Name: fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein
Uploaded: 2020-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein at JoVE.com

Reconhecemos o apoio à clonagem e expressão de Carissa Grose, Jen Melhalko e Matt Drew no Laboratório de Expressão de Proteínas, Frederick National Laboratory for Cancer Research. Este projeto foi financiado no todo ou em parte com fundos federais do Instituto Nacional do Câncer, Institutos Nacionais de Saúde, o Contrato Nº. HHSN261200800001E. O conteúdo desta publicação não reflete necessariamente as opiniões ou políticas do Departamento de Saúde e Serviços Humanos, nem menciona nomes comerciais, produtos comerciais ou organizações implicam endosso do Governo dos EUA

1. Purificação de proteínas
<ol><li>Prepare buffers A-H, como visto na Tabela 1.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Solução tampão</td>
			<td>Agente tampão (todos os 20 mM)</td>
			<td>
pH P H
</td>
			<td>NaCl (mM) NaCl (mM)</td>
			<td>imidazol (mM) imidazol (mM)</td>
			<td>MgCl 2 MgCl2</stro...

<ol>
	<li>Cox, A. D., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation:+more+than+just+glue.">Protein prenylation: more than just glue.</a> Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).</li><li>Zhang, F. L., Casey, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Prenylation:+Molecular+Mechanisms+and+Functional+Consequences.">Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).</li><li>Hottman, D. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation+and+synaptic+plasticity:+implications+for+Alzheimer's+disease.">Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease.</a> Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).</li><li>Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+and+cognition+in+neurodegenerative+disorders.">HDL and cognition in neurodegenerative disorders.</a> Neurobiology of Disease. 72, 22-36 (2014).</li><li>Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pleiotropic+effect+of+statins:+prevention+of+cardiac+hypertrophy+by+cholesterol-independent+mechanisms.">A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms.</a> Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).</li><li>Kohnke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPase+prenylation+hierarchy+and+its+potential+role+in+choroideremia+disease.">Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease.</a> PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).</li><li>Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+prenylation+for+cancer+therapy.">Targeting protein prenylation for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).</li><li>Kho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tagging-via-substrate+technology+for+detection+and+proteomics+of+farnesylated+proteins.">A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).</li><li>Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAAX+geranylgeranyl+transferase+transfers+farnesyl+as+efficiently+as+geranylgeranyl+to+RhoB.">CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).</li><li>Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dragging+ras+back+in+the+ring.">Dragging ras back in the ring.</a> Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+in+Membrane+Biochemistry+and+Biophysics.">Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics.</a> Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).</li><li>Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Step-by-step+Method+for+the+Reconstitution+of+an+ABC+Transporter+into+Nanodisc+Lipid+Particles.">A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).</li><li>Dementiev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-Ras4B+lipoprotein+synthesis:+biochemical+characterization,+functional+properties,+and+dimer+formation.">K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation.</a> Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+recombinant+human+Kirsten-ras+(4B)+p21+produced+at+high+levels+in+Escherichia+coli+and+insect+baculovirus+expression+systems.">Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).</li><li>Gillette, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Farnesylated+and+Methylated+Proteins+in+an+Engineered+Insect+Cell+System.">Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).</li><li>Agamasu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS+Prenylation+Is+Required+for+Bivalent+Binding+with+Calmodulin+in+a+Nucleotide-Independent+Manner.">KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner.</a> Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).</li><li>Talsania, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Assembly+and+Annotation+of+the+Trichoplusia+ni+Tni-FNL+Insect+Cell+Line+Enabled+by+Long-Read+Technologies.">Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies.</a> Genes. 10 (2), 79 (2019).</li><li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RAS+function+through+targeting+an+allosteric+regulatory+site.">Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site.</a> Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+polyisoprenylated+Ras+proteins+in+the+insect/baculovirus+system.">Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system.</a> Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).</li><li>Dharmaiaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+recognition+of+farnesylated+and+methylated+KRAS4b+by+PDE&#948;.">Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDE&#948;.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).</li><li>Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanism+of+drug/Lipid+membrane+interactions+using+Biacore.">Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore.</a> Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).</li><li>Fisher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interactions+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+with+oligonucleotides.">Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).</li><li>Lakshman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+biophysical+analysis+defines+key+components+modulating+recruitment+of+the+GTPase+KRAS+to+the+plasma+membrane.">Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).</li></ol>

Conforme observado na seção resultados representativos, o passo mais crítico durante a purificação é o manuseio da amostra durante o tempo em que está em sal inferior. Limitar o tempo em que a amostra é exposta a menos de 200 mM NaCl ajudará a reduzir a precipitação e aumentar o rendimento da amostra. A interpretação dos resultados do CEX pode ser difícil se o perfil não corresponder às expectativas (ver Figura 2). Até que o protocolo se torne rotina, é aconselhável que as...

As modificações pós-translacionais desempenham um papel fundamental na definição da atividade funcional das proteínas. Modificações como fosforilação e glicosilação estão bem estabelecidas. As modificações lipídicas são menos bem caracterizadas, no entanto. Estima-se que até 0,5% de todas as proteínas celulares podem ser pré-nylated1. Prenimação é a transferência de um farnesyl de 15 carbonoou uma cadeia lipídica geranylgeranyl de 20 carbono para uma proteína aceitante contendo o motivo CAAX2. Proteínas pré-lafoladas têm sido implicadas na progressão de várias doenças humanas, incluindo o envelhecimento prematuro3,Alzheimer4,disfunção cardíaca5, choroideremia6, e câncer7. Os pequenos GTPases, HRAS, NRAS e KRAS1,laminados nucleares e as kinetochores CENP-E e F são proteínas farnesilado a condição basal. Outros pequenos GTPases, ou seja, RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42 e RRAS são geranylgeranylated8, enquanto RhoB pode ser farnesylated ou geranylgeranylated9.
O pequeno GTPase KRAS4b funciona como um interruptor molecular, essencialmente transmitindo fator de crescimento extracelular sinalizando para vias intracelulares de transdução de sinal que estimulam o crescimento e proliferação de células, através de múltiplas interações proteína-proteína. Existem dois aspectos-chave da bioquímica KRAS4b que são essenciais para a sua atividade. Primeiro, os ciclos de proteína entre um PIB inativo e um estado vinculado ao GTP ativo pelo qual ele se envolve ativamente com efíores. Em segundo lugar, uma região de poliliina terminal C e uma cisteína farnesilado e carboximetilada direcionam a proteína para a membrana plasmática, permitindo o recrutamento e a ativação de emigrantes a jusante. MutantKRAS4b é um motorista oncogênico no câncer pancreático, colorretal e pulmonar10,e, como tal, a intervenção terapêutica teria um enorme benefício clínico. A produção de proteína recombinante autenticamente modificada que é farnesilado e carboximetilado permitiria triagem bioquímica usando KRAS4b em combinação com substitutos de membrana, como lipossomas ou nanodiscos lipídicos11,12.
Farnesyl transferase (FNT) catalisa a adição de pirofosfato farnério ao cisteína c-terminal no motivo CAAX em KRAS4b. Após a pré-nimação, a proteína é traficada para o retículo endoplasmático (ER), onde a enzima de conversão ras (RCE1) divide os três resíduos do terminal C. O passo final no processamento é a metilação do novo resíduo de farnesylcisteína c-terminal pela proteína da membrana er, isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase (ICMT). A expressão de KRAS4b recombinante em E. coli resulta na produção de uma proteína não modificada. Tentativas anteriores de produzir KRAS4b processados foram limitadas devido a rendimentos insuficientes para experimentos estruturais ou de rastreamento de drogas ou não conseguiram recapitular a proteína madura nativa de corpo inteiro13,14. O protocolo apresentado aqui utiliza um sistema de expressão de células de insetos à base de baculovírus projetado e método de purificação que gera KRAS4b altamente purificado e totalmente processado a rendimentos de 5 mg/L da cultura celular.
A caracterização cuidadosa da proteína é essencial validar a qualidade das proteínas recombinantes antes de embarcar em biologia estrutural ou estudos de triagem de medicamentos. Dois parâmetros-chave do KRAS4b totalmente processado são a validação da modificação prenimita correta e a disponibilidade do C-terminus (FMe) farnesylatelado e carboximetilado para interação com substitutos de membrana ou lipídios. A espectrometria de massa de ionização de eletrospray (ESI-MS) do KRAS4b-FMe foi usada para medir o peso molecular e confirmar a presença das modificações de farnése e carboximetil. A espectrometria de massa nativa, onde as amostras são pulverizadas com solventes não desativação, foi usada para demonstrar que kras4b-fme também estava vinculado ao seu cofator do PIB. Finalmente, a espectroscopia de ressonância plasmon superficial foi usada para medir a ligação direta do KRAS4b-FMe com lipossomas imobilizados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>30211SS-1232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>850457</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>840034</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5427R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A998-1 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09689-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>ARUP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate 384</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore T200 Instrument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Snap-It Seals, T/S</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-54B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonic Bath</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-336-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation Exchange Chromatography (CEX) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018183</td>
			<td>HiPrep SP Sepharose High Performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyna Pro Plate Reader</td>
			<td>Wyatt Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exactive Plus EMR Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0507-500Ml</td>
			<td>Use Reagent Grade or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson vials 7x14 mm Tubes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass screw thread vials with PTFE foam liners</td>
			<td>Scientific Specialities</td>
			<td>B69302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed/benchtop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>05-112-114D</td>
			<td>capable of up to 4,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>92414</td>
			<td>Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9365-51</td>
			<td>HisPrep FF 16/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-House Water Supply, Arium Advance</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td></td>
			<td>Resistivity of 18 M&#937;0-cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid extruder set with holder</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI-DEWAR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M110-EH microfluidizer</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 &#197;, 2.1 x 150 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagTran software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC Grade</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>BDH20864.400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>78880002</td>
			<td>NGC QuestTM 100 Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Caps type 3</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series S Sensor Chip L1</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29104993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>13-400-519</td>
			<td>Absorbace at 280nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>PES membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima - L80K</td>
			<td>capable of 100,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733-1L</td>
			<td>May use in-house water source (see below)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter</td>
			<td>GE Healthcare - Whatman</td>
			<td>6994-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur QualBrowser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>proteomics software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein

A prenimação proteica é uma modificação fundamental que é responsável pela segmentação de proteínas para membranas intracelulares. Kras4b, que é mutado em 22% dos cânceres humanos, é processado por farnização e carboximetilação devido à presença de um motivo de caixa 'CAAX' no C-terminus. Um sistema de baculovírus projetado foi usado para expressar KRAS4b farnesilado e carboximetilado em células de insetos e foi descrito anteriormente. Aqui, descrevemos a purificação detalhada e prática e caracterização bioquímica da proteína. Especificamente, a afinidade e a cromatografia de troca de íons foram usadas para purificar a proteína à homogeneidade. A espectrometria de massa intacta e nativa foi utilizada para validar a modificação correta do KRAS4b e para verificar a ligação do nucleotídeo. Finalmente, a associação da membrana de KRAS4b farnesylated e carboxymethylated aos lipossomos foi medida usando a espectroscopia da ressonância do plasmon de superfície.

Uma das maiores variáveis do protocolo é a quantidade de proteína alvo expressa (His6-MBP-tev-KRAS4b). Este protocolo foi desenvolvido usando um isolado de uma linha celular Trichoplusia ni, Tni-FNL17,adaptado para o crescimento da suspensão e desmamado do soro. Dada a ampla gama de resultados relatados em todas as várias linhas de células insetos com o sistema de expressão de baculovírus, é aconselhável que tni-FNL ser usado, pelo menos inicialmente, para produzido KRAS4b-FMe.<...

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Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

A prenimação é uma modificação importante nas proteínas de ligação da membrana periférica. As células de insetos podem ser manipuladas para produzir KRAS4b farnesilado e carboximetilado em quantidades que permitem medições biofísicas de interações proteína-proteína e proteína-lipídios

KRAS4b recombinante totalmente processado: Isolando e caracterizando a proteína farnesylated e metilada

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Nosso protocolo permite o isolamento e separação de KRAS devidamente processados em alto rendimento. A produção de KRAS autenticamente farnesilado e carboximetilado torna possível realizar experimentos que tenham KRAS em sua membrana, assim como em células de mamíferos. O alto rendimento do protocolo o diferencia do trabalho anterior.Normalmente purificamos de três a cinco miligramas de proteína por litro de material de expressão. Isso nos permite realizar uma variedade de experimentos biofísicos e estruturais de biologia. O KRAS é mutado em 20% dos cânceres e 90% em cânceres de pâncreas.Portanto, ter um protocolo para produzir proteínas autenticamente processadas é bastante útil para o desenvolvimento de telas de medicamentos para que você possa estudar a proteína real como seria na membrana das células cancerosas. Este protocolo também é muito útil para estudar outras proteínas que são farnesiladas e totalmente processadas nas células. E como tal, tudo o que você precisa fazer é trocar o KRAS com a proteína de interesse e colocá-lo no baculovírus.Os passos críticos são aqueles ao redor da cromatografia de troca de cation. Usar a coluna adequada e limitar o tempo em que a proteína está em baixo tampão de sal são essenciais para o sucesso. Entender que a precipitação não é um tipo de evento de globo de neve ajuda a guiar os novos para o protocolo.Isso é reforçado mostrando a necessidade de dividir a carga da coluna de troca de cation em várias cargas menores. Depois de lise as células, esclarecendo o lise e purificando a proteína alvo pelo IMAC, analise as frações proteicas usando a página SDS e a coloração coomassie. Acumule as frações de pico e digele a piscina durante a noite contra dois litros de tampão D a quatro graus Celsius.No dia seguinte, remova a amostra da diálise e centrífuga-a a 4.000 vezes por 10 minutos para remover qualquer precipitado. A amostra final dialisada e clarificada muitas vezes ainda é nebulosa, mas pode ser aplicada à coluna CEX sem maior processamento. Prepare a coluna de troca de 20 mililitros lavando-a com três volumes de coluna de buffer G, depois com três volumes de coluna de tampão F.Next, diluir 20 mililitros da amostra dialisada para uma concentração final de cloreto de sódio de 100 mililitros adicionando 20 mililitros de buffer E e aplicar a amostra na coluna de troca.É fundamental diluir a pequena quantidade da amostra em vez de todas de uma vez e as amostras diluídas devem ser aplicadas à coluna imediatamente após a diluição para limitar a precipitação da proteína. Continue carregando a coluna com amostra recém-diluída à medida que a diluição anterior se aproxima do fim da carga. Em seguida, lave a coluna para a absorção de linha de base 280 com tampão F que normalmente requerem três volumes de coluna.Elute a proteína da coluna com um gradiente de 400 mililitros do tampão F a 65% de tampão G, coletando o eluent em seis frações mililitros. Uma vez que o gradiente esteja completo, continue lavando a coluna para um volume adicional de 1,5 colunas de 65% tampão G.Escolha as frações positivas com base tanto na página SDS quanto na análise da mancha Coomassie Blue, bem como na inspeção do traço UV do cromatógrama. Em seguida, acumule a proteína e digere-a com a protease His6 TEV de acordo com as instruções do manuscrito.Após a digestão e diálise, carregue a proteína em uma coluna IMAC de 20 mililitros equilibrada com tampão A a três mililitros por minuto. Colete sete frações mililitros durante esta cromatografia e lave a coluna com um total de três volumes de coluna de tampão A ou até que a absorção da linha de base seja atingida. Elute a proteína alvo com gradiente de volume de cinco colunas de tampão C de 0%a 10% e coletar sete frações mililitros.Em seguida, identifique as frações positivas com a página SDS. Quando analisado com a página SDS, o lysate esclarecido deve conter uma faixa escura que migra para cerca de 65 kilodaltons que corresponde à proteína de fusão His6-MBP-tev-KRAS4b. O FNTAb co-expresso migra para 48 kilodaltons.O passo CEX dentro da purificação é fundamental porque reduz a extensão da proteólise e enriquece a proteína totalmente processada, mas é a parte mais complicada do protocolo. Um resultado típico desta etapa tem um pico de três proeminentes com o KRAS4b-FMe, mas perfis de elução podem ser variáveis. A análise de massa intacta usando ESIMS confirma a massa molecular precisa das proteínas e, assim, a proporção relativa de farnesilização ou carboximetilação.Embora os lotes finais típicos contiveram alguns KRAS4b-FARN detectáveis, essa proporção foi inferior a 15% em termos de altura máxima a partir desta análise. A análise de massa nativa foi utilizada para determinar a massa do KRAS4b vinculado ao PIB. O solvente amostral foi trocado por acetato de amônio para garantir uma ionização mais suave permitindo que o complexo nativo permanecesse intacto.A interação de KRAS4b-FMe e lipossomos foi medida com ressonância de plasmon superficial para validar a farnesitilação e carboximetilação são necessárias para que KRAS4b-FMe se ligue às membranas. Como esperado, KRAS4b-FMe ligado aos lipossomos enquanto KRAS4b não processado não. Minimizar o tempo em que a proteína é exposta ao baixo sal é o aspecto mais crítico do protocolo que afeta o rendimento.A proteína está apenas brevemente nesta baixa concentração de sal após a diluição no buffer E.A proteína pode ser usada para uma variedade de experimentos biofísicos que usam mimetísticas de membrana como lipossomos ou nanodiscos para investigar quais lipídios KRAS interage. Usando esses dados, podemos começar a extrapolar como o KRAS interage com a membrana plasmática da célula. Usando kras-fme purificado, nossos colegas foram capazes de resolver a estrutura de cristal de raios-x do KRAS em complexo com um acompanhante que é específico para a forma farnesilada e metilada desta proteína.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Preparação e entrega de microcristais de proteína na fase cúbica lipídico para Serial Femtosecond Cristalografia

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Bioquímica

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

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Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

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resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

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Expressão de Proteína Recombinante, Cristalização e Estudos Biofísicos de<em&gt; Bacillus</em&gt; -conservado Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

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Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

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Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

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Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Caracterização de agregados proteicos individuais por Nanoespectroscopia infravermelha e microscopia de força atômica

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...