Name: fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein
Uploaded: 2020-01-16T14:00:00
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우리는 카리사 그로스, 젠 멜할코, 맷 드류의 복제 및 발현 지원을 암 연구를 위한 프레드릭 국립 연구소의 단백질 발현 실험실에서 인정합니다. 이 프로젝트는 계약 번호에 따라 국립 암 연구소, 국립 보건원에서 연방 기금의 전체 또는 일부를 지원되었습니다. HHSN261200800001E. 이 출판물의 내용은 반드시 보건 복지부의 견해 나 정책을 반영하지 않으며, 미국 정부의 승인을 의미하지 는 않으며, 상품, 상업 제품 또는 조직에 대한 언급은 없습니다.

1. 단백질 정제
<ol><li>표 1과같이 버퍼 A-H를 준비합니다.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>버퍼 솔루션</td>
			<td>버퍼링 에이전트(전체 20mM)</td>
			<td>
pH
</td>
			<td>나클 (mM)</td>
			<td>이미다졸 (mM)</td>
			<td>MgCl2</td>
			<td>
TCE</strong...

<ol>
	<li>Cox, A. D., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation:+more+than+just+glue.">Protein prenylation: more than just glue.</a> Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).</li><li>Zhang, F. L., Casey, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Prenylation:+Molecular+Mechanisms+and+Functional+Consequences.">Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).</li><li>Hottman, D. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation+and+synaptic+plasticity:+implications+for+Alzheimer's+disease.">Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease.</a> Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).</li><li>Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+and+cognition+in+neurodegenerative+disorders.">HDL and cognition in neurodegenerative disorders.</a> Neurobiology of Disease. 72, 22-36 (2014).</li><li>Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pleiotropic+effect+of+statins:+prevention+of+cardiac+hypertrophy+by+cholesterol-independent+mechanisms.">A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms.</a> Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).</li><li>Kohnke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPase+prenylation+hierarchy+and+its+potential+role+in+choroideremia+disease.">Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease.</a> PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).</li><li>Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+prenylation+for+cancer+therapy.">Targeting protein prenylation for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).</li><li>Kho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tagging-via-substrate+technology+for+detection+and+proteomics+of+farnesylated+proteins.">A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).</li><li>Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAAX+geranylgeranyl+transferase+transfers+farnesyl+as+efficiently+as+geranylgeranyl+to+RhoB.">CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).</li><li>Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dragging+ras+back+in+the+ring.">Dragging ras back in the ring.</a> Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+in+Membrane+Biochemistry+and+Biophysics.">Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics.</a> Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).</li><li>Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Step-by-step+Method+for+the+Reconstitution+of+an+ABC+Transporter+into+Nanodisc+Lipid+Particles.">A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).</li><li>Dementiev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-Ras4B+lipoprotein+synthesis:+biochemical+characterization,+functional+properties,+and+dimer+formation.">K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation.</a> Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+recombinant+human+Kirsten-ras+(4B)+p21+produced+at+high+levels+in+Escherichia+coli+and+insect+baculovirus+expression+systems.">Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).</li><li>Gillette, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Farnesylated+and+Methylated+Proteins+in+an+Engineered+Insect+Cell+System.">Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).</li><li>Agamasu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS+Prenylation+Is+Required+for+Bivalent+Binding+with+Calmodulin+in+a+Nucleotide-Independent+Manner.">KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner.</a> Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).</li><li>Talsania, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Assembly+and+Annotation+of+the+Trichoplusia+ni+Tni-FNL+Insect+Cell+Line+Enabled+by+Long-Read+Technologies.">Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies.</a> Genes. 10 (2), 79 (2019).</li><li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RAS+function+through+targeting+an+allosteric+regulatory+site.">Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site.</a> Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+polyisoprenylated+Ras+proteins+in+the+insect/baculovirus+system.">Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system.</a> Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).</li><li>Dharmaiaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+recognition+of+farnesylated+and+methylated+KRAS4b+by+PDE&#948;.">Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDE&#948;.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).</li><li>Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanism+of+drug/Lipid+membrane+interactions+using+Biacore.">Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore.</a> Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).</li><li>Fisher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interactions+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+with+oligonucleotides.">Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).</li><li>Lakshman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+biophysical+analysis+defines+key+components+modulating+recruitment+of+the+GTPase+KRAS+to+the+plasma+membrane.">Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).</li></ol>

대표 결과 섹션에서 언급한 바와 같이, 정제 시 가장 중요한 단계는 낮은 염분에 있는 시간 동안 시료의 취급이다. 시료가 200mM 미만NaCl에 노출되는 시간을 제한하면 강수량을 줄이고 샘플 수율을 높일 수 있습니다. 프로파일이 예상과 일치하지 않는 경우 CEX의 결과를 해석하기 어려울 수 있습니다(그림 2참조). 프로토콜이 일상화될 때까지, 앞으로 이동되지 않는 CEX 용출 분?...

번역 후 변형은 단백질의 기능적 활성을 정의하는 데 중요한 역할을 합니다. 인산화 및 당화와 같은 변형은 잘 확립됩니다. 지질 수정은 덜 잘 특징입니다, 그러나. 모든 세포 단백질의 0.5%가1. 전조는 CAAX 모티프2를함유하는 수용자 단백질로 15탄소 파네실 또는 20탄소 제라닐라닐 지질 사슬을 전달하는 것입니다. 조기 노화3,알츠하이머4,심장 기능 장애5,중증 혈증6,암7을포함한 여러 인간 질병의 진행에 전산 단백질이 연루되어 있다. 작은 GTPases, HRAS, NRAS 및 KRAS1,핵 라미닌, 및 키네토초레 CENP-E 및 F는 기초 조건 하에서 farnesylated 단백질입니다. 다른 작은 GTPas, 즉 로아, 로C, Rac1, cdc-42 및 RRAS는 제라냐게니라니어8,반면 로브는 farnesylated 또는 제라뉴어니어9 .
작은 GTPase KRAS4b분자 스위치로 기능, 본질적으로 세포 내 성장 인자 신호 세포 성장 및 확산을 자극 하는 세포 내 신호 전달 경로 전송, 여러 단백질-단백질 상호 작용을 통해. KRAS4b 생화학의 활동에 필수적인 두 가지 주요 측면이 있습니다. 첫째, 단백질은 비활성 GDP와 활성 GTP 경계 상태 사이의 주기로 이펙터와 적극적으로 관여합니다. 둘째, C 말단 폴리리신 영역과 원거리 및 카르복시스테인이 단백질을 혈장 막으로 유도하여 하류 이펙터의 모집 및 활성화를 가능하게 한다. 돌연변이 KRAS4b는 췌장, 대장암 및 폐암10의내인성 동인이며, 이와 같이 치료적 개입은 엄청난 임상적 이점을 가질 것이다. 원거리 및 카르복시메틸화된 본성 변형 재조합 단백질의 생산은 리포좀 또는 지질나노디스크(11,12)와같은 막 대리체와 조합하여 KRAS4b를 이용한 생화학적 스크리닝을 가능하게 할 것이다.
파네실 트랜스퍼라제(FNT)는 KRAS4b의 CAAX 모티프에서 C 말단 시스테인에 파네실 파이로포스페이트를 첨가하는 촉매제. prenylation 후, 단백질은 Ras 변환 효소 (RCE1)가 3개의 C 말단 잔기를 절단하는 안구 성 망막 (ER)으로 인신매매됩니다. 처리의 마지막 단계는 ER 막 단백질에 의한 새로운 C 말단 파네실시스테인 잔기의 메틸화, 이소프렌시스테인 카르복실 메틸트랜스퍼라제(ICMT)이다. 대장균에서 재조합KRAS4b의 발현은 변형되지 않은 단백질의 생산을 초래한다. 이전에는 처리된 KRAS4b를 생산하려는 시도가 구조적 또는 약물 스크리닝 실험에 대한 수율이 부족하여 제한되었거나 네이티브 전체 길이 성숙단백질(13,14)을재량화하지 못했다. 여기에 제시된 프로토콜은 세포 배양의 5 mg/L의 수율에서 고도로 정제되고 완전히 처리된 KRAS4b를 생성하는 엔지니어링된 바쿨로바이러스 기반 곤충 세포 발현 시스템 및 정제 방법을 이용한다.
신중한 단백질 특성화는 구조 생물학 또는 약물 스크리닝 연구에 착수하기 전에 재조합 단백질의 품질을 검증하는 데 필수적입니다. 완전히 처리된 KRAS4b의 두 가지 주요 파라미터는 막 대용품 또는 지질과의 상호 작용을 위한 올바른 프레닐 변형 및 카르복시내화 C-종단(FMe)의 가용성검증이다. KRAS4b-FMe의 전기 분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS)은 분자량을 측정하고 파네실 및 카르복시메틸 변형의 존재를 확인하기 위해 사용되었다. 시료가 비분폐 용매로 분무되는 네이티브 질량 분석법은 KRAS4b-FMe가 GDP 보조 인자에 묶여 있음을 입증하는 데 사용되었습니다. 마지막으로, 표면 플라스몬 공명 분광법은 고정된 리포솜을 이용한 KRAS4b-FMe의 직접 결합을 측정하는데 사용되었다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>30211SS-1232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>850457</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>840034</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5427R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A998-1 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09689-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>ARUP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate 384</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore T200 Instrument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Snap-It Seals, T/S</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-54B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonic Bath</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-336-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation Exchange Chromatography (CEX) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018183</td>
			<td>HiPrep SP Sepharose High Performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyna Pro Plate Reader</td>
			<td>Wyatt Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exactive Plus EMR Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0507-500Ml</td>
			<td>Use Reagent Grade or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson vials 7x14 mm Tubes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass screw thread vials with PTFE foam liners</td>
			<td>Scientific Specialities</td>
			<td>B69302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed/benchtop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>05-112-114D</td>
			<td>capable of up to 4,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>92414</td>
			<td>Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9365-51</td>
			<td>HisPrep FF 16/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-House Water Supply, Arium Advance</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td></td>
			<td>Resistivity of 18 M&#937;0-cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid extruder set with holder</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI-DEWAR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M110-EH microfluidizer</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 &#197;, 2.1 x 150 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagTran software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC Grade</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>BDH20864.400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>78880002</td>
			<td>NGC QuestTM 100 Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Caps type 3</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series S Sensor Chip L1</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29104993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>13-400-519</td>
			<td>Absorbace at 280nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>PES membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima - L80K</td>
			<td>capable of 100,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733-1L</td>
			<td>May use in-house water source (see below)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter</td>
			<td>GE Healthcare - Whatman</td>
			<td>6994-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur QualBrowser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>proteomics software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein

단백질 prenylation는 세포내 막에 단백질을 표적으로 하는 책임 있는 중요한 수정입니다. 인간 암의 22%에서 돌연변이되는 KRAS4b는 C-종단에 'CAAX' 박스 모티프가 존재하기 때문에 패네실화와 카르복시메틸화에 의해 처리됩니다. 엔지니어링 된 바쿨로 바이러스 시스템은 곤충 세포에서 farnesylated 및 카르복시 메틸화 KRAS4b를 발현하는 데 사용되었으며 이전에 설명되었습니다. 여기서, 우리는 단백질의 상세하고 실용적인 정제 및 생화학적 특성을 설명합니다. 구체적으로, 친화성 및 이온 교환 크로마토그래피는 균질성으로 단백질을 정제하는 데 사용되었다. 손상되지 않은 네이티브 질량 분석법은 KRAS4b의 올바른 변형을 검증하고 뉴클레오티드 결합을 검증하기 위해 사용되었다. 마지막으로, 피네시레이트 및 카르복시메틸화된 KRAS4b의 막 체내를 리포솜으로 표면 플라스몬 공명 분광법을 사용하여 측정하였다.

프로토콜에서 가장 큰 변수 중 하나는 발현된 표적 단백질의 양(His6-MBP-tev-KRAS4b)이다. 이 프로토콜은 트리코플러스니아 ni 세포주, Tni-FNL17로부터분리된 것을 이용하여 개발되었으며, 현탁액 성장에 적합하고 혈청으로부터 제거되었다. 바쿨로바이러스 발현 시스템을 통해 다양한 곤충 세포주전반에 걸쳐 보고된 광범위한 결과를 감안할 때, 적어도 초기에는 KRAS4b-FMe를 생산?...

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Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

전조는 말초 막 결합 단백질에 대한 중요한 변형입니다. 곤충 세포는 단백질 단백질과 단백질 지질 상호 작용의 생물 물리학 측정을 가능하게 하는 양으로 farnesylated 및 carboxymethylated KRAS4b를 생성하기 위하여 조작될 수 있습니다

완전히 가공된 재조합 KRAS4b: 판자및 메틸화 단백질을 분리하고 특성화

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

우리의 프로토콜은 높은 수율에서 제대로 처리 된 KRAS의 격리 및 분리를 허용합니다. 정통 farnesylated 및 carboxymethylated KRAS의 생산은 포유류 세포에서와 같이 그들의 막에 KRAS가 있는 실험을 능력을 발휘할 수 있게 합니다. 프로토콜의 높은 수율은 이전 작업과 차별화됩니다.우리는 일반적으로 발현 물질의 리터 당 단백질의 3 ~ 5 밀리 그램을 정화. 이를 통해 다양한 생물물리학 및 구조 생물학 실험을 수행할 수 있습니다. KRAS는 암의 20%와 췌장암에서 90%에서 돌연변이됩니다.따라서 진정으로 가공된 단백질을 생산하는 프로토콜을 갖는 것은 암세포의 막에 있을 때와 같이 실제 단백질을 연구할 수 있도록 약물 스크린 개발에 매우 유용합니다. 이 프로토콜은 또한 세포에서 파네산되고 완전히 가공되는 그밖 단백질을 공부하기 위한 아주 유용합니다. 그리고 따라서, 당신이해야 할 모든 관심의 단백질로 KRAS를 교환하고 바쿨로 바이러스에 넣어.중요한 단계는 양이온 교환 크로마토그래피 주변의 단계입니다. 적절한 컬럼을 사용하고 단백질이 낮은 소금 완충제에 있는 시간을 제한하는 것은 성공을 위해 필수적입니다. 강수량이 스노우 글로브 유형의 이벤트가 아니라는 것을 이해하면 새로운 프로토콜을 안내하는 데 도움이됩니다.이는 양이온 교환 열 부하를 여러 개의 더 작은 하중으로 나눌 필요성을 보여 줌으로써 강화됩니다. 세포를 용해하고, 용해물을 명확히 하고, IMAC에 의한 표적 단백질을 정화한 후, SDS 페이지와 쿠마시 염색을 사용하여 단백질 분획을 분석한다. 피크 분획을 풀링하고 섭씨 4도에서 버퍼 D 2리터에 대해 밤새 수영장을 투석합니다.다음 날, 투석에서 샘플을 제거하고 10 분 동안 4, 000 배 g에서 원심 분리하여 침전을 제거하십시오. 최종 투석 및 명확한 샘플은 여전히 흐릿하지만 추가 처리 없이 CEX 컬럼에 적용할 수 있습니다. 버퍼 G의 세 컬럼 부피로 세척하여 20 밀리리터 양이온 교환 열을 준비한 다음, 3개의 열 부피의 완충F.Next로, 20밀리리터의 최종 염화나트륨 농도를 100 밀리미터의 최종 염화나트륨 농도로 희석하고 샘플을 교환 열에 적용한다.소량의 시료를 한 번에 희석하는 것이 중요하며 희석 후 즉시 컬럼에 도포하여 단백질의 강수량을 제한하는 것이 중요합니다. 이전 희석이 부하 끝에 가까워지면 새로 희석된 샘플로 컬럼을 계속 로드합니다. 그런 다음 일반적으로 세 개의 열 볼륨이 필요한 버퍼 F로 컬럼을 기준용량(280)으로 세척합니다.버퍼 F에서 65%의 완충제 G까지 400 밀리리터 그라데이션으로 컬럼에서 단백질을 엘테하여 6밀리리터 분획으로 용액을 수집합니다. 그라데이션이 완료되면, 65%버퍼 G.의 추가 1.5 컬럼 볼륨에 대한 열을 계속 세척하여 SDS 페이지와 쿠마시 블루 얼룩 분석과 크로마토그램의 UV 추적 검사를 기반으로 양극분획을 선택합니다. 그런 다음 단백질을 풀과 원고 방향에 따라 His6 TEV 프로테아프로 소화합니다.소화 및 투석 후, 단백질을 분당 3밀리리터로 버퍼 A로 평가한 20 밀리리터 IMAC 컬럼에 적재합니다. 이 크로마토그래피 동안 7밀리리터 분획을 수집하고 총 3개의 열 버퍼 A로 또는 기준선 흡수도에 도달할 때까지 컬럼을 세척합니다. 완충 C의 5개의 컬럼 부피 그라데이션을 0%에서 10%로 조정하고 7밀리리터 분획을 수집합니다.그런 다음 SDS 페이지를 통해 양수 분수를 식별합니다. SDS 페이지로 분석할 때, 명확한 용액에는 융합 단백질 His6-MBP-tev-KRAS4b에 해당하는 약 65킬로달톤으로 이동하는 어두운 밴드가 포함되어야 합니다. 공동 표현된 FNTAb는 48킬로달톤으로 이동합니다.정제 내의 CEX 단계는 프로테오시스의 범위를 감소시키고 완전히 가공된 단백질을 풍부하게 하기 때문에 중요하지만 프로토콜의 가장 복잡한 부분입니다. 이 단계의 일반적인 결과는 KRAS4b-FMe를 가진 눈에 띄는 피크 3이 있지만 용출 프로파일은 가변적일 수 있습니다. ESIMS를 이용한 온전한 질량 분석은 단백질의 정확한 분자 질량을 확인하고 이에 의해 파네실화 또는 카박스티메틸화의 상대적 비율을 확인한다.일반적인 최종 제비는 일부 검출 가능한 KRAS4b-FARN을 포함 하는 동안, 이 비율은 미만 15%이 분석에서 피크 높이 측면에서. 네이티브 질량 분석은 GDP에 바인딩 된 KRAS4b의 질량을 결정하는 데 사용되었다. 샘플 용매는 아세테이트 암모늄으로 교환되어 원어민 복합체가 그대로 유지될 수 있도록 부드러운 이온화를 보장하였다.KRAS4b-FMe및 리포솜의 상호 작용은 KRAS4b-FMe가 멤브레인에 결합하기 위해 필요한 파네실화 및 카박스티메틸화를 검증하기 위해 표면 플라스몬 공명으로 측정되었다. 예상대로, KRAS4b-FMe는 리포솜에 묶여 있었고, 처리되지 않은 KRAS4b는 그렇지 않았다. 단백질이 낮은 소금에 노출되는 시간을 최소화하는 것은 수율에 영향을 미치는 프로토콜의 가장 중요한 단일 측면입니다.단백질은 완충E의 희석 에 이어이 낮은 염 농도에서 간단히 단백질은 LIPosomes 또는 나노 디스크와 같은 막 모방을 사용하여 KRAS가 상호 작용하는 지질을 조사하는 다양한 생물 물리 학적 실험에 사용될 수 있습니다. 이러한 데이터를 사용하여 KRAS가 세포의 혈장 막과 상호 작용하는 방법을 추정하기 시작할 수 있습니다. 정제 된 KRAS-FMe를 사용하여, 우리의 동료는이 단백질의 farnesylated 및 메틸화 된 형태에 특정 된 chaperone와 복합체에서 KRAS의 엑스레이 결정 구조를 해결할 수 있었다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

준비 및 직렬 펨토초 결정학에 대한 지질 큐빅 단계에서 단백질 미세 배달

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

연구

생화학

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

재조합 고세균 프로 테아과 비 변성 페이지로 프로 테아 조립 검사 : 케이스를 결합 접근에 대한

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

재조합 단백질 발현, 결정화 및 생물 물리학 연구<em&gt; 바실러스</em&gt; 보존 된 뉴클레오티드 피로 인산화 효소, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

단백질 폴딩, 전송, 및 방사성 펄스 체이스 하 여 살아있는 세포의 저하의 분석

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

완전히 자치 특성화 및 생물학 고분자의 결정에서 데이터 수집

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

단백질 분리 및 특성에 대 한 다 각 산란 (MALS)를 결합 하는 이온 교환 크로마토그래피 (전류 구동)

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

적외선 나노 스펙트로펙트 및 원자력 현미경으로 개별 단백질 응집체 특성화

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...