Name: fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein
Uploaded: 2020-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein at JoVE.com

Vi erkjenner kloning og uttrykk støtte fra Carissa Grose, Jen Melhalko, og Matt Drew i protein Expression laboratorium, Frederick National laboratorium for Cancer Research. Dette prosjektet har vært finansiert helt eller delvis med Federal midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, under kontrakt nr. HHSN261200800001E. Innholdet i denne publikasjonen reflekterer ikke nødvendigvis synspunktene eller policyene til Department of Health and Human Services, og heller ikke omtale av varenavn, kommersielle produkter eller organisasjoner innebærer godkjennelse fra amerikanske myndigheter

1. protein rensing
<ol><li>Klargjør buffere A – H, som vist i tabell 1.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Buffer løsning</td>
			<td>Bufring agent (alle 20 mM)</td>
			<td>
pH
</td>
			<td>NaCl (mM)</td>
			<td>imidazole (mM)</td>
			<td>MgCl2</td>
			<td>
TCEP</st...

<ol>
	<li>Cox, A. D., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation:+more+than+just+glue.">Protein prenylation: more than just glue.</a> Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).</li><li>Zhang, F. L., Casey, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Prenylation:+Molecular+Mechanisms+and+Functional+Consequences.">Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).</li><li>Hottman, D. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation+and+synaptic+plasticity:+implications+for+Alzheimer's+disease.">Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease.</a> Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).</li><li>Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+and+cognition+in+neurodegenerative+disorders.">HDL and cognition in neurodegenerative disorders.</a> Neurobiology of Disease. 72, 22-36 (2014).</li><li>Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pleiotropic+effect+of+statins:+prevention+of+cardiac+hypertrophy+by+cholesterol-independent+mechanisms.">A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms.</a> Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).</li><li>Kohnke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPase+prenylation+hierarchy+and+its+potential+role+in+choroideremia+disease.">Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease.</a> PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).</li><li>Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+prenylation+for+cancer+therapy.">Targeting protein prenylation for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).</li><li>Kho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tagging-via-substrate+technology+for+detection+and+proteomics+of+farnesylated+proteins.">A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).</li><li>Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAAX+geranylgeranyl+transferase+transfers+farnesyl+as+efficiently+as+geranylgeranyl+to+RhoB.">CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).</li><li>Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dragging+ras+back+in+the+ring.">Dragging ras back in the ring.</a> Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+in+Membrane+Biochemistry+and+Biophysics.">Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics.</a> Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).</li><li>Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Step-by-step+Method+for+the+Reconstitution+of+an+ABC+Transporter+into+Nanodisc+Lipid+Particles.">A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).</li><li>Dementiev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-Ras4B+lipoprotein+synthesis:+biochemical+characterization,+functional+properties,+and+dimer+formation.">K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation.</a> Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+recombinant+human+Kirsten-ras+(4B)+p21+produced+at+high+levels+in+Escherichia+coli+and+insect+baculovirus+expression+systems.">Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).</li><li>Gillette, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Farnesylated+and+Methylated+Proteins+in+an+Engineered+Insect+Cell+System.">Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).</li><li>Agamasu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS+Prenylation+Is+Required+for+Bivalent+Binding+with+Calmodulin+in+a+Nucleotide-Independent+Manner.">KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner.</a> Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).</li><li>Talsania, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Assembly+and+Annotation+of+the+Trichoplusia+ni+Tni-FNL+Insect+Cell+Line+Enabled+by+Long-Read+Technologies.">Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies.</a> Genes. 10 (2), 79 (2019).</li><li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RAS+function+through+targeting+an+allosteric+regulatory+site.">Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site.</a> Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+polyisoprenylated+Ras+proteins+in+the+insect/baculovirus+system.">Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system.</a> Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).</li><li>Dharmaiaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+recognition+of+farnesylated+and+methylated+KRAS4b+by+PDE&#948;.">Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDE&#948;.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).</li><li>Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanism+of+drug/Lipid+membrane+interactions+using+Biacore.">Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore.</a> Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).</li><li>Fisher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interactions+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+with+oligonucleotides.">Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).</li><li>Lakshman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+biophysical+analysis+defines+key+components+modulating+recruitment+of+the+GTPase+KRAS+to+the+plasma+membrane.">Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).</li></ol>

Som nevnt i representative resultater delen, det mest kritiske trinnet under rensing er håndteringen av prøven i løpet av den tiden det er i lavere salt. Begrense tiden som prøven er utsatt for mindre enn 200 mM NaCl vil bidra til å redusere nedbør og øke sample yield. Tolkning av resultatene av CEX kan være vanskelig hvis profilen ikke samsvarer med forventningene (se figur 2). Inntil protokollen har blitt rutine, er det anbefalt at CEX eluering fraksjoner som ikke er tatt frem lagr...

Posttranslational modifikasjoner spiller en nøkkelrolle i å definere funksjonell aktivitet av proteiner. Modifikasjoner som fosforylering og glykosylering er godt etablert. Lipid modifikasjoner er mindre godt karakterisert, men. Det anslås at så mye som 0,5% av alle cellulære proteiner kan være prenylated1. Prenylation er overføring av en 15-karbon farnesylpyrofosfat eller en 20-karbon geranylgeranyl lipid kjede til et Acceptor protein som inneholder CAAX motiv2. Prenylated proteiner har vært innblandet i utviklingen av flere menneskelige sykdommer, inkludert prematur aldring3, Alzheimers4, CARDIAC dysfunksjon5, choroideremia6, og kreft7. De små GTPases, HRAS, NRAS, og KRAS1, Nuclear laminins, og kinetochores CENP-E og F er farnesylated proteiner under basal tilstand. Andre små GTPases, nemlig RhoA, RhoC, Rac1, CDC-42, og RRAS er geranylgeranylated8, mens RhoB kan være farnesylated eller geranylgeranylated9.
Den lille GTPase KRAS4b fungerer som en molekylær bryter, hovedsakelig sender ekstracellulære vekstfaktor signalering for å intracellulære signal Transduction trasé som stimulerer cellevekst og spredning, via flere protein-protein interaksjoner. Det er to viktige aspekter av KRAS4b biokjemi som er avgjørende for sin aktivitet. For det første, proteinet sykluser mellom en inaktiv BNP og en aktiv GTP bundet stat der den aktivt engasjerer med effekt Orer. For det andre, en C-terminal Poly-lysin-regionen og en farnesylated og carboxymethylated cystein direkte proteinet til plasma membranen, slik at rekruttering og aktivering av nedstrøms effekt Orer. Mutant KRAS4b er en kreftfremkallende driver i bukspyttkjertelen, tykk og lungekreft10, og som sådan, terapeutisk intervensjon ville ha en stor klinisk nytte. Produksjon av autentisk modifisert rekombinant protein som er farnesylated og carboxymethylated ville muliggjøre biokjemiske screening ved hjelp av KRAS4b i kombinasjon med membran surrogater som liposomer eller lipid nanodiscs11,12.
Farnesylpyrofosfat glutamyltransferase (FNT) katalyserer tillegg av farnesylpyrofosfat geranylpyrofosfat til C-terminal cystein i CAAX-motivet i KRAS4b. Etter prenylation er proteinet trafikkert til endoplasmatiske retikulum (ER) der RAS omdanner enzymet (RCE1) kløyver de tre C-terminal rester. Det siste trinnet i behandlingen er metylering av den nye C-terminal farnesylcysteine rester av ER membran protein, isoprenylcysteine kar bok syl methyltransferase (ICMT). Uttrykk for rekombinant KRAS4b i E. coli resulterer i produksjon av et uendret protein. Tidligere forsøk på å produsere behandlet KRAS4b har vært begrenset på grunn av utilstrekkelig avkastning for strukturelle eller narkotika screening eksperimenter eller har unnlatt å recapitulate den innfødte full lengde modne protein13,14. Protokollen som presenteres her benytter en konstruert baculovirus-basert insekt celle uttrykk system og rensing metode som genererer svært renset, fullt behandlet KRAS4b ved rentene på 5 mg/L av cellekultur.
Forsiktig protein karakterisering er viktig å validere kvaliteten på rekombinant proteiner før fatt på strukturelle biologi eller narkotika screening studier. To viktige parametre for fullt behandlet KRAS4b er validering av riktig prenyl modifikasjon og tilgjengeligheten av farnesylated og carboxymethylated C-Terminus (FMe) for interaksjon med membran erstatninger eller lipider. Electrospray ionisering masse massespektrometri (ESI-MS) av KRAS4b-FMe ble brukt til å måle molekylvekt og bekrefte tilstedeværelsen av farnesylpyrofosfat og carboxymethyl modifikasjoner. Native masse massespektrometri, der prøvene er sprayet med nondenaturing løsemidler, ble brukt til å demonstrere at KRAS4b-FMe var også bundet til BNP-kofaktor. Til slutt ble overflate Plasmon resonans spektroskopi brukes til å måle direkte binding av KRAS4b-FMe med immobilisert liposomer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>30211SS-1232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>850457</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>840034</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5427R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A998-1 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09689-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>ARUP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate 384</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore T200 Instrument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Snap-It Seals, T/S</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-54B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonic Bath</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-336-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation Exchange Chromatography (CEX) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018183</td>
			<td>HiPrep SP Sepharose High Performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyna Pro Plate Reader</td>
			<td>Wyatt Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exactive Plus EMR Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0507-500Ml</td>
			<td>Use Reagent Grade or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson vials 7x14 mm Tubes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass screw thread vials with PTFE foam liners</td>
			<td>Scientific Specialities</td>
			<td>B69302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed/benchtop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>05-112-114D</td>
			<td>capable of up to 4,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>92414</td>
			<td>Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9365-51</td>
			<td>HisPrep FF 16/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-House Water Supply, Arium Advance</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td></td>
			<td>Resistivity of 18 M&#937;0-cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid extruder set with holder</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI-DEWAR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M110-EH microfluidizer</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 &#197;, 2.1 x 150 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagTran software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC Grade</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>BDH20864.400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>78880002</td>
			<td>NGC QuestTM 100 Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Caps type 3</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series S Sensor Chip L1</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29104993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>13-400-519</td>
			<td>Absorbace at 280nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>PES membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima - L80K</td>
			<td>capable of 100,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733-1L</td>
			<td>May use in-house water source (see below)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter</td>
			<td>GE Healthcare - Whatman</td>
			<td>6994-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur QualBrowser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>proteomics software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein

Protein prenylation er en viktig modifikasjon som er ansvarlig for å målrette proteiner mot intracellulære membraner. KRAS4b, som er mutert i 22% av menneskelig kreft, behandles av farnesylation og carboxymethylation på grunn av tilstedeværelsen av en ' CAAX ' boksen motiv på C-Terminus. Et utviklet baculovirus system ble brukt til å uttrykke farnesylated og carboxymethylated KRAS4b i insekt celler og har blitt beskrevet tidligere. Her beskriver vi den detaljerte, praktiske rensing og biokjemiske karakterisering av proteinet. Spesielt ble affinitet og Ion Exchange kromatografi brukt til å rense proteinet til homogenitet. Intakt og innfødt masse massespektrometri ble brukt til å validere den korrekte modifikasjon av KRAS4b og å verifisere nukleotid binding. Til slutt ble membran sammenslutning av farnesylated og carboxymethylated KRAS4b til liposomer målt ved hjelp av overflate Plasmon resonans spektroskopi.

En av de største variablene i protokollen er mengden av uttrykt mål protein (His6-MBP-TEV-KRAS4b). Denne protokollen ble utviklet ved hjelp av et isolat fra en Trichoplusia ni cellelinje, TNI-FNL17, tilpasset for suspensjon vekst og Avvent fra serum. Gitt det brede spekter av resultater rapportert på tvers av ulike insekt cellelinjer med baculovirus uttrykks system, er det tilrådelig at TNI-FNL brukes, iallfall i utgangspunktet, til produsert KRAS4b-FMe.
Et...

Watch this Scientific Journal Video about Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein at JoVE.com

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Prenylation er en viktig modifikasjon på perifere membran bindende proteiner. Insekt celler kan manipuleres til å produsere farnesylated og carboxymethylated KRAS4b i mengder som muliggjør Biofysiske målinger av protein-protein og protein-lipid interaksjoner

Fullt behandlet rekombinant KRAS4b: isolere og karakteriserer Farnesylated og denaturert protein

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Vår protokoll gir mulighet for isolasjon og separasjon av riktig behandlet KRAS med høy avkastning. Produksjonen av autentisk farnesylert og karboksymetymetisert KRAS gjør det mulig å utføre eksperimenter som har KRAS i membranen akkurat som i pattedyrceller. Den høye avkastningen av protokollen skiller den fra tidligere arbeid.Vi renser vanligvis tre til fem milligram protein per liter uttrykksmateriale. Dette gjør at vi kan gjennomføre en rekke biofysiske og strukturelle biologieksperimenter. KRAS er mutert i 20% av kreft og 90% i bukspyttkjertelkreft.Så å ha en protokoll for å produsere autentisk bearbeidet protein er ganske nyttig for å utvikle narkotikaskjermer, slik at du kan studere det faktiske proteinet som det ville være på membranen av kreftceller. Denne protokollen er også svært nyttig for å studere andre proteiner som er farnesylert og fullt behandlet i cellene. Og som sådan, alt du trenger å gjøre er å bytte ut KRAS med protein av interesse og sette den inn i baculovirus.De kritiske trinnene er de rundt kation utveksling kromatografi. Ved hjelp av riktig kolonne og begrense tiden proteinet er i lav saltbuffer er avgjørende for suksess. Å forstå at nedbøren ikke er en snøkule type hendelse bidrar til å veilede de nye til protokollen.Dette forsterkes ved å vise behovet for å dele kationutvekslingskolonnebelastningen i flere mindre belastninger. Etter lysing celler, avklare lysate, og rense målet protein av IMAC, analysere protein fraksjoner ved hjelp av SDS side og Coomassie farging. Pool toppen fraksjoner og dialyze bassenget over natten mot to liter buffer D på fire grader Celsius.På neste dag fjerner du prøven fra dialyse og sentrifugerer den ved 4000 ganger g i 10 minutter for å fjerne utfelling. Den endelige dialyzed og avklart prøven er ofte fortsatt uklar, men kan brukes på CEX-kolonnen uten videre behandling. Forbered 20 milliliter kation utveksling kolonne ved å vaske den med tre kolonnevolumer av buffer G, deretter med tre kolonnevolumer av buffer F.Neste, fortynne 20 milliliter av den dialyzed prøven til en endelig natriumkloridkonsentrasjon på 100 millimolar ved å legge til 20 milliliter buffer E og bruke prøven på utvekslingskolonnen.Det er viktig å fortynne den lille mengden av prøven i stedet for alt på en gang, og de fortynnede prøvene skal påføres kolonnen umiddelbart etter fortynning for å begrense nedbøren av proteinet. Fortsett å laste kolonnen med nyfortynnet prøve som den forrige fortynningen nærmer seg slutten av lasten. Vask deretter kolonnen til baseline absorbance 280 med buffer F som vanligvis krever tre kolonnevolumer.Elute proteinet fra kolonnen med en 400 milliliter gradient fra buffer F til 65% buffer G, samle eluent i seks milliliter fraksjoner. Når graderingen er fullført, fortsetter du å vaske kolonnen for ytterligere 1,5 kolonnevolumer på 65% buffer G.Velg de positive brøkene basert på både SDS-siden og Coomassie Blue flekkanalyse samt inspeksjon av UV-sporet av kromatrammet. Deretter pool proteinet og fordøye det med His6 TEV protease i henhold til manuskript retninger.Etter fordøyelse og dialyse, last proteinet på en 20 milliliter IMAC-kolonne likevektet med buffer A på tre milliliter per minutt. Samle syv milliliter fraksjoner under denne kromatografien og vask kolonnen med totalt tre kolonnevolumer buffer A eller til baseline absorbans er nådd. Elute målet protein med fem kolonne volum gradering av buffer C fra 0% til 10%og samle syv milliliter fraksjoner.Identifiser deretter de positive brøkene med SDS-siden. Når analysert med SDS side, avklart lysate bør inneholde et mørkt bånd som migrerer til ca 65 kilodaltonn som tilsvarer fusjonsproteinet His6-MBP-tev-KRAS4b. Den co-uttrykte FNTAb migrerer til 48 kilodaltonn.CEX-trinnet i rensingen er kritisk fordi det reduserer omfanget av proteolyse og beriker det fullt bearbeidede proteinet, men er den mest kompliserte delen av protokollen. Et typisk resultat fra dette trinnet har en fremtredende topp tre med KRAS4b-FMe, men elution profiler kan være variabel. Intakt masseanalyse ved hjelp av ESIMS bekrefter den nøyaktige molekylære massen av proteinene og dermed den relative andelen farnesylering eller karboksymetymetylering.Mens typiske endelige tomter inneholdt noen påviselig KRAS4b-FARN, denne andelen var mindre enn 15%i form av topp høyde fra denne analysen. Native masseanalyse ble brukt til å bestemme massen av KRAS4b bundet til BNP. Prøven løsemiddel ble utvekslet for ammoniumacetat for å sikre en mykere ionisering slik at det innfødte komplekset kan forbli intakt.Samspillet mellom KRAS4b-FMe og liposomer ble målt med overflateplasmonresonans for å validere farnesylering og karboksymetymetylering er nødvendig for kras4b-FMe å binde til membraner. Som forventet, KRAS4b-FMe bundet til liposomer mens ubearbeidet KRAS4b ikke. Minimere tiden proteinet er utsatt for lavt salt er det mest kritiske aspektet av protokollen som påvirker utbyttet.Proteinet er bare kort på denne lave saltkonsentrasjonen etter fortynning i buffer E.Proteinet kan brukes til en rekke biofysiske eksperimenter som bruker membran mimetika som liposomer eller nanodisker for å undersøke hvilke lipider KRAS samhandler med. Ved hjelp av disse dataene kan vi begynne å ekstrapolere hvordan KRAS samhandler med cellemembranens plasmamembran. Ved hjelp av renset KRAS-FMe, våre kolleger var i stand til å løse røntgen krystall strukturen av KRAS i komplekse med en chaperone som er spesifikk for farnesylert og metylert form av dette proteinet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Utarbeidelse og innlevering av Protein microcrystals i lipidic Cubic fase for Serial femtosecond Krystallografi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Undersøke Proteasome Montering med rekombinant archaeal proteasomer og Nondenaturing SIDE: The Case for en kombinert tilnærming

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Rekombinant Proteinuttrykk, Krystallisering og Biofysiske Studier av a<em&gt; Bacillus</em&gt; -konserverte nukleotidpyrofosforylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: trinns affinitet rensing for parallell analyse av Protein-Protein og Protein-metabolitten komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse av proteinfolding, Transport og nedbrytning i levende celler av radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Helt selvstendig karakterisering og datainnsamling fra krystaller av biologiske makromolekyler

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Ionebytte kromatografi (IEX) koblet til multi-Angle lysspredning (MALS) for proteiner og karakterisering

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakteriserer individuelle protein aggregater av infrarød Nanospectroscopy og Atomic Force mikroskopi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...