Name: fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein
Uploaded: 2020-01-16T14:00:00
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हम कैरिसा गरोज, जेन मेल्हालको और मैट आकर्षित प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रयोगशाला, फ्रेडरिक नेशनल लेबोरेटरी फॉर कैंसर रिसर्च में क्लोनिंग और अभिव्यक्ति समर्थन स्वीकार करते हैं। इस परियोजना को अनुबंध संख्या के तहत राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से संघीय धन के साथ पूरे या भाग में वित्त पोषित किया गया है । HHSN261200800001E. इस प्रकाशन की सामग्री जरूरी विचारों या स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग की नीतियों को प्रतिबिंबित नहीं करता है, और न ही व्यापार के नाम, वाणिज्यिक उत्पादों, या संगठनों का उल्लेख है अमेरिकी सरकार द्वारा समर्थन मतलब

1. प्रोटीन शुद्धि
<ol><li>बफ़र्स ए-एच तैयार करें, जैसा कि टेबल 1में देखा गया है।</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>बफर समाधान</td>
			<td>बफरिंग एजेंट (सभी 20 एमएम)</td>
			<td>
पीएच
</t...

<ol>
	<li>Cox, A. D., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation:+more+than+just+glue.">Protein prenylation: more than just glue.</a> Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).</li><li>Zhang, F. L., Casey, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Prenylation:+Molecular+Mechanisms+and+Functional+Consequences.">Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).</li><li>Hottman, D. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation+and+synaptic+plasticity:+implications+for+Alzheimer's+disease.">Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease.</a> Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).</li><li>Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+and+cognition+in+neurodegenerative+disorders.">HDL and cognition in neurodegenerative disorders.</a> Neurobiology of Disease. 72, 22-36 (2014).</li><li>Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pleiotropic+effect+of+statins:+prevention+of+cardiac+hypertrophy+by+cholesterol-independent+mechanisms.">A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms.</a> Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).</li><li>Kohnke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPase+prenylation+hierarchy+and+its+potential+role+in+choroideremia+disease.">Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease.</a> PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).</li><li>Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+prenylation+for+cancer+therapy.">Targeting protein prenylation for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).</li><li>Kho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tagging-via-substrate+technology+for+detection+and+proteomics+of+farnesylated+proteins.">A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).</li><li>Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAAX+geranylgeranyl+transferase+transfers+farnesyl+as+efficiently+as+geranylgeranyl+to+RhoB.">CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).</li><li>Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dragging+ras+back+in+the+ring.">Dragging ras back in the ring.</a> Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+in+Membrane+Biochemistry+and+Biophysics.">Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics.</a> Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).</li><li>Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Step-by-step+Method+for+the+Reconstitution+of+an+ABC+Transporter+into+Nanodisc+Lipid+Particles.">A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).</li><li>Dementiev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-Ras4B+lipoprotein+synthesis:+biochemical+characterization,+functional+properties,+and+dimer+formation.">K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation.</a> Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+recombinant+human+Kirsten-ras+(4B)+p21+produced+at+high+levels+in+Escherichia+coli+and+insect+baculovirus+expression+systems.">Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).</li><li>Gillette, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Farnesylated+and+Methylated+Proteins+in+an+Engineered+Insect+Cell+System.">Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).</li><li>Agamasu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS+Prenylation+Is+Required+for+Bivalent+Binding+with+Calmodulin+in+a+Nucleotide-Independent+Manner.">KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner.</a> Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).</li><li>Talsania, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Assembly+and+Annotation+of+the+Trichoplusia+ni+Tni-FNL+Insect+Cell+Line+Enabled+by+Long-Read+Technologies.">Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies.</a> Genes. 10 (2), 79 (2019).</li><li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RAS+function+through+targeting+an+allosteric+regulatory+site.">Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site.</a> Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+polyisoprenylated+Ras+proteins+in+the+insect/baculovirus+system.">Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system.</a> Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).</li><li>Dharmaiaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+recognition+of+farnesylated+and+methylated+KRAS4b+by+PDE&#948;.">Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDE&#948;.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).</li><li>Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanism+of+drug/Lipid+membrane+interactions+using+Biacore.">Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore.</a> Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).</li><li>Fisher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interactions+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+with+oligonucleotides.">Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).</li><li>Lakshman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+biophysical+analysis+defines+key+components+modulating+recruitment+of+the+GTPase+KRAS+to+the+plasma+membrane.">Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).</li></ol>

जैसा कि प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में उल्लेख किया गया है, शुद्धिकरण के दौरान सबसे महत्वपूर्ण कदम कम नमक में होने के समय के दौरान नमूने की हैंडलिंग है। समय है कि नमूना कम से कम २०० mM NaCl के संपर्क में है सीमित...

पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन प्रोटीन की कार्यात्मक गतिविधि को परिभाषित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। फॉस्फोरिलेशन और ग्लाइकोसिलेशन जैसे संशोधन अच्छी तरह से स्थापित हैं। लिपिड संशोधनों को कम अच्छी तरह से चित्रित किया जाता है, हालांकि। यह अनुमान लगाया गया है कि सभी सेलुलर प्रोटीन का 0.5% जितनाप्रीनिटेडहो सकता है । प्रीनिलेशन सीएएएक्स आकृति2युक्त एक स्वीकारकर्ता प्रोटीन के लिए 15-कार्बन फारनेसिल या 20-कार्बन गेरानिल्गेरानिल लिपिड श्रृंखला का हस्तांतरण है। प्रीनिटेड प्रोटीन को समय से पहले उम्र बढ़नेवाले 3, अल्जाइमर4,हृदय रोग5, कोरोइडेर्मिया6और कैंसर7सहित कई मानवीय रोगों की प्रगति में फंसाया गया है । छोटे GTPases, HRAS, NRAS, और KRAS1,परमाणु टुकड़े टुकड़े, और kinetochores CENP-ई और एफ बेसल हालत के तहत farnesylated प्रोटीन हैं । अन्य छोटे GTPases, अर्थात् RhoA, RhoC, Rac1, सीडीसी-४२, और RRAS geranylgeranylated8हैं, जबकि RhoB farnesylated या geranylgeranylated9किया जा सकता है ।
छोटे GTPase KRAS4b एक आणविक स्विच के रूप में कार्य करता है, अनिवार्य रूप से इंट्रासेलुलर सिग्नल ट्रांसडुक्शन रास्तों के लिए संकेत एक्स्ट्रासेलुलर विकास कारक संचारण जो कई प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के माध्यम से सेल विकास और प्रसार को प्रोत्साहित करते हैं। KRAS4b बायोकेमिस्ट्री के दो प्रमुख पहलू हैं जो इसकी गतिविधि के लिए आवश्यक हैं। सबसे पहले, एक निष्क्रिय सकल घरेलू उत्पाद और एक सक्रिय जीटीपी बाध्य राज्य के बीच प्रोटीन चक्र जिससे यह सक्रिय रूप से प्रभावकों के साथ संलग्न है । दूसरा, एक सी-टर्मिनल पॉली-लाइसिन क्षेत्र और एक फर्नेसेटेड और कार्बोक्सीमेथिलेटेड साइस्टीन प्रोटीन को प्लाज्मा झिल्ली पर निर्देशित करता है, जिससे डाउनस्ट्रीम प्रभावकों की भर्ती और सक्रियता सक्षम होती है। उत्परिवर्ती KRAS4b अग्नाशय, कोलोरेक्टल, और फेफड़ों के कैंसर10में एक कैंसरजनक चालक है, और इस तरह, चिकित्सीय हस्तक्षेप एक बड़ा नैदानिक लाभ होगा । प्रामाणिक रूप से संशोधित पुनः संयोजन प्रोटीन का उत्पादन जो फर्नेसेटेड और कार्बोक्सीमेथिलेटेड है, झिल्ली सरोगेट ्सजैसे लिपोसोम्स या लिपिड नैनोडिस्क11,12के संयोजन में KRAS4b का उपयोग करके जैव रासायनिक स्क्रीनिंग सक्षम करेगा ।
फारनेसिल ट्रांसफरेज (एफएनटी) KRAS4b में CAAX आकृति में सी-टर्मिनल साइस्टीन में फारनेसिल पायरोफॉस्फेट के अलावा उत्प्रेरक करता है। प्रीनिलेशन के बाद प्रोटीन की तस्करी एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) में की जाती है जहां रास परिवर्तित एंजाइम (आरसीई1) तीन सी-टर्मिनल अवशेषों को छोड़ देता है । प्रसंस्करण में अंतिम चरण ईआर झिल्ली प्रोटीन, आइसोफेनिलल मिथाइलट्रांसफरेसे (आईसीएमटी) द्वारा नए सी-टर्मिनल फारनेसिलासिस्टीन अवशेषों का मिथाइलेशन है। ई. कोलाई में पुनर्संयोजन KRAS4b की अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप एक असंशोधित प्रोटीन का उत्पादन होता है। प्रसंस्कृत KRAS4b का उत्पादन करने के पिछले प्रयास संरचनात्मक या दवा स्क्रीनिंग प्रयोगों के लिए अपर्याप्त पैदावार के कारण सीमित किए गए हैं या देशी पूर्ण लंबाई परिपक्व प्रोटीन13,14को फिर से तैयार करने में विफल रहे हैं । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक इंजीनियर baculovirus आधारित कीट कोशिका अभिव्यक्ति प्रणाली और शुद्धि विधि है कि अत्यधिक शुद्ध, पूरी तरह से प्रसंस्कृत KRAS4b सेल संस्कृति के 5 मिलीग्राम/एल की पैदावार पर उत्पन्न करता है का उपयोग करता है ।
संरचनात्मक जीव विज्ञान या दवा स्क्रीनिंग अध्ययन पर तैयार करने से पहले पुनर्संयोजन प्रोटीन की गुणवत्ता को मान्य करने के लिए सावधान प्रोटीन लक्षण वर्णन आवश्यक है। पूरी तरह से प्रसंस्कृत KRAS4b के दो प्रमुख मापदंडों सही prenyl संशोधन का सत्यापन और झिल्ली विकल्प या लिपिड के साथ बातचीत के लिए farnesylated और carboxymethylated सी-टर्मिनस (FMe) की उपलब्धता कर रहे हैं । KRAS4b-FMe के इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ईएसआई-एमएस) का उपयोग आणविक वजन को मापने और फारनेसिल और कार्बोक्सिमेथाइल संशोधनों की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए किया गया था। देशी द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री, जहां नमूनों को गैर-denaturing सॉल्वैंट्स के साथ छिड़काया जाता है, यह प्रदर्शित करने के लिए उपयोग किया जाता था कि KRAS4b-FMe भी अपने सकल घरेलू उत्पाद कोफैक्टर से बंधा हुआ था। अंत में, सतह प्लाज्मोन अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग स्थिर लिपोसोम के साथ KRAS4b-FMe के प्रत्यक्ष बंधन को मापने के लिए किया गया था।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>30211SS-1232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>850457</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>840034</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5427R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A998-1 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09689-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>ARUP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate 384</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore T200 Instrument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Snap-It Seals, T/S</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-54B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonic Bath</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-336-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation Exchange Chromatography (CEX) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018183</td>
			<td>HiPrep SP Sepharose High Performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyna Pro Plate Reader</td>
			<td>Wyatt Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exactive Plus EMR Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0507-500Ml</td>
			<td>Use Reagent Grade or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson vials 7x14 mm Tubes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass screw thread vials with PTFE foam liners</td>
			<td>Scientific Specialities</td>
			<td>B69302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed/benchtop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>05-112-114D</td>
			<td>capable of up to 4,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>92414</td>
			<td>Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9365-51</td>
			<td>HisPrep FF 16/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-House Water Supply, Arium Advance</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td></td>
			<td>Resistivity of 18 M&#937;0-cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid extruder set with holder</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI-DEWAR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M110-EH microfluidizer</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 &#197;, 2.1 x 150 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagTran software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC Grade</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>BDH20864.400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>78880002</td>
			<td>NGC QuestTM 100 Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Caps type 3</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series S Sensor Chip L1</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29104993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>13-400-519</td>
			<td>Absorbace at 280nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>PES membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima - L80K</td>
			<td>capable of 100,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733-1L</td>
			<td>May use in-house water source (see below)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter</td>
			<td>GE Healthcare - Whatman</td>
			<td>6994-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur QualBrowser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>proteomics software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein

प्रोटीन प्रीनिलेशन एक महत्वपूर्ण संशोधन है जो इंट्रासेलर झिल्ली के लिए प्रोटीन को लक्षित करने के लिए जिम्मेदार है। KRAS4b, जो मानव कैंसर के 22% में उत्परिवर्तित है, सी-टर्मिनस में 'सीएएएक्स' बॉक्स आकृति की उपस्थिति के कारण फारनेसिलेशन और कार्बोक्सीमेथिलेशन द्वारा संसाधित किया जाता है। कीट कोशिकाओं में फर्नेसेटेड और कार्बोक्यामेथिलेटेड KRAS4b को व्यक्त करने के लिए एक इंजीनियर बैगोवायरस सिस्टम का उपयोग किया गया था और पहले वर्णित किया गया है। यहां, हम प्रोटीन के विस्तृत, व्यावहारिक शुद्धिकरण और जैव रासायनिक लक्षण वर्णन का वर्णन करते हैं। विशेष रूप से, एकरूपता के लिए प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए आत्मीयता और आयन विनिमय क्रोमेटोग्राफी का उपयोग किया गया था। क्रास4बी के सही संशोधन को मान्य करने और न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग को सत्यापित करने के लिए बरकरार और देशी द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग किया गया था। अंत में, सतह प्लाज्मोन अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके फॉर्नेसिटेड और कार्बोक्सिमेथेलेटेड क्रास4बी के झिल्ली संघ को मापा गया।

प्रोटोकॉल में सबसे बड़े चरों में से एक व्यक्त लक्ष्य प्रोटीन (His6-MBP-tev-KRAS4b) की मात्रा है। यह प्रोटोकॉल एक ट्राइकोप्लसिया नी सेल लाइन, तनी-एफएनएल17से एक अलग का उपयोग करके विकसित किया गया था, जो निल?...

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Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

प्रीनिलेशन परिधीय झिल्ली बाध्यकारी प्रोटीन पर एक महत्वपूर्ण संशोधन है। कीट कोशिकाओं को मात्रा में फर्नेसेटेड और कार्बोक्सिमेथाइलेटेड KRAS4b का उत्पादन करने के लिए हेरफेर किया जा सकता है जो प्रोटीन-प्रोटीन और प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन के बायोफिजिकल माप को सक्षम करता है

पूरी तरह से संसाधित पुनः संयोजन KRAS4b: फरनेसेटेड और मेथाइलेटेड प्रोटीन को अलग और विशेषता

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

हमारा प्रोटोकॉल उच्च उपज पर ठीक से संसाधित KRAS के अलगाव और पृथक्करण के लिए अनुमति देता है। प्रामाणिक रूप से फारनेसिलेटेड और कार्बोक्सिमेथाइलेटेड केआरएएस का उत्पादन उन प्रयोगों को करना संभव बनाता है जिनकी झिल्ली में केआरएएस होता है जैसे स्तनधारी कोशिकाओं में। प्रोटोकॉल की उच्च उपज इसे पिछले काम से अलग सेट करता है।हम आम तौर पर अभिव्यक्ति सामग्री के प्रति लीटर प्रोटीन के तीन से पांच मिलीग्राम शुद्ध । यह हमें विभिन्न प्रकार के जैव भौतिक और संरचनात्मक जीव विज्ञान प्रयोगों का संचालन करने की अनुमति देता है। KRAS कैंसर के 20% और अग्नाशय के कैंसर में 90% में उत्परिवर्तित है।इसलिए प्रामाणिक रूप से प्रसंस्कृत प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए एक प्रोटोकॉल होना दवा स्क्रीन विकसित करने के लिए काफी उपयोगी है ताकि आप वास्तविक प्रोटीन का अध्ययन कर सकें क्योंकि यह कैंसर कोशिकाओं की झिल्ली पर होगा। यह प्रोटोकॉल अन्य प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए भी बहुत उपयोगी है जो फारनेसिलेटेड हैं और कोशिकाओं में पूरी तरह से संसाधित होते हैं। और जैसे, आपको बस इतना करना है कि ब्याज के प्रोटीन के साथ KRAS को स्वैप करें और इसे बाकुलोवायरस में डाल दें।महत्वपूर्ण कदम cation एक्सचेंज क्रोमेटोग्राफी के आसपास के हैं। उचित कॉलम का उपयोग करना और प्रोटीन कम नमक बफर में है समय सीमित सफलता के लिए आवश्यक हैं । समझ है कि वर्षा घटना के एक बर्फ ग्लोब प्रकार नहीं है प्रोटोकॉल के लिए उन नए मार्गदर्शन में मदद करता है ।यह कई छोटे भार में cation एक्सचेंज कॉलम लोड को विभाजित करने की आवश्यकता दिखाकर प्रबलित होता है। कोशिकाओं को lysing के बाद, lysate स्पष्ट, और IMAC द्वारा लक्ष्य प्रोटीन शुद्ध, एसडीएस पृष्ठ और Coomassie धुंधला का उपयोग कर प्रोटीन अंशों का विश्लेषण । पूल के अंशों पूल और चार डिग्री सेल्सियस पर बफर डी के दो लीटर के खिलाफ रात भर पूल डायलाइज़ ।अगले दिन, डायलिसिस से नमूना निकालें और किसी भी तेज़ी को हटाने के लिए 10 मिनट के लिए 4, 000 बार जी पर इसे अपकेंद्री करें। अंतिम डायलिज्ड और स्पष्ट नमूना अक्सर अभी भी धुंधला होता है लेकिन आगे की प्रक्रिया के बिना सीईएक्स कॉलम पर लागू किया जा सकता है। बफर जी के तीन कॉलम वॉल्यूम के साथ इसे धोकर 20 मिलीलीटर सट् शन एक्सचेंज कॉलम तैयार करें, फिर बफर एफ नेक्स्ट के तीन कॉलम वॉल्यूम के साथ, 20 मिलीलीटर डायलिज्ड सैंपल को 100 मिलीमोलर के अंतिम सोडियम क्लोराइड एकाग्रता में बफर ई के 20 मिलीलीटर जोड़कर और नमूना को एक्सचेंज कॉलम में लागू करें।यह एक बार में सभी के बजाय नमूने की छोटी राशि को कमजोर करने के लिए महत्वपूर्ण है और प्रोटीन की वर्षा को सीमित करने के लिए कमजोर पड़ने के तुरंत बाद पतला नमूनों को कॉलम में लागू किया जाना चाहिए। पिछले कमजोर पड़ने के रूप में हौसले से पतला नमूना के साथ कॉलम लोड करने के लिए जारी रखें लोड के अंत के पास । फिर कॉलम को बफर एफ के साथ बेसलाइन अवशोषण 280 में धोएं जिसमें आमतौर पर तीन कॉलम वॉल्यूम की आवश्यकता होती है।बफर एफ से 65% बफर जी तक 400 मिलीलीटर ढाल के साथ कॉलम से प्रोटीन को एल्यूट करें, छह मिलीलीटर अंशों में एल्यूटेंट एकत्र करें। एक बार ढाल पूरा हो जाने के बाद, 65% बफर जी के अतिरिक्त 1.5 कॉलम वॉल्यूम के लिए कॉलम को धोना जारी रखें, एसडी पेज और कूमासी ब्लू दाग विश्लेषण दोनों के साथ-साथ क्रोमेटोग्राम के यूवी ट्रेस के निरीक्षण के आधार पर सकारात्मक अंश चुनें। फिर प्रोटीन को पूल करें और पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार His6 TEV प्रोटीज़ के साथ इसे पचा लें।पाचन और डायलिसिस के बाद, प्रोटीन को 20 मिलीलीटर आईमैक कॉलम पर लोड करें जो बफर ए के साथ तीन मिलीलीटर प्रति मिनट पर है। इस क्रोमेटोग्राफी के दौरान सात मिलीलीटर अंश एकत्र करें और कॉलम को बफर ए के कुल तीन कॉलम वॉल्यूम के साथ धोएं या जब तक बेसलाइन अवशोषण नहीं हो जाता है। बफर सी के पांच कॉलम वॉल्यूम ग्रेडिएंट के साथ लक्ष्य प्रोटीन को 0% से 10% तक एल्यूट करें और सात मिलीलीटर अंश एकत्र करें।फिर एसडीएस पेज के साथ सकारात्मक अंशों की पहचान करें। एसडीएस पेज के साथ विश्लेषण किए जाने पर, स्पष्ट lysate में एक डार्क बैंड होना चाहिए जो लगभग 65 किलोडलटन में माइग्रेट होता है जो फ्यूजन प्रोटीन His6-MBP-tev-KRAS4b से मेल खाती है। सह-व्यक्त FNTAb ४८ किलोदलटन में प्रवास करता है ।शुद्धिकरण के भीतर CEX कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि यह प्रोटेओलिसिस की सीमा को कम करता है और पूरी तरह से प्रसंस्कृत प्रोटीन को समृद्ध करता है, लेकिन प्रोटोकॉल का सबसे जटिल हिस्सा है। इस चरण से एक विशिष्ट परिणाम KRAS4b-FMe के साथ एक प्रमुख चोटी तीन है, लेकिन elution प्रोफाइल चर हो सकता है । ESIMS का उपयोग कर बरकरार जन विश्लेषण प्रोटीन के सटीक आणविक द्रव्यमान की पुष्टि और इस तरह farnesylation या carboxymethylation के सापेक्ष अनुपात ।जबकि ठेठ अंतिम बहुत कुछ पता लगाने योग्य KRAS4b-FARN निहित है, इस अनुपात में इस विश्लेषण से पीक ऊंचाई के मामले में 15% से भी कम था । देशी जन विश्लेषण का उपयोग सकल घरेलू उत्पाद से बंधे KRAS4b के द्रव्यमान को निर्धारित करने के लिए किया गया था। नमूना विलायक को अमोनियम एसीटेट के लिए एक्सचेंज किया गया था ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि देशी परिसर को बरकरार रहने की अनुमति देने वाला नरम आयनीकरण हो।KRAS4b-FMe और लिपोसोम्स की बातचीत को सतह प्लाज्मन अनुनाद के साथ मापा गया था ताकि फारनेसिलेशन को मान्य किया जा सके और झिल्ली से बांधने के लिए KRAS4b-FMe के लिए कार्बोक्सीमेथाइलेशन की आवश्यकता होती है। जैसा कि उम्मीद थी, KRAS4b-FMe लिपोसोम्स से बंधे जबकि असंसाधित KRAS4b नहीं था। प्रोटीन कम नमक के संपर्क में आने के समय को कम करना प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण पहलू है जो उपज को प्रभावित करता है।प्रोटीन बफर ई में कमजोर पड़ने के बाद इस कम नमक एकाग्रता पर केवल संक्षेप में है प्रोटीन का उपयोग विभिन्न जैव भौतिक प्रयोगों के लिए किया जा सकता है जो लिपोसोम या नैनोडिस्क जैसे झिल्ली मिमेटिक्स का उपयोग करते हैं ताकि यह जांच की जा सके कि किस लिपिड केआरएएस के साथ बातचीत करता है। इन डेटा का उपयोग करके, हम एक्सट्रपलेशन करना शुरू कर सकते हैं कि कैसे KRAS सेल की प्लाज्मा झिल्ली के साथ बातचीत करता है। शुद्ध KRAS-FMe का उपयोग करके, हमारे सहकर्मी एक चैपरवन के साथ जटिल में KRAS की एक्स-रे क्रिस्टल संरचना को हल करने में सक्षम थे जो इस प्रोटीन के फारनेसिलेटेड और मिथाइलेटेड रूप के लिए विशिष्ट है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

तैयारी और सीरियल गुजरने क्रि लिए lipídic घन चरण में प्रोटीन microcrystals की डिलिवरी

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

एक संयुक्त दृष्टिकोण के लिए प्रकरण: संयोजक अर्चेअल Proteasomes और Nondenaturing पेज के साथ Proteasome विधानसभा की जांच

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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पाड़ Liposomes का उपयोग लिपिड-समीपस्थ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पुनर्गठित करने<em&gt; इन विट्रो</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

प्रोटीन संरचना और गतिशीलता के अध्ययन के लिए समय का समाधान electrospray ionization हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

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पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति, क्रिस्टलीकरण, और बायोफिजिकल स्टडीज ऑफ़ ए<em&gt; बेसिलस</em&gt; -अधिकृत न्यूक्लियोटाइड पाइरोफॉस्फोरियम, बीसीएमजीजी

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 में 1: प्रोटीन और प्रोटीन-Metabolite परिसरों के समानांतर विश्लेषण के लिए एक कदम संबध शुद्धि

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

प्रोटीन तह, परिवहन, और रेडियोधर्मी पल्स चेस द्वारा जीवित कोशिकाओं में क्षरण का विश्लेषण

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

पूरी तरह से स्वायत्त लक्षण वर्णन और जैविक Macromolecules के क्रिस्टल से डेटा संग्रह

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

आयन एक्सचेंज क्रोटोग्राफी (आईईईईएक्स) में प्रोटीन पृथक्करण और विशेषीकरण के लिए मल्टी-एंगल लाइट कैटरिंग (मलों) को युग्मित

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

इन्फ्रारेड नैनोस्पेक्ट्रोस्कोपी और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी द्वारा व्यक्तिगत प्रोटीन सकल की विशेषता

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...