung der Säule mit frisch verdünnter Probe fort, da sich die vorherige Verdünnung dem Ende der Last nähert. Waschen Sie dann die Spalte auf Basisabsorption 280 mit Puffer F, die in der Regel drei Spaltenvolumen erfordern.Elute das Protein aus der Säule mit einem 400 Milliliter Gradienten von Puffer F zu 65%Puffer G, sammeln das Eluent in sechs Milliliter Fraktionen. Sobald der Farbverlauf abgeschlossen ist, waschen Sie die Spalte weiter für ein zusätzliches 1,5-Säulen-Volumen von 65%Puffer G.Wählen Sie die positiven Brüche basierend auf SDS-Seite und Coomassie Blue Fleckenanalyse sowie Inspektion der UV-Spur des Chromatogramms. Dann bündeln Sie das Protein und verdauen Sie es mit His6 TEV Protease nach Manuskriptanweisungen.Nach Verdauung und Dialyse das Protein auf eine 20-Milliliter-IMAC-Säule laden, die mit Puffer A mit drei Millilitern pro Minute ausgeglichen wird. Sammeln Sie während dieser Chromatographie sieben Milliliter-Fraktionen und waschen Sie die Säule mit insgesamt drei Spaltenvolumen des Puffers A oder bis die Basisabsorption erreicht ist. Elute das Zielprotein mit fünf Spalten Volumengradient von Puffer C von 0% bis 10% und sammeln sieben Milliliter-Fraktionen.Identifizieren Sie dann die positiven Brüche mit der SDS-Seite. Bei der Analyse mit der SDS-Seite sollte das geklärte Lysat ein dunkles Band enthalten, das auf etwa 65 Kilodalton emigriert, was dem Fusionsprotein His6-MBP-tev-KRAS4b entspricht. Der mitausgedrückte FNTAb wandert auf 48 Kilodalton.Der CEX-Schritt innerhalb der Reinigung ist entscheidend, da er das Ausmaß der Proteolyse reduziert und das vollständig verarbeitete Protein bereichert, aber der komplizierteste Teil des Protokolls ist. Ein typisches Ergebnis dieses Schritts hat mit dem KRAS4b-FMe einen prominenten Spitzenwert von drei, aber die Elutionsprofile können variabel sein. Intakte Massenanalysen mit ESIMS bestätigen die genaue Molekularmasse der Proteine und damit den relativen Anteil der Farnesylierung oder Carboxymethylierung.Während typische Endlose einige nachweisbare KRAS4b-FARN enthielten, betrug dieser Anteil in Bezug auf die Spitzenhöhe dieser Analyse weniger als 15%. Native Massenanalyse wurde verwendet, um die Masse des KRAS4b an das BIP gebunden zu bestimmen. Das Probenlösungsmittel wurde gegen Ammoniumacetat ausgetauscht, um eine weichere Ionisation zu gewährleisten, die es dem nativen Komplex ermöglicht, intakt zu bleiben.Die Wechselwirkung von KRAS4b-FMe und Liposomen wurde mit Oberflächen-Plasmonresonanz gemessen, um die Farnesylierung zu validieren und Carboxymethylierung erforderlich sind, damit KRAS4b-FMe an Membranen binden kann. Wie erwartet, KRAS4b-FMe gebunden an die Liposomen, während unverarbeitet KRAS4b nicht. Die Minimierung der Zeit, in der das Protein salzarmen Salz ausgesetzt ist, ist der kritischste Aspekt des Protokolls, der die Ausbeute beeinflusst.Das Protein ist nur kurz bei dieser niedrigen Salzkonzentration nach der Verdünnung in Puffer E.Das Protein kann für eine Vielzahl von biophysikalischen Experimenten verwendet werden, die Membranmimetik wie Liposomen oder Nanoscheiben verwenden, um zu untersuchen, mit welchen Lipiden KRAS interagiert. Anhand dieser Daten können wir damit beginnen, zu extrapolieren, wie KRAS mit der Plasmamembran der Zelle interagiert. Mit gereinigtem KRAS-FMe konnten unsere Kollegen die Röntgenkristallstruktur von KRAS in Komplex mit einem Chaperon lösen, das spezifisch für die farnesylierte und methylierte Form dieses Proteins ist.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

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Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Forschung

Biochemie

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Untersuchen Assemblierungsintermediate mit rekombinantem Archaeal Proteasomen und nicht denaturierenden PAGE: Die Argumente für einen kombinierten Ansatz

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Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

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Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Völlig autonom Charakterisierung und Datenerfassung aus Kristallen von biologischen Makromolekülen

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Ionenaustausch-Chromatographie (IEX) gekoppelt an Multiwinkel Lichtstreuung (MALS) für Protein Trennung und Charakterisierung

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Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

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