Name: fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein
Uploaded: 2020-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein at JoVE.com

Мы признаем, клонирование и выражение поддержки от Карисса Гроуз, Джен Melhalko, и Мэтт Дрю в лаборатории экспрессии белка, Фредерик Национальной лаборатории по изучению рака. Этот проект был профинансирован в целом или частично за счет федеральных средств из Национального института рака, Национальные институты здравоохранения, в соответствии с контрактом No. HHSN261200800001E. Содержание этой публикации не обязательно отражает взгляды или политику Министерства здравоохранения и социальных служб, равно как и упоминание торговых наименований, коммерческих продуктов или организаций не подразумевает одобрения со стороны правительства США

1. Очистка белка
<ol><li>Подготовьте буферы A-H, как видно из таблицы 1.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Решение буфера</td>
			<td>Буферный агент (все 20 мМ)</td>
			<td>
рH
</td>
			<td>NaCl (mM)</td>
			<td>имидазол (mM)</td>
			<t...

<ol>
	<li>Cox, A. D., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation:+more+than+just+glue.">Protein prenylation: more than just glue.</a> Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).</li><li>Zhang, F. L., Casey, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Prenylation:+Molecular+Mechanisms+and+Functional+Consequences.">Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).</li><li>Hottman, D. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation+and+synaptic+plasticity:+implications+for+Alzheimer's+disease.">Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease.</a> Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).</li><li>Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+and+cognition+in+neurodegenerative+disorders.">HDL and cognition in neurodegenerative disorders.</a> Neurobiology of Disease. 72, 22-36 (2014).</li><li>Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pleiotropic+effect+of+statins:+prevention+of+cardiac+hypertrophy+by+cholesterol-independent+mechanisms.">A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms.</a> Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).</li><li>Kohnke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPase+prenylation+hierarchy+and+its+potential+role+in+choroideremia+disease.">Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease.</a> PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).</li><li>Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+prenylation+for+cancer+therapy.">Targeting protein prenylation for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).</li><li>Kho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tagging-via-substrate+technology+for+detection+and+proteomics+of+farnesylated+proteins.">A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).</li><li>Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAAX+geranylgeranyl+transferase+transfers+farnesyl+as+efficiently+as+geranylgeranyl+to+RhoB.">CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).</li><li>Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dragging+ras+back+in+the+ring.">Dragging ras back in the ring.</a> Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+in+Membrane+Biochemistry+and+Biophysics.">Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics.</a> Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).</li><li>Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Step-by-step+Method+for+the+Reconstitution+of+an+ABC+Transporter+into+Nanodisc+Lipid+Particles.">A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).</li><li>Dementiev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-Ras4B+lipoprotein+synthesis:+biochemical+characterization,+functional+properties,+and+dimer+formation.">K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation.</a> Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+recombinant+human+Kirsten-ras+(4B)+p21+produced+at+high+levels+in+Escherichia+coli+and+insect+baculovirus+expression+systems.">Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).</li><li>Gillette, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Farnesylated+and+Methylated+Proteins+in+an+Engineered+Insect+Cell+System.">Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).</li><li>Agamasu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS+Prenylation+Is+Required+for+Bivalent+Binding+with+Calmodulin+in+a+Nucleotide-Independent+Manner.">KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner.</a> Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).</li><li>Talsania, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Assembly+and+Annotation+of+the+Trichoplusia+ni+Tni-FNL+Insect+Cell+Line+Enabled+by+Long-Read+Technologies.">Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies.</a> Genes. 10 (2), 79 (2019).</li><li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RAS+function+through+targeting+an+allosteric+regulatory+site.">Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site.</a> Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+polyisoprenylated+Ras+proteins+in+the+insect/baculovirus+system.">Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system.</a> Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).</li><li>Dharmaiaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+recognition+of+farnesylated+and+methylated+KRAS4b+by+PDE&#948;.">Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDE&#948;.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).</li><li>Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanism+of+drug/Lipid+membrane+interactions+using+Biacore.">Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore.</a> Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).</li><li>Fisher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interactions+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+with+oligonucleotides.">Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).</li><li>Lakshman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+biophysical+analysis+defines+key+components+modulating+recruitment+of+the+GTPase+KRAS+to+the+plasma+membrane.">Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).</li></ol>

Как отмечается в разделе «Результаты представителей», наиболее важным шагом при очистке является обработка образца во время его пребывания в более низкой соли. Ограничение времени, в течение которого образец подвергается воздействию менее 200 мМ NaCl, поможет уменьшить количество осадко...

Почтовые изменения играют ключевую роль в определении функциональной активности белков. Такие модификации, как фосфорилирование и гликозилирование, хорошо известны. Липидные модификации менее хорошо характеризуются, однако. Подсчитано, что до 0,5% всех клеточных белков могут быть пренилированными1. Prenylation является передача 15-углеродный фарнесил или 20-углеродный геранилгеранил липидной цепи принимает белок, содержащий мотив CAAX2. Пренилированные белки были вовлечены в прогрессирование нескольких заболеваний человека, включая преждевременное старение3, болезнь Альцгеймера4, сердечная дисфункция5,сосудидеремия6, и рак7. Небольшие GTPases, HRAS, NRAS, и KRAS1, ядерные ламинины, и кинетохоры CENP-E и F являются фарнезилатными белками в базальном состоянии. Другие небольшие GTPases, а именно RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42, и RRAS являются geranylgeranylated8, в то время как RhoB может быть farnesylated или geranylgeranylated9.
Небольшой GTPase KRAS4b функционирует как молекулярный переключатель, по существу передающий внеклеточный фактор роста, сигнализирующие на внутриклеточные пути трансдукции сигнала, которые стимулируют рост и пролиферацию клеток, через несколько белково-белковых взаимодействий. Есть два ключевых аспекта биохимии KRAS4b, которые имеют важное значение для его деятельности. Во-первых, белковые циклы между неактивным ВВП и активным состоянием связанного GTP, при котором он активно взаимодействует с эффекторами. Во-вторых, C-терминальный поли-лизин области и фарнезилати и карбоксиметилированный цистеин направить белок на плазменной мембраны, что позволяет вербовки и активации вниз по течению эффекторов. Мутант KRAS4b является онкогенным драйвером в поджелудочной железе, колоректальной и рак легких10, и как таковой, терапевтическое вмешательство будет иметь огромное клиническое преимущество. Производство подлинно модифицированного рекомбинантного белка, который фарнезилат и карбоксиметилированный позволит биохимический скрининг с использованием KRAS4b в сочетании с мембранными суррогатами, такими как липосомы или липидные нанодиски11,12.
Фарнесил трансферазы (FNT) катализирует добавление фарнесилового пирофосфата в C-терминал цистеин в мотиве CAAX в KRAS4b. После prenylation, белок торгуется в эндоплазмический ретикулум (ER), где Ras преобразования фермента (RCE1) расщепляет три C-терминалостатка остатков. Последним шагом в обработке является метилирование нового C-терминала фарнесилцистеина остаток мембранного белка ER, isoprenylcysteine carboxyl метилтрансферазы (ICMT). Выражение рекомбинантного KRAS4b в кишечной палочке приводит к выработке неизмененного белка. Предыдущие попытки производить обработанный KRAS4b были ограничены из-за недостаточной урожайности для структурных или наркотиков скрининговых экспериментов или не смогли резюмировать родной полнометражный зрелый белок13,14. В представленном здесь протоколе используется инженерная система экспрессии клеток на основе бакуловируса и метод очистки, который генерирует высокоочищенный, полностью обработанный KRAS4b при урожайности 5 мг/л клеточной культуры.
Тщательная характеристика белка имеет важное значение для проверки качества рекомбинантных белков до начала структурных исследований биологии или скрининга наркотиков. Двумя ключевыми параметрами полностью обработанного KRAS4b являются проверка правильной модификации пренил и наличие фарнезилатной и карбоксиметилированных C-терминов (FMe) для взаимодействия с мембранными заменителями или липидами. Электроспрей ионизация масс-спектрометрии (ESI-MS) KRAS4b-FMe использовалась для измерения молекулярного веса и подтверждения наличия фарнесиловых и карбоксиметиловых модификаций. Местная масс-спектрометрия, где образцы распыляются с неденативными растворителями, была использована для демонстрации того, что KRAS4b-FMe также был связан с его Кофактором ВВП. Наконец, поверхностная плазмонная резонансная спектроскопия использовалась для измерения прямого связывания KRAS4b-FMe с обездвижемыми липосомыми.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>30211SS-1232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>850457</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>840034</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5427R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A998-1 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09689-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>ARUP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate 384</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore T200 Instrument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Snap-It Seals, T/S</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-54B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonic Bath</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-336-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation Exchange Chromatography (CEX) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018183</td>
			<td>HiPrep SP Sepharose High Performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyna Pro Plate Reader</td>
			<td>Wyatt Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exactive Plus EMR Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0507-500Ml</td>
			<td>Use Reagent Grade or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson vials 7x14 mm Tubes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass screw thread vials with PTFE foam liners</td>
			<td>Scientific Specialities</td>
			<td>B69302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed/benchtop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>05-112-114D</td>
			<td>capable of up to 4,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>92414</td>
			<td>Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9365-51</td>
			<td>HisPrep FF 16/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-House Water Supply, Arium Advance</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td></td>
			<td>Resistivity of 18 M&#937;0-cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid extruder set with holder</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI-DEWAR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M110-EH microfluidizer</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 &#197;, 2.1 x 150 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagTran software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC Grade</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>BDH20864.400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>78880002</td>
			<td>NGC QuestTM 100 Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Caps type 3</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series S Sensor Chip L1</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29104993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>13-400-519</td>
			<td>Absorbace at 280nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>PES membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima - L80K</td>
			<td>capable of 100,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733-1L</td>
			<td>May use in-house water source (see below)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter</td>
			<td>GE Healthcare - Whatman</td>
			<td>6994-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur QualBrowser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>proteomics software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein

Пренилация белка является ключевой модификацией, которая отвечает за таргетинг белков на внутриклеточные мембраны. KRAS4b, который мутирует в 22% рака человека, обрабатывается фарнезиляции и карбоксиметилирования из-за присутствия 'CAAX' мотив коробки на C-термину. Инженерная система бакуловируса была использована для выражения фарнезилатовые и carboxymethylated KRAS4b в клетках насекомых и была описана ранее. Здесь мы описываем детальную, практическую очистку и биохимическую характеристику белка. В частности, для очищения белка до однородности использовались сродство и ионная обменная хроматография. Intact и родной масс-спектрометрии был использован для проверки правильной модификации KRAS4b и для проверки нуклеотидных связывания. Наконец, мембранная связь фарнезилатной и карбоксиметилового KRAS4b к липосоме была измерена с помощью поверхностной плазмонрезонансной спектроскопии.

Одной из самых больших переменных в протоколе является количество выраженного целевого белка (His6-MBP-tev-KRAS4b). Этот протокол был разработан с использованием изолята от линии клеток Trichoplusia ni, Tni-FNL17, адаптированного для роста подвески и отлуженных от сыворотки. Учитывая шир...

Watch this Scientific Journal Video about Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein at JoVE.com

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Пренилирование является важной модификацией периферических мембранных связывающих белков. Клетки насекомых можно манипулировать для производства фарнезилатных и carboxymethylated KRAS4b в количествах, которые позволяют биофизические измерения белково-белковых и белково-липидных взаимодействий

Полностью обработанный рекомбинантный KRAS4b: изолирование и характеристика фарнезилатного и метилового белка

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Наш протокол допускает изоляцию и разделение правильно обработанного KRAS с высокой урожайностью. Производство подлинно фарнезилированных и карбоксиметилированных КРАС позволяет проводить эксперименты, которые имеют KRAS в их мембране так же, как в клетках млекопитающих. Высокая доходность протокола отличает его от предыдущей работы.Обычно мы очищаем от трех до пяти миллиграммов белка на литр экспрессивного материала. Это позволяет проводить различные биофизические и структурные биологические эксперименты. KRAS мутирует в 20% рака и 90% в раке поджелудочной железы.Таким образом, наличие протокола для производства подлинно обработанного белка является весьма полезным для разработки лекарственных экранов, так что вы можете изучить фактический белок, как это было бы на мембране раковых клеток. Этот протокол также очень полезен для изучения других белков, которые фарнезилированы и полностью обработаны в клетках. И как таковой, все, что вам нужно сделать, это поменять KRAS с белка интереса и положить его в baculovirus.Критические шаги те вокруг хроматографии обмена катиоции. Использование надлежащего столбца и ограничение времени белка в буфере с низким содержанием соли имеют важное значение для успеха. Понимание того, что осадки не являются снежным шаром типа события помогает направлять тех, кто новый к протоколу.Это усиливается, показывая необходимость разделить нагрузку столбца обмена на несколько меньших нагрузок. После облизывания клеток, уточнения лизата и очистки целевого белка IMAC, проанализируйте белковые фракции с помощью страницы SDS и окрашивания Кумасси. Бассейн пиковых фракций и dialyze бассейн ночь против двух литров буфера D на четыре градуса по Цельсию.На следующий день, удалить образец из диализа и центрифуги его в 4000 раз г в течение 10 минут, чтобы удалить любой осадок. Окончательный обеззаражненный и уточненный образец часто все еще туманен, но может быть применен к столбецу CEX без дальнейшей обработки. Подготовь 20-миллилитровую колонку обмена катионами, стирая ее тремя объемами столбца буфера G, затем с тремя объемами столбца буфера F.Next, разбавляют 20 миллилитров обезличеного образца до конечной концентрации хлорида натрия в 100 миллимоляжей, добавляя 20 миллилитров буфера Е и применяя образец к колонке обмена.Очень важно разбавить небольшое количество образца, а не все сразу и разбавленные образцы должны быть применены к колонке сразу после разбавления, чтобы ограничить осадки белка. Продолжайте загружать столбец свежеотбавленным образцом по мере того, как предыдущее разбавление приближается к концу нагрузки. Затем вымойте столбец для базового поглощения 280 с буфером F, который обычно требует трех объемов столбца.Утелите белок из колонки с градиентом 400 миллилитров от буфера F до 65%buffer G, собирая элуент в шести миллилитровых фракциях. После того, как градиент завершен, продолжайте мыть столбец для дополнительных 1,5 объемов столбца 65%buffer G.Выберите положительные фракции на основе как страницы SDS, так и анализа пятен Coomassie Blue, а также проверки УФ-следа хроматограммы. Затем объединить белок и переварить его с His6 TEV protease в соответствии с рукописными указаниями.После пищеварения и диализа загрузите белок на 20-миллилитровую колонку IMAC, уравновешенную буфером А на три миллилитров в минуту. Соберите семь миллилитров фракций во время этой хроматографии и промыть столбец в общей сложности три объема столбца буфера или до тех пор, пока базовое поглощение не будет достигнуто. Уберите целевой белок с пятиберным градиентом объема буфера С от 0%до 10% и соберите семь миллилитров фракций.Затем определите положительные фракции на странице SDS. При анализе со страницы SDS, уточненный лизат должен содержать темную полосу, которая мигрирует примерно до 65 килодалтонов, что соответствует термоядерному белку His6-MBP-tev-KRAS4b. Совместно выраженный FNTAb мигрирует до 48 килодальтонов.Шаг CEX в рамках очистки имеет решающее значение, поскольку он уменьшает степень протеолиза и обогащает полностью обработанный белок, но является наиболее сложной частью протокола. Типичный результат этого шага имеет видный пик три с KRAS4b-FMe, но elution профили могут быть переменными. Нетронутый массовый анализ с использованием ESIMS подтверждает точную молекулярную массу белков и, таким образом, относительную долю фарнезилирования или карбоксиметилирования.В то время как типичные финальные партии содержали некоторые обнаруживаемые KRAS4b-FARN, эта доля была менее 15% с точки зрения пиковой высоты от этого анализа. Для определения массы KRAS4b, привязанной к ВВП, использовался местный массовый анализ. Растворитель образца был обменен на ацетат аммония, чтобы обеспечить более мягкую ионизацию, позволяющую родному комплексу оставаться нетронутым.Взаимодействие KRAS4b-FMe и липосомы было измерено с поверхностным плазмонным резонансом для проверки фарнезилирования и карбоксиметилирования, необходимых для того, чтобы KRAS4b-FMe был связан с мембранами. Как и ожидалось, KRAS4b-FMe связаны с липосомы в то время как необработанные KRAS4b не сделал. Минимизация времени, когда белок подвергается воздействию низкой соли, является самым важным аспектом протокола, который влияет на урожайность.Белок только кратко на этой низкой концентрации соли после разбавления в буфере E.The белок может быть использован для различных биофизических экспериментов, которые используют мембранные миметики, как липосомы или нанодиски, чтобы исследовать, какие липиды KRAS взаимодействует с. Используя эти данные, мы можем начать экстраполировать, как KRAS взаимодействует с плазменной мембраной клетки. Используя очищенную KRAS-FMe, наши коллеги смогли решить рентгеновская кристаллическая структура KRAS в комплексе с сопровождаемым, который специфичен для фарнезилированной и метилированной формы этого белка.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Подготовка и поставка белка микрокристаллов в липидной кубической фазе для последовательного фемтосекундного кристаллографии

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Изучение протеасоме Ассамблею с рекомбинантным архейных Протеасомы и нативных ПААГ: Случай для комбинированного подхода

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Рекомбинантная экспрессия белков, кристаллизация и биофизические исследования<em&gt; Bacillus</em&gt; -содержащая нуклеотидная пирофосфорилаза, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 в 1: один шаг очищение сродства для параллельного анализа протеин протеина и белка метаболит комплексов

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Полностью автономные характеристика и сбора данных от кристаллов биологических макромолекул

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Ионообменной хроматографии (IEX) в сочетании с мульти-угол рассеяния света (MALS) для разделения белков и характеристика

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Характеристика индивидуальных белковых агрегатов с помощью инфракрасной наноспектроскопии и микроскопии атомной силы

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...