Name: fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein
Uploaded: 2020-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein at JoVE.com

אנו מכירים שיבוט והבעה תמיכה מקאריסה Grose, ג'ן Melhalko, ו מאט דרו במעבדת ביטוי חלבון, פרדריק המעבדה הלאומית לחקר הסרטן. פרויקט זה ממומן במלואו או בחלקו עם כספים פדרליים מן המכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות, תחת חוזה לא. HHSN261200800001E. התוכן של פרסום זה אינו משקף בהכרח את ההשקפות או המדיניות של מחלקת הבריאות ושירותי האנוש, וגם לא מזכיר שמות מסחריים, מוצרים עסקיים או ארגונים המזכירים אישור ממשלת ארצות הברית

1. טיהור חלבון
<ol><li>הכינו מאגרי A – H, כפי שנראה בטבלה 1.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מאגר פתרונות</td>
			<td>סוכן באגירה (כל 20 מ"מ)</td>
			<td>
pH
</td>
			<td>יאסול (ממ)</td>
			<td>סרדאמיד (ממ)</td>
			<td>מיכלהש...

<ol>
	<li>Cox, A. D., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation:+more+than+just+glue.">Protein prenylation: more than just glue.</a> Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).</li><li>Zhang, F. L., Casey, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Prenylation:+Molecular+Mechanisms+and+Functional+Consequences.">Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).</li><li>Hottman, D. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation+and+synaptic+plasticity:+implications+for+Alzheimer's+disease.">Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease.</a> Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).</li><li>Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+and+cognition+in+neurodegenerative+disorders.">HDL and cognition in neurodegenerative disorders.</a> Neurobiology of Disease. 72, 22-36 (2014).</li><li>Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pleiotropic+effect+of+statins:+prevention+of+cardiac+hypertrophy+by+cholesterol-independent+mechanisms.">A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms.</a> Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).</li><li>Kohnke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPase+prenylation+hierarchy+and+its+potential+role+in+choroideremia+disease.">Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease.</a> PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).</li><li>Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+prenylation+for+cancer+therapy.">Targeting protein prenylation for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).</li><li>Kho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tagging-via-substrate+technology+for+detection+and+proteomics+of+farnesylated+proteins.">A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).</li><li>Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAAX+geranylgeranyl+transferase+transfers+farnesyl+as+efficiently+as+geranylgeranyl+to+RhoB.">CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).</li><li>Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dragging+ras+back+in+the+ring.">Dragging ras back in the ring.</a> Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+in+Membrane+Biochemistry+and+Biophysics.">Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics.</a> Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).</li><li>Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Step-by-step+Method+for+the+Reconstitution+of+an+ABC+Transporter+into+Nanodisc+Lipid+Particles.">A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).</li><li>Dementiev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-Ras4B+lipoprotein+synthesis:+biochemical+characterization,+functional+properties,+and+dimer+formation.">K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation.</a> Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+recombinant+human+Kirsten-ras+(4B)+p21+produced+at+high+levels+in+Escherichia+coli+and+insect+baculovirus+expression+systems.">Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).</li><li>Gillette, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Farnesylated+and+Methylated+Proteins+in+an+Engineered+Insect+Cell+System.">Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).</li><li>Agamasu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS+Prenylation+Is+Required+for+Bivalent+Binding+with+Calmodulin+in+a+Nucleotide-Independent+Manner.">KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner.</a> Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).</li><li>Talsania, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Assembly+and+Annotation+of+the+Trichoplusia+ni+Tni-FNL+Insect+Cell+Line+Enabled+by+Long-Read+Technologies.">Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies.</a> Genes. 10 (2), 79 (2019).</li><li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RAS+function+through+targeting+an+allosteric+regulatory+site.">Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site.</a> Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+polyisoprenylated+Ras+proteins+in+the+insect/baculovirus+system.">Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system.</a> Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).</li><li>Dharmaiaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+recognition+of+farnesylated+and+methylated+KRAS4b+by+PDE&#948;.">Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDE&#948;.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).</li><li>Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanism+of+drug/Lipid+membrane+interactions+using+Biacore.">Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore.</a> Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).</li><li>Fisher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interactions+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+with+oligonucleotides.">Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).</li><li>Lakshman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+biophysical+analysis+defines+key+components+modulating+recruitment+of+the+GTPase+KRAS+to+the+plasma+membrane.">Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).</li></ol>

כאמור בסעיף תוצאות הנציג, הצעד הקריטי ביותר במהלך הטיהור הוא טיפול במדגם במהלך הזמן שהוא במלח נמוך. הגבלת הזמן שהמדגם נחשף לפחות מ-200 מ"מ והוא יסייע להפחית משקעים ולהגדיל את התשואה למדגם. פענוח תוצאות CEX יכול להיות קשה אם הפרופיל אינו תואם את הציפיות (ראה איור 2). עד שהפרוטוקו?...

שינויי posttranslational ממלאים תפקיד מרכזי בהגדרת הפעילות הפונקציונלית של חלבונים. שינויים כגון זירחון וגליקוציה מבוססים היטב. השינויים השומנים מאופיינים פחות טוב, עם זאת. מעריכים כי ככל 0.5% של כל החלבונים הסלולריים עשויים להיות הסכם1. הפרלציה היא העברה של 15 פחמן farnesyl או 20-פחמן geranylgeranyl שרשרת השומנים לקבלה חלבון המכיל את המוטיב CAAX2. חלבונים מראש היו מעורבים בהתקדמות של מחלות אנושיות מספר כולל הזדקנות מוקדמת3, אלצהיימר4, בתפקוד הלב5, choroideremia6, סרטן7. GTPases קטנים, HRAS, NRAS, ו-קראס1, גרעיני למינציה, ו קינטומטלות cenp-E ו-F הם חלבונים מתחת למצב הבזליים. GTPases קטנים אחרים, כלומר RhoA, Rhoa, Rac1, cdc-42, ו RRAS הם geranylgeranylated ואילו Rhoa יכול להיות farnesylated או Geranylgeranylated9.
GTPase קטן KRAS4b מתפקד כמתג מולקולרי, ביסודו של דבר שידור גורם הגדילה מחילוץ איתות כדי התמרה אות תאיים מסלולים המעוררים צמיחת תאים והתפשטות, באמצעות אינטראקציות חלבונים חלבון מרובים. ישנם שני היבטים מרכזיים של KRAS4b ביוכימיה החיוניים לפעילותה. ראשית, החלבון מחזורי בין התמ ג לא פעיל ומצב פעיל של GTP שבאמצעותו הוא מעורב באופן פעיל עם העריקים. שנית, אזור C-מסוף פולי ליזין ו מעטפת ו carboxyמתילated ציסטאין להפנות את החלבון לקרום פלזמה, המאפשר גיוס והפעלה של מנוכי במורד הזרם. החשבונאי KRAS4b הוא הנהג אונגניים ב הלבלב, המעי הגס, וסרטן הריאות10, וככזה, התערבות טיפולית יהיה יתרון קליני ענק. ייצור של חלבון רקומביננטי שונה באופן אותנטי כי הוא farnesylated ו carboxyמתילמית יהיה לאפשר הקרנה ביוכימית באמצעות KRAS4b בשילוב עם מחליפים ממברנה כגון ליפוזומים או ננודיסקי ליפיד11,12.
Farnesyl טרנספראז (fnt) מזרז את התוספת של farnesyl פירופוספט ל-C-טרמינל ציסטאין במוטיב caax ב KRAS4b. לאחר הפרלציה, החלבון הוא נסחר לרשת האנדופלזמית (ER) שבה האנזים המרה (RCE1) מותיר את שלושת שאריות C-terminal. השלב האחרון בעיבוד הוא מתילציה של משקעים C-terminal החדש של הקרום על ידי חלבון הממברנה ER, isoprenylcysteine מתילגיאז (ICMT). הביטוי של רקומביננטי KRAS4b ב E. coli מביא לייצור של חלבון שלא שונו. ניסיונות קודמים לייצר KRAS4b מעובד הוגבלה בשל התשואות מספיק עבור ניסויים מבניים או תרופות ההקרנה או נכשל לכידה של חלבון בוגר באורך מלא הטבעי13,14. הפרוטוקול המוצג כאן מנצל מהונדסים baculovirus מבוסס תא חרקים מערכת ושיטת טיהור שמייצר מאוד מטוהרים, מעובד באופן מלא KRAS4b בתשואות של 5 מ"ג/L של תרבות התא.
האפיון חלבון זהיר חיוני כדי לאמת את האיכות של חלבונים רקומביננטי לפני היציאה על ביולוגיה מבנית או לימודי סינון סמים. שני פרמטרים מרכזיים של מעובד באופן מלא KRAS4b הם אימות של השינוי הנכון הסכם ואת הזמינות של farnesylated ו carboxyמתילated C-טרמינוס (FMe) לאינטראקציה עם תחליפי ממברנה או שומנים. Electrospray יינון ספקטרומטר מסה (ESI-MS) של KRAS4b-fme שימש כדי למדוד את המשקל המולקולרי ולאשר את הנוכחות של farnesyl ושינויים carboxyמתיל. הספקטרומטר ההמוני היליד, שבו מרססים דגימות באמצעות ממיסים שאינם משפריצו, שימשו כדי להדגים כי KRAS4b-FMe הייתה גם קשורה לקופקטור התמ ג. לבסוף, הספקטרוסקופיית תהודה של פני השטח שימש למדידת הכריכה הישירה של KRAS4b-FMe עם ליפוזומים ללא קיבוע.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>30211SS-1232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>850457</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>840034</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5427R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A998-1 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09689-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>ARUP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate 384</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore T200 Instrument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Snap-It Seals, T/S</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-54B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonic Bath</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-336-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation Exchange Chromatography (CEX) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018183</td>
			<td>HiPrep SP Sepharose High Performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyna Pro Plate Reader</td>
			<td>Wyatt Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exactive Plus EMR Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0507-500Ml</td>
			<td>Use Reagent Grade or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson vials 7x14 mm Tubes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass screw thread vials with PTFE foam liners</td>
			<td>Scientific Specialities</td>
			<td>B69302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed/benchtop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>05-112-114D</td>
			<td>capable of up to 4,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>92414</td>
			<td>Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9365-51</td>
			<td>HisPrep FF 16/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-House Water Supply, Arium Advance</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td></td>
			<td>Resistivity of 18 M&#937;0-cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid extruder set with holder</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI-DEWAR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M110-EH microfluidizer</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 &#197;, 2.1 x 150 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagTran software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC Grade</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>BDH20864.400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>78880002</td>
			<td>NGC QuestTM 100 Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Caps type 3</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series S Sensor Chip L1</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29104993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>13-400-519</td>
			<td>Absorbace at 280nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>PES membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima - L80K</td>
			<td>capable of 100,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733-1L</td>
			<td>May use in-house water source (see below)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter</td>
			<td>GE Healthcare - Whatman</td>
			<td>6994-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur QualBrowser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>proteomics software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein

הפרלציה חלבון הוא שינוי מפתח האחראי על המיקוד חלבונים כדי ממברנות תאיים. KRAS4b, אשר מוטציה 22% של סרטן האדם, מעובד על ידי פרנוסילציה ו carboxymethylation בשל נוכחותם של ' CAAX ' מוטיב תיבת ב C-טרמינוס. מערכת baculovirus הנדסה שימש כדי לבטא farnesylated ו carboxyמתילated KRAS4b בתאי חרקים ותיאר קודם לכן. כאן, אנו מתארים את האפיון המפורט והמעשי של החלבון. במיוחד, שימשו כרומטוגרפיה של אהדה והחלפת יונים כדי לטהר את החלבון להומוגניות. ספקטרומטר מסה שלם ומקורי שימש לאימות השינוי הנכון של KRAS4b ולאימות מחייב של נוקלאוטיד. לבסוף, האגודה הממברנה של farnesylated ו carboxyמתילated KRAS4b ליפוזומים נמדד באמצעות ספקטרוסקופית תהודה משטח המשטח.

אחד המשתנים הגדולים ביותר בפרוטוקול הוא כמות חלבון היעד המבוטאת (His6-MBP-tev-KRAS4b). פרוטוקול זה פותח באמצעות לבודד מתוך קו משולש החוליה הטריקוזוולי , tni-fnl17, המותאמים לצמיחה ההשעיה והוא שואף מנסיוב. בהינתן מגוון רחב של תוצאות שדווחו על פני הקווים השונים תא חרקים עם מערכת הביטוי b...

Watch this Scientific Journal Video about Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein at JoVE.com

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

הפרלציה היא שינוי חשוב בחלבונים היקפיים כריכת ממברנה. תאי חרקים יכולים להיות מניפולציות כדי לייצר farnesylated ו carboxyמתילated KRAS4b בכמויות המאפשרות מדידות ביופיזיקלי של חלבון-חלבון ואינטראקציות חלבונים-השומנים

עיבוד מלא של רקומביננטי KRAS4b: בידוד ואפיון של חלבון הפרג והמתילנטי

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

הפרוטוקול שלנו מאפשר בידוד והפרדת KRAS מעובד כראוי בתשואה גבוהה. הייצור של KRAS מנומנם אותנטי carboxymethylated מאפשר לבצע ניסויים שיש KRAS בקרום שלהם בדיוק כמו בתאי יונקים. התשואה הגבוהה של הפרוטוקול מבדילה אותו מעבודה קודמת.בדרך כלל אנו מטהרים 3-5 מיליגרם חלבון לליטר חומר ביטוי. זה מאפשר לנו לערוך מגוון ניסויים ביולוגיים ביופיזיים ומבניים. KRAS מוטציה ב 20% של סרטן ו 90% בסרטן הלבלב.אז לאחר פרוטוקול לייצר חלבון מעובד אותנטי הוא די שימושי לפיתוח מסכי סמים, כך שאתה יכול ללמוד את החלבון בפועל כפי שהוא יהיה על הממברנה של תאים סרטניים. פרוטוקול זה הוא גם מאוד שימושי לחקר חלבונים אחרים כי הם farnesylated מעובד באופן מלא בתאים. וככזה, כל מה שאתה צריך לעשות הוא להחליף את KRAS עם החלבון של עניין ולשים אותו לתוך baculovirus.הצעדים הקריטיים הם אלה סביב כרומטוגרפיה חילופי הקטיון. שימוש בעמודה הנכונה והגבלת הזמן שבו החלבון נמצא במאגר מלח נמוך חיוניים להצלחה. ההבנה כי המשקעים אינם סוג של כדור שלג של אירוע מסייע להנחות את אלה חדשים לפרוטוקול.זה מחוזק על ידי הצגת הצורך לחלק את עומס עמודת חילופי הקטינות לעומסים קטנים יותר מרובים. לאחר lysing תאים, הבהרת lysate, וטיהור חלבון היעד על ידי IMAC, לנתח את שברי החלבון באמצעות דף SDS וכתמים קומאסי. בריכת שברי השיא דיאליזה הבריכה לילה נגד שני ליטרים של חיץ D בארבע מעלות צלזיוס.ביום שלמחר, להסיר את המדגם מדיאליזה צנטריפוגה אותו ב 4, 000 פעמים g במשך 10 דקות כדי להסיר כל משקעים. הדגימה הדיאליזה והמובהרת הסופית היא לעתים קרובות עדיין מעורפלת אך ניתן להחיל אותה על עמודת CEX ללא עיבוד נוסף. הכן 20 עמודת חילופי יון מיליליטר על ידי שטיפת אותו עם שלושה כרכים עמודה של חיץ G, ולאחר מכן עם שלושה כרכים עמודה של חיץ F.Next, לדלל 20 מיליליטר של המדגם דיאליזה לריכוז נתרן כלורי סופי של 100 מילימולר על ידי הוספת 20 מיליליטר של מאגר E ולהחיל את המדגם על עמודת החליפין.זה קריטי לדלל את הכמות הקטנה של המדגם במקום בבת אחת ואת הדגימות מדולל צריך להיות מיושם על הטור מיד לאחר דילול כדי להגביל את המשקעים של החלבון. המשך לטעון את העמודה עם מדגם מדולל טרי כאשר הדילול הקודם מתקרב לסוף העומס. לאחר מכן שטפו את העמודה לספיגה בסיסית 280 עם מאגר F הדורש בדרך כלל שלושה אמצעי אחסון של עמודות.החלף את החלבון מהעמודה עם שיפוע של 400 מיליליטר ממאגר F ל- 65%buffer G, ואסף את ה- eluent בשישה שברים מיליליטר. לאחר השלמת מעבר הצבע, המשך לשטוף את העמודה לקבלת אמצעי אחסון נוספים של 1.5 עמודות של 65%buffer G.בחר את השברים החיוביים המבוססים הן על דף SDS והן על ניתוח כתמים כחול קומאסי, כמו גם בדיקה של עקבות UV של הכרומטוגרמה. ואז לאסוף את החלבון ולעכל אותו עם פרוטאז TEV His6 על פי הוראות כתב היד.לאחר העיכול והדיאליזה, העמיסו את החלבון על עמוד IMAC של 20 מיליליטר עם חיץ A ב-3 מיליליטר לדקה. לאסוף שבעה שברים מיליליטר במהלך כרומטוגרפיה זו ולשטוף את העמודה עם סך של שלושה כרכים עמודה של מאגר A או עד ספיגה בסיסית הוא הגיע. יש להניף את חלבון היעד עם שיפוע נפח של חמש עמודות של מאגר C מ-0% ל-10% ולאסוף שבעה שברים מיליליטר.לאחר מכן זהה את השברים החיוביים באמצעות דף SDS. כאשר מנתחים אותו עם דף SDS, ה-lysate המובהר צריך להכיל רצועה כהה הנודדת אל כ-65 קילו-דלטון התואמת את חלבון ההיתוך His6-MBP-tev-KRAS4b. ה- FNTAb המובע במשותף עובר ל- 48 קילודאלטונים.הצעד CEX בתוך הטיהור הוא קריטי כי זה מקטין את היקף פרוטאוליזה ומעשיר את החלבון מעובד במלואו, אבל הוא החלק המסובך ביותר של הפרוטוקול. תוצאה אופיינית של שלב זה יש שיא בולט שלוש עם KRAS4b-FMe אבל פרופילי אלוטיון יכול להיות משתנה. ניתוח מסה שלם באמצעות ESIMS לאשר את המסה המולקולרית המדויקת של החלבונים ובכך את החלק היחסי של farnesylation או carboxymethylation.בעוד מגרשים סופיים טיפוסי הכיל כמה KRAS4b-FARN לזיהוי, שיעור זה היה פחות מ 15%במונחים של גובה שיא מניתוח זה. ניתוח מסה מקורי שימש כדי לקבוע את המסה של KRAS4b מחויב לתמ"ג. הממס לדוגמה הוחלף לאמוניום אצטט כדי להבטיח יינון רך יותר המאפשר למתחם המקורי להישאר שלם.האינטראקציה של KRAS4b-FMe וליפוזומים נמדדה עם תהודה פלסמון פני השטח כדי לאמת את farnesylation ו carboxymethylation נדרשים KRAS4b-FMe להיקשר ממברנות. כצפוי, KRAS4b-FMe קשור ליפוזומים בעוד KRAS4b לא מעבד לא. צמצום הזמן שבו החלבון נחשף למלח נמוך הוא ההיבט הקריטי ביותר בפרוטוקול המשפיע על התשואה.החלבון נמצא רק לזמן קצר בריכוז מלח נמוך זה בעקבות הדילול במאגר E.The החלבון יכול לשמש למגוון ניסויים ביופיזיים המשתמשים בפנטומימה של קרום כמו ליפוזומים או ננו-דיסקים כדי לחקור עם אילו שומנים KRAS מקיים אינטראקציה. באמצעות נתונים אלה, אנו יכולים להתחיל לשער כיצד KRAS אינטראקציה עם קרום הפלזמה של התא. באמצעות KRAS-FMe מטוהרים, עמיתינו הצליחו לפתור את מבנה גבישי הרנטגן של KRAS במתחם עם מלווה ספציפי לצורה המטופה והמתילציה של חלבון זה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

הכנה והגשת microcrystals חלבון בשלב lipidic מעוקב עבור קריסטלוגרפיה Femtosecond סידורי

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

בחינת העצרת הפרוטאזום עם רקומביננטי Archaeal הפרוטאזומים ועמוד Nondenaturing: The Case for גישה משולבת

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

ביטוי חלבון רקומביננטי, התגבשות, מחקרים ביופיסיקליים של א<em&gt; Bacillus</em&gt; -שמר Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

איסוף נתונים מקריסטלים של מקרומולקולות ביולוגיות ואפיון עצמאית לחלוטין

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

יונים כרומטוגרפיה (IEX) מצמידים מרובה זווית פיזור אור (MALS) עבור חלבון הפרדה ואפיון

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

אפיון מצרפים לחלבונים בודדים ע י ננו-ספקטרוסקופיה אינפרא-אדום ומיקרוסקופ כוח אטומי

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...