Name: fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein
Uploaded: 2020-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein at JoVE.com

Riconosciamo il supporto della clonazione e dell'espressione di Carissa Grose, Jen Melhalko e Matt Drew nel Protein Expression Laboratory, Frederick National Laboratory for Cancer Research. Questo progetto è stato finanziato in tutto o in parte con fondi federali del National Cancer Institute, National Institutes of Health, sotto contratto n. HHSN261200800001E. Il contenuto di questa pubblicazione non riflette necessariamente le opinioni o le politiche del Dipartimento della Salute e dei Servizi Umani, né menziona nomi commerciali, prodotti commerciali o organizzazioni implicano l'approvazione da parte del governo degli Stati Uniti

1. Purificazione delle proteine
<ol><li>Preparare i buffer A–H, come illustrato nella tabella 1.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Soluzione buffer</td>
			<td>Agente di buffering (tutti i 20 mM)</td>
			<td>
pH
</td>
			<td>NaCl (mM)</td>
			<td>imidazolo (mM)</td>
			<td>MgCl2</td>
			<td>...

<ol>
	<li>Cox, A. D., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation:+more+than+just+glue.">Protein prenylation: more than just glue.</a> Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).</li><li>Zhang, F. L., Casey, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Prenylation:+Molecular+Mechanisms+and+Functional+Consequences.">Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).</li><li>Hottman, D. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation+and+synaptic+plasticity:+implications+for+Alzheimer's+disease.">Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease.</a> Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).</li><li>Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+and+cognition+in+neurodegenerative+disorders.">HDL and cognition in neurodegenerative disorders.</a> Neurobiology of Disease. 72, 22-36 (2014).</li><li>Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pleiotropic+effect+of+statins:+prevention+of+cardiac+hypertrophy+by+cholesterol-independent+mechanisms.">A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms.</a> Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).</li><li>Kohnke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPase+prenylation+hierarchy+and+its+potential+role+in+choroideremia+disease.">Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease.</a> PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).</li><li>Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+prenylation+for+cancer+therapy.">Targeting protein prenylation for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).</li><li>Kho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tagging-via-substrate+technology+for+detection+and+proteomics+of+farnesylated+proteins.">A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).</li><li>Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAAX+geranylgeranyl+transferase+transfers+farnesyl+as+efficiently+as+geranylgeranyl+to+RhoB.">CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).</li><li>Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dragging+ras+back+in+the+ring.">Dragging ras back in the ring.</a> Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+in+Membrane+Biochemistry+and+Biophysics.">Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics.</a> Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).</li><li>Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Step-by-step+Method+for+the+Reconstitution+of+an+ABC+Transporter+into+Nanodisc+Lipid+Particles.">A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).</li><li>Dementiev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-Ras4B+lipoprotein+synthesis:+biochemical+characterization,+functional+properties,+and+dimer+formation.">K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation.</a> Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+recombinant+human+Kirsten-ras+(4B)+p21+produced+at+high+levels+in+Escherichia+coli+and+insect+baculovirus+expression+systems.">Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).</li><li>Gillette, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Farnesylated+and+Methylated+Proteins+in+an+Engineered+Insect+Cell+System.">Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).</li><li>Agamasu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS+Prenylation+Is+Required+for+Bivalent+Binding+with+Calmodulin+in+a+Nucleotide-Independent+Manner.">KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner.</a> Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).</li><li>Talsania, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Assembly+and+Annotation+of+the+Trichoplusia+ni+Tni-FNL+Insect+Cell+Line+Enabled+by+Long-Read+Technologies.">Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies.</a> Genes. 10 (2), 79 (2019).</li><li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RAS+function+through+targeting+an+allosteric+regulatory+site.">Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site.</a> Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+polyisoprenylated+Ras+proteins+in+the+insect/baculovirus+system.">Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system.</a> Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).</li><li>Dharmaiaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+recognition+of+farnesylated+and+methylated+KRAS4b+by+PDE&#948;.">Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDE&#948;.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).</li><li>Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanism+of+drug/Lipid+membrane+interactions+using+Biacore.">Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore.</a> Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).</li><li>Fisher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interactions+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+with+oligonucleotides.">Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).</li><li>Lakshman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+biophysical+analysis+defines+key+components+modulating+recruitment+of+the+GTPase+KRAS+to+the+plasma+membrane.">Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).</li></ol>

Come indicato nella sezione Risultati rappresentativi, la fase più critica durante la purificazione è la gestione del campione durante il periodo in cui si trova nel sale inferiore. Limitare il tempo di esposizione del campione a meno di 200 mM NaCl contribuirà a ridurre le precipitazioni e ad aumentare la resa del campione. L'interpretazione dei risultati del CEX può essere difficile se il profilo non corrisponde alle aspettative (vedere figura 2). Fino a quando il protocollo non è div...

Le modifiche post-traduzionali svolgono un ruolo chiave nella definizione dell'attività funzionale delle proteine. Modifiche come il fosfororylazione e la glicosilazione sono ben consolidate. Le modifiche dei lipidi sono tuttavia meno ben caratterizzate. Si stima che per quanto 0.5% di tutte le proteine cellulari possono essere prenylated1. La presilazione è il trasferimento di un farnesyl di 15 carbonio o di una catena di lipidi geranilgeranyl a 20 carbonio a una proteina accettante contenente il motivo CAAX2. Proteine prenylated sono stati implicati nella progressione di diverse malattie umane tra cui l'invecchiamento precoce3, MorbodiAlzheimer 4 , disfunzione cardiaca5, chioderemia6, e cancro7. I piccoli GTPases, HRAS, NRAS e KRAS1, lamininine nucleari, e le cinetocori CENP-E e F sono proteine farnesylated sotto la condizione basale. Altri piccoli GTPases, vale a dire RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42 e RRAS sono geranilgeranylated8, mentre RhoB può essere farnesylated o geranylgeranylated9.
Il piccolo GTPase KRAS4b funziona come un interruttore molecolare, essenzialmente trasmettendo fattore di crescita extracellulare che segnala alle vie di trasduzione del segnale intracellulare che stimolano la crescita e la proliferazione cellulare, attraverso molteplici interazioni proteina-proteina. Ci sono due aspetti chiave della biochimica KRAS4b che sono essenziali per la sua attività. In primo luogo, le proteine si scatenano tra un PIL inattivo e uno stato legato gtP attivo in base al quale si impegna attivamente con gli effetti. In secondo luogo, una regione poli-lisina c-terminale e una cisteina farnesillaata e carboxymethylated indirizzano la proteina verso la membrana plasmatica, consentendo il reclutamento e l'attivazione di esedotti a valle. Il kraS4b mutante è un fattore oncogenico nel cancro del pancreas, del colon-retto e del polmone10e, come tale, l'intervento terapeutico avrebbe un enorme beneficio clinico. La produzione di proteine ricombinanti autenticamente modificate che è farnesilata e carboxymethylated consentirebbe lo screening biochimico utilizzando KRAS4b in combinazione con surrogati di membrana come liposomi o nanodischi lipidi11,12.
Farnesyl transferase (FNT) catalizza l'aggiunta di farnesil pirofosfato alla cisteina c-terminale nel motivo CAAX in KRAS4b. Dopo la prenylazione, la proteina viene trafficata al reticolo endoplasmico (ER) dove l'enzima di conversione del ras (RCE1) fende i tre residui del terminale C. L'ultima fase nella lavorazione è la metilazione del nuovo residuo di farnesylcysteine terminale C dalla proteina della membrana ER, isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase (ICMT). L'espressione di KRAS4b ricombinante in E. coli determina la produzione di una proteina non modificata. Precedenti tentativi di produrre KRAS4b elaborati sono stati limitati a causa di rese insufficienti per esperimenti di screening strutturale o farmacologico o non sono riusciti a ricapitolare la proteina matura nativa a lunghezza intera13,14. Il protocollo qui presentato utilizza un sistema di espressione delle cellule di insetti a base di baculovirus ingegnerizzato e un metodo di purificazione che genera KRAS4b altamente purificato e completamente elaborato a rese di 5 mg/L di coltura cellulare.
Un'attenta caratterizzazione delle proteine è essenziale per convalidare la qualità delle proteine ricombinanti prima di intraprendere studi di biologia strutturale o di screening farmacologico. Due parametri chiave di KRAS4b completamente elaborati sono la convalida della corretta modifica prenyl e la disponibilità del c-terminus (FMe) farnesylated e carboxymethylated (FMe) per l'interazione con i sostituti della membrana o i lipidi. La spettrometria di massa di ionizzazione elettrospray (ESI-MS) del KRAS4b-FMe è stata utilizzata per misurare il peso molecolare e confermare la presenza delle modifiche al farnesil e al carboxymethyl. La spettrometria di massa nativa, in cui i campioni sono spruzzati con solventi non incustoditi, è stata utilizzata per dimostrare che ANCHE KRAS4b-FMe era legato al suo cofattore del PIL. Infine, è stata utilizzata la spettroscopia per la risonanza del plasonanza superficiale per misurare il legame diretto di KRAS4b-FMe con liposomi immobilizzati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>30211SS-1232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>850457</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>840034</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5427R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A998-1 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09689-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>ARUP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate 384</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore T200 Instrument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Snap-It Seals, T/S</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-54B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonic Bath</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-336-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation Exchange Chromatography (CEX) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018183</td>
			<td>HiPrep SP Sepharose High Performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyna Pro Plate Reader</td>
			<td>Wyatt Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exactive Plus EMR Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0507-500Ml</td>
			<td>Use Reagent Grade or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson vials 7x14 mm Tubes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass screw thread vials with PTFE foam liners</td>
			<td>Scientific Specialities</td>
			<td>B69302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed/benchtop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>05-112-114D</td>
			<td>capable of up to 4,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>92414</td>
			<td>Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9365-51</td>
			<td>HisPrep FF 16/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-House Water Supply, Arium Advance</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td></td>
			<td>Resistivity of 18 M&#937;0-cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid extruder set with holder</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI-DEWAR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M110-EH microfluidizer</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 &#197;, 2.1 x 150 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagTran software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC Grade</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>BDH20864.400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>78880002</td>
			<td>NGC QuestTM 100 Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Caps type 3</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series S Sensor Chip L1</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29104993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>13-400-519</td>
			<td>Absorbace at 280nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>PES membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima - L80K</td>
			<td>capable of 100,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733-1L</td>
			<td>May use in-house water source (see below)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter</td>
			<td>GE Healthcare - Whatman</td>
			<td>6994-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur QualBrowser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>proteomics software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein

La prenilazione delle proteine è una modifica chiave che è responsabile del targeting delle proteine alle membrane intracellulari. KRAS4b, che è mutato nel 22% dei tumori umani, viene elaborato da farnesilazione e carboxymetilation a causa della presenza di un motivo scatola 'CAAX' al capolinea C. Un sistema di baculovirus ingegnerizzato è stato utilizzato per esprimere kraS4b farnesylated e carboxymethylated nelle cellule degli insetti ed è stato descritto in precedenza. Qui descriviamo la purificazione dettagliata e pratica e la caratterizzazione biochimica della proteina. In particolare, l'affinità e la cromatografia di scambio ioleomatico sono stati utilizzati per purificare la proteina per l'omogeneità. La spettrometria di massa intatta e nativa è stata utilizzata per convalidare la corretta modifica di KRAS4b e per verificare l'associazione dei nucleotidi. Infine, l'associazione della membrana di farnesylated e carboxymethylaed KRAS4b ai liposomi è stata misurata utilizzando la spettroscopia della risonanza del plasonanza del plasonco superficiale.

Una delle variabili più grandi nel protocollo è la quantità di proteina bersaglio espressa (His6-MBP-tev-KRAS4b). Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando un isolare da una linea cellulare Trichoplusia ni, Tni-FNL17, adattato per la crescita delle sospensioni e svezzato dal siero. Data l'ampia gamma di risultati riportati attraverso le varie linee di cellule di insetti con il sistema di espressione del baculovirus, è consigliabile che Tni-FNL venga utilizzato, almeno inizialm...

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Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

La prenilazione è una modifica importante sulle proteine che legano la membrana periferica. Le cellule degli insetti possono essere manipolate per produrre farnesylated e carboxymethylated KRAS4b in quantità che consentono misurazioni biofisiche delle interazioni proteina-proteina e proteina-lipidi

KRAS4b ricombinante completamente elaborato: isolamento e caratterizzazione delle proteine di Farnesylated e Metylated

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Il nostro protocollo consente l'isolamento e la separazione di KRAS correttamente elaborati ad alta resa. La produzione di KRAS autenticamente farnesilato e carbossimetilato consente di eseguire esperimenti che hanno KRAS nella loro membrana proprio come nelle cellule di mammifero. L'elevata resa del protocollo lo distingue dai lavori precedenti.In genere purifichiamo da tre a cinque milligrammi di proteine per litro di materiale di espressione. Questo ci permette di condurre una varietà di esperimenti di biologia biofisica e strutturale. KRAS è mutato nel 20% dei tumori e nel 90% nei tumori al pancreas.Quindi avere un protocollo per produrre proteine autenticamente lavorate è abbastanza utile per lo sviluppo di schermi di farmaci in modo da poter studiare la proteina reale come sarebbe sulla membrana delle cellule tumorali. Questo protocollo è anche molto utile per studiare altre proteine che sono farnesilate e completamente lavorate nelle cellule. E come tale, tutto ciò che devi fare è scambiare il KRAS con la proteina di interesse e metterlo nel baculovirus.I passaggi critici sono quelli intorno alla cromatografia di scambio di cationi. L'uso della colonna corretta e la limitazione del tempo in cui la proteina è in basso tampone di sale sono essenziali per il successo. Comprendere che le precipitazioni non sono un tipo di evento globo di neve aiuta a guidare le nuove al protocollo.Ciò è rafforzato mostrando la necessità di dividere il carico della colonna di scambio di cationi in più carichi più piccoli. Dopo aver liscicolato le cellule, chiarito il lisato e purificato la proteina bersaglio da IMAC, analizzare le frazioni proteiche utilizzando la pagina SDS e la colorazione Coomassie. Mettere in comune le frazioni di picco e dializzare la piscina durante la notte contro due litri di tampone D a quattro gradi Celsius.Il giorno successivo, rimuovere il campione dalla dialisi e centrifugarlo a 4.000 volte g per 10 minuti per rimuovere qualsiasi precipitato. Il campione finale dializzato e chiarificato è spesso ancora nebuloso ma può essere applicato alla colonna CEX senza ulteriori elaborazioni. Preparare una colonna di scambio di cationi da 20 millilitri lavarla con tre volumi di colonna di tampone G, quindi con tre volumi di colonna di tampone F.Next, diluire 20 millilitri del campione dializzato a una concentrazione finale di cloruro di sodio di 100 millimolare aggiungendo 20 millilitri del tampone E e applicare il campione alla colonna di scambio.È fondamentale diluire la piccola quantità del campione invece di tutto in una volta e i campioni diluiti devono essere applicati alla colonna immediatamente dopo la diluizione per limitare la precipitazione della proteina. Continuare a caricare la colonna con campione appena diluito mentre la diluizione precedente si avvicina alla fine del carico. Quindi lavare la colonna fino all'assorbanza di base 280 con buffer F che in genere richiede tre volumi di colonna.Eludere la proteina dalla colonna con un gradiente di 400 millilitri dal tampone F al 65% tampone G, raccogliendo l'eluente in sei frazioni millilitri. Una volta completata la sfumatura, continuare a lavare la colonna per ulteriori volumi di 1,5 colonne del 65% tampone G.Scegliere le frazioni positive in base sia alla pagina SDS che all'analisi della macchia Blu Coomassie, nonché l'ispezione della traccia UV del cromatogramma. Quindi mettere in comune la proteina e digerirla con la proteasi His6 TEV secondo le indicazioni manoscritte.Dopo la digestione e la dialisi, caricare la proteina su una colonna IMAC da 20 millilitri equilibrata con tampone A a tre millilitri al minuto. Raccogliere sette frazioni millilitri durante questa cromatografia e lavare la colonna con un totale di tre volumi di colonna del tampone A o fino al raggiungere l'assorbanza di base. Elute la proteina bersaglio con un gradiente di volume di cinque colonne del tampone C dallo 0% al 10% e raccogliere sette frazioni di millilitro.Quindi identificare le frazioni positive con la pagina SDS. Se analizzato con la pagina SDS, il lysate chiarificato dovrebbe contenere una banda scura che migra a circa 65 kilodalton che corrisponde alla proteina di fusione His6-MBP-tev-KRAS4b. L'FNTAb co-espresso migra a 48 kilodalton.Il passaggio CEX all'interno della purificazione è fondamentale perché riduce l'estensione della proteolisi e arricchisce la proteina completamente lavorata, ma è la parte più complicata del protocollo. Un risultato tipico di questo passaggio ha un picco prominente tre con kras4b-FMe, ma i profili di eluizione possono essere variabili. L'analisi di massa intatta con ESIMS conferma la massa molecolare precisa delle proteine e quindi la proporzione relativa di farnesilazione o carbossimetilazione.Mentre i lotti finali tipici contenevano alcuni KRAS4b-FARN rilevabili, questa proporzione era inferiore al 15% in termini di altezza di picco da questa analisi. L'analisi di massa nativa è stata utilizzata per determinare la massa del KRAS4b legato al PIL. Il solvente campione è stato sostituito con acetato di ammonio per garantire una ionizzazione più morbida che consente al complesso nativo di rimanere intatto.L'interazione di KRAS4b-FMe e liposomi è stata misurata con la risonanza plasmonica superficiale per convalidare la farnesilazione e la carbossimetilazione sono necessarie affinché KRAS4b-FMe si leghi alle membrane. Come previsto, KRAS4b-FMe è legato ai liposomi mentre KRAS4b non è stato processo. Ridurre al minimo il tempo in cui la proteina è esposta a basso sale è il singolo aspetto più critico del protocollo che influisce sulla resa.La proteina è solo brevemente a questa bassa concentrazione di sale a seguito della diluizione nel tampone E.La proteina può essere utilizzata per una varietà di esperimenti biofisici che usano mimetici di membrana come liposomi o nanodisc per indagare con quali lipidi kras interagisce. Usando questi dati, possiamo iniziare a estrapolare il modo in cui KRAS interagisce con la membrana plasmatica della cellula. Utilizzando KRAS-FMe purificato, i nostri colleghi sono stati in grado di risolvere la struttura cristallina a raggi X di KRAS in complesso con un chaperone specifico per la forma farnesilata e metilata di questa proteina.

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