Name: fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein
Uploaded: 2020-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein at JoVE.com

Reconocemos la clonación y el apoyo a la expresión de Carissa Grose, Jen Melhalko y Matt Drew en el Laboratorio de Expresión de Proteínas, Frederick National Laboratory for Cancer Research. Este proyecto ha sido financiado total o parcialmente con fondos federales del Instituto Nacional del Cáncer, Institutos Nacionales de Salud, bajo el Contrato No. HHSN261200800001E. El contenido de esta publicación no refleja necesariamente las opiniones o políticas del Departamento de Salud y Servicios Humanos, ni la mención de nombres comerciales, productos comerciales u organizaciones implica la aprobación por parte del Gobierno de los Estados Unidos

1. Purificación de proteínas
<ol><li>Prepare los buffers A–H, como se ve en la Tabla 1.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Solución de búfer</td>
			<td>Agente de almacenamiento en búfer (todos 20 mM)</td>
			<td>
pH
</td>
			<td>NaCl (mM)</td>
			<td>imidazol (mM)</td>
			<td>MgCl2</td>...

<ol>
	<li>Cox, A. D., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation:+more+than+just+glue.">Protein prenylation: more than just glue.</a> Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).</li><li>Zhang, F. L., Casey, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Prenylation:+Molecular+Mechanisms+and+Functional+Consequences.">Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).</li><li>Hottman, D. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation+and+synaptic+plasticity:+implications+for+Alzheimer's+disease.">Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease.</a> Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).</li><li>Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+and+cognition+in+neurodegenerative+disorders.">HDL and cognition in neurodegenerative disorders.</a> Neurobiology of Disease. 72, 22-36 (2014).</li><li>Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pleiotropic+effect+of+statins:+prevention+of+cardiac+hypertrophy+by+cholesterol-independent+mechanisms.">A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms.</a> Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).</li><li>Kohnke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPase+prenylation+hierarchy+and+its+potential+role+in+choroideremia+disease.">Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease.</a> PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).</li><li>Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+prenylation+for+cancer+therapy.">Targeting protein prenylation for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).</li><li>Kho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tagging-via-substrate+technology+for+detection+and+proteomics+of+farnesylated+proteins.">A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).</li><li>Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAAX+geranylgeranyl+transferase+transfers+farnesyl+as+efficiently+as+geranylgeranyl+to+RhoB.">CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).</li><li>Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dragging+ras+back+in+the+ring.">Dragging ras back in the ring.</a> Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+in+Membrane+Biochemistry+and+Biophysics.">Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics.</a> Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).</li><li>Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Step-by-step+Method+for+the+Reconstitution+of+an+ABC+Transporter+into+Nanodisc+Lipid+Particles.">A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).</li><li>Dementiev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-Ras4B+lipoprotein+synthesis:+biochemical+characterization,+functional+properties,+and+dimer+formation.">K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation.</a> Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+recombinant+human+Kirsten-ras+(4B)+p21+produced+at+high+levels+in+Escherichia+coli+and+insect+baculovirus+expression+systems.">Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).</li><li>Gillette, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Farnesylated+and+Methylated+Proteins+in+an+Engineered+Insect+Cell+System.">Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).</li><li>Agamasu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS+Prenylation+Is+Required+for+Bivalent+Binding+with+Calmodulin+in+a+Nucleotide-Independent+Manner.">KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner.</a> Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).</li><li>Talsania, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Assembly+and+Annotation+of+the+Trichoplusia+ni+Tni-FNL+Insect+Cell+Line+Enabled+by+Long-Read+Technologies.">Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies.</a> Genes. 10 (2), 79 (2019).</li><li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RAS+function+through+targeting+an+allosteric+regulatory+site.">Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site.</a> Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+polyisoprenylated+Ras+proteins+in+the+insect/baculovirus+system.">Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system.</a> Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).</li><li>Dharmaiaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+recognition+of+farnesylated+and+methylated+KRAS4b+by+PDE&#948;.">Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDE&#948;.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).</li><li>Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanism+of+drug/Lipid+membrane+interactions+using+Biacore.">Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore.</a> Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).</li><li>Fisher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interactions+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+with+oligonucleotides.">Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).</li><li>Lakshman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+biophysical+analysis+defines+key+components+modulating+recruitment+of+the+GTPase+KRAS+to+the+plasma+membrane.">Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).</li></ol>

Como se indica en la sección Resultados representativos, el paso más crítico durante la purificación es el manejo de la muestra durante el tiempo que se encuentra en sal más baja. Limitar el tiempo que la muestra está expuesta a menos de 200 mM NaCl ayudará a reducir la precipitación y aumentar el rendimiento de la muestra. La interpretación de los resultados del CEX puede ser difícil si el perfil no coincide con las expectativas (véase la figura 2). Hasta que el protocolo se haya...

Las modificaciones posttranslacionales desempeñan un papel clave en la definición de la actividad funcional de las proteínas. Modificaciones como la fosforilación y la glicosilación están bien establecidas. Sin embargo, las modificaciones de lípidos están menos bien caracterizadas. Se estima que hasta el 0,5% de todas las proteínas celulares pueden ser preniladas1. La prenilación es la transferencia de una farnesil de 15 carbonoos o una cadena de lípidos de geranylgeranilo de 20 carbono a una proteína de recepción que contiene el motivo CAAX2. Las proteínas preniladas se han implicado en la progresión de varias enfermedades humanas incluyendo el envejecimiento prematuro3, Alzheimer4, disfunción cardíaca5, choroideremia6, y cáncer7. Las pequeñas GTPases, HRAS, NRAS y KRAS1,lamininses nucleares y los quinetocoros CENP-E y F son proteínas farnesyladas bajo la condición basal. Otras pequeñas GTPases, a saber, RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42, y RRAS son geranylgeranylated8, mientras que RhoB puede ser farnesylated o geranylgeranylated9.
La pequeña GTPase KRAS4b funciona como un interruptor molecular, esencialmente transmitiendo la señalización del factor de crecimiento extracelular a las vías de transducción de señal intracelular que estimulan el crecimiento celular y la proliferación, a través de múltiples interacciones proteína-proteína. Hay dos aspectos clave de la bioquímica KRAS4b que son esenciales para su actividad. En primer lugar, los ciclos proteicos entre un PIB inactivo y un estado vinculado a GTP activo mediante el cual se involucra activamente con los efectores. En segundo lugar, una región de polilisina C-terminal y una cisteína farnesilada y carboximetilada dirigen la proteína a la membrana plasmática, permitiendo el reclutamiento y activación de efectos aguas abajo. Mutant KRAS4b es un conductor oncogénico en el cáncer de páncreas, colorrectal y pulmón10,y como tal, la intervención terapéutica tendría un enorme beneficio clínico. La producción de proteína recombinante auténticamente modificada que esté farnesilada y carboximetilada permitiría el cribado bioquímico utilizando KRAS4b en combinación con sustitutos de membrana como liposomas o nanodiscos lipídicos11,12.
Farnesyl transferase (FNT) cataliza la adición de pirofosfato de farnesil a la cisteína Terminal C en el motivo CAAX en KRAS4b. Después de la prenilación, la proteína se trafica al retículo endoplasmático (ER) donde la enzima conversora Ras (RCE1) corta los tres residuos C-terminal. El último paso en el procesamiento es la metilación del nuevo residuo de farnesilcisteína C-terminal por la proteína de membrana ER, isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase (ICMT). La expresión de KRAS4b recombinante en E. coli da como resultado la producción de una proteína no modificada. Los intentos anteriores de producir KRAS4b procesado han sido limitados debido a rendimientos insuficientes para experimentos estructurales o de detección de drogas o no han podido recapitular la proteína madura nativa de longitud completa13,14. El protocolo presentado aquí utiliza un sistema de expresión de células de insectos basado en baculovirus de ingeniería y un método de purificación que genera KRAS4b altamente purificado y completamente procesado a rendimientos de 5 mg/L de cultivo celular.
La caracterización cuidadosa de las proteínas es esencial para validar la calidad de las proteínas recombinantes antes de embarcarse en la biología estructural o en estudios de detección de fármacos. Dos parámetros clave de KRAS4b completamente procesado son la validación de la correcta modificación prenilo y la disponibilidad de la termino C farnesylated y carboxymethylated C-terminus (FMe) para la interacción con sustitutos de membrana o lípidos. La espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS) del KRAS4b-FMe se utilizó para medir el peso molecular y confirmar la presencia de las modificaciones de farnesilo y carboximetil. La espectrometría de masas nativa, donde las muestras se pulverizan con disolventes no desnaturalizantes, se utilizó para demostrar que KRAS4b-FMe también estaba vinculado a su cofactor del PIB. Finalmente, se utilizó espectroscopia de resonancia de plásmo superficial para medir la unión directa de KRAS4b-FMe con liposomas inmovilizados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>30211SS-1232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>850457</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>840034</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5427R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A998-1 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09689-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>ARUP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate 384</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore T200 Instrument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Snap-It Seals, T/S</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-54B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonic Bath</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-336-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation Exchange Chromatography (CEX) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018183</td>
			<td>HiPrep SP Sepharose High Performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyna Pro Plate Reader</td>
			<td>Wyatt Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exactive Plus EMR Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0507-500Ml</td>
			<td>Use Reagent Grade or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson vials 7x14 mm Tubes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass screw thread vials with PTFE foam liners</td>
			<td>Scientific Specialities</td>
			<td>B69302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed/benchtop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>05-112-114D</td>
			<td>capable of up to 4,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>92414</td>
			<td>Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9365-51</td>
			<td>HisPrep FF 16/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-House Water Supply, Arium Advance</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td></td>
			<td>Resistivity of 18 M&#937;0-cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid extruder set with holder</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI-DEWAR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M110-EH microfluidizer</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 &#197;, 2.1 x 150 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagTran software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC Grade</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>BDH20864.400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>78880002</td>
			<td>NGC QuestTM 100 Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Caps type 3</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series S Sensor Chip L1</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29104993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>13-400-519</td>
			<td>Absorbace at 280nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>PES membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima - L80K</td>
			<td>capable of 100,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733-1L</td>
			<td>May use in-house water source (see below)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter</td>
			<td>GE Healthcare - Whatman</td>
			<td>6994-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur QualBrowser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>proteomics software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein

La prenilación proteica es una modificación clave que es responsable de dirigir las proteínas a las membranas intracelulares. KRAS4b, que está mutado en el 22% de los cánceres humanos, es procesado por farnesylation y carboximetilación debido a la presencia de un motivo de caja 'CAAX' en la terminal C. Se utilizó un sistema de baculovirus diseñado para expresar KRAS4b farnesylated y carboxymethylated en células de insectos y se ha descrito anteriormente. Aquí, describimos la purificación detallada y práctica y la caracterización bioquímica de la proteína. Específicamente, la afinidad y la cromatografía de intercambio iónico se utilizaron para purificar la proteína a la homogeneidad. Se utilizó espectrometría de masas intacta y nativa para validar la correcta modificación de KRAS4b y para verificar la unión de nucleótidos. Finalmente, la asociación de membranas de KRAS4b farnesylated y carboximetilado a liposomas se midió utilizando espectroscopía de resonancia plasmórica superficial.

Una de las variables más grandes en el protocolo es la cantidad de proteína diana expresada (His6-MBP-tev-KRAS4b). Este protocolo fue desarrollado utilizando un aislado de una línea celular Trichoplusia ni, Tni-FNL17,adaptada para el crecimiento de la suspensión y destetado del suero. Dada la amplia gama de resultados reportados a través de las diversas líneas celulares de insectos con el sistema de expresión de baculovirus, es aconsejable que Tni-FNL se utilice, al menos inicialme...

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Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

La prenilación es una modificación importante en las proteínas de unión de membrana periférica. Las células de insectos se pueden manipular para producir KRAS4b farnesilado y carboximetilado en cantidades que permiten mediciones biofísicas de interacciones proteína-proteína y proteína-lípidos

KRAS4b recombinante totalmente procesado: Aislamiento y caracterización de la proteína farnesilada y metilada

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Nuestro protocolo permite el aislamiento y la separación de KRAS debidamente procesado a alto rendimiento. La producción de KRAS auténticamente farnesilada y carboximetilada permite realizar experimentos que tienen KRAS en su membrana al igual que en las células de mamíferos. El alto rendimiento del protocolo lo diferencia del trabajo anterior.Normalmente purificamos de tres a cinco miligramos de proteína por litro de material de expresión. Esto nos permite llevar a cabo una variedad de experimentos biofísicos y de biología estructural. KRAS está mutado en el 20% de los cánceres y el 90% en cánceres de páncreas.Así que tener un protocolo para producir proteína auténticamente procesada es bastante útil para el desarrollo de pantallas de drogas para que pueda estudiar la proteína real como lo sería en la membrana de las células cancerosas. Este protocolo también es muy útil para estudiar otras proteínas que están farnesiladas y completamente procesadas en las células. Y como tal, todo lo que necesita hacer es cambiar el KRAS con la proteína de interés y ponerlo en el baculovirus.Los pasos críticos son los que rodean la cromatografía de intercambio catióntico. El uso de la columna adecuada y la limitación del tiempo que la proteína está en un tampón de sal baja son esenciales para el éxito. Entender que la precipitación no es un tipo de evento de globo de nieve ayuda a guiar a los nuevos en el protocolo.Esto se refuerza mostrando la necesidad de dividir la carga de la columna de intercambio catiónica en varias cargas más pequeñas. Después de la elección de las células, la aclaración del analito, y la purificación de la proteína diana por IMAC, analizar las fracciones de proteína utilizando la página SDS y la tinción de Coomassie. Agrupa las fracciones máximas y marca la piscina durante la noche contra dos litros de tampón D a cuatro grados centígrados.Al día siguiente, retire la muestra de diálisis y centrifugarlo a 4.000 veces g durante 10 minutos para eliminar cualquier precipitado. La muestra dialilizada y clarificada final a menudo sigue siendo brumosa, pero se puede aplicar a la columna CEX sin procesamiento adicional. Preparar la columna de intercambio catiónica de 20 mililitros lavándola con tres volúmenes de columna de tampón G, luego con tres volúmenes de columna de tampón F.Next, diluir 20 mililitros de la muestra dializada a una concentración final de cloruro de sodio de 100 mililitros añadiendo 20 mililitros de buffer E y aplicar la muestra a la columna de intercambio.Es fundamental diluir la pequeña cantidad de la muestra en lugar de todas a la vez y las muestras diluidas se deben aplicar a la columna inmediatamente después de la dilución para limitar la precipitación de la proteína. Continúe cargando la columna con muestra recién diluida a medida que la dilución anterior se acerca al final de la carga. A continuación, lave la columna hasta la absorbancia de línea base 280 con el búfer F, que normalmente requiere tres volúmenes de columna.Eluir la proteína de la columna con un gradiente de 400 mililitros del tampón F al 65%buffer G, recogiendo el eluyente en fracciones de seis mililitros. Una vez completado el gradiente, continúe lavando la columna para obtener volúmenes adicionales de 1,5 columnas de 65%buffer G.Elija las fracciones positivas basadas en la página SDS y el análisis de manchas De Coomassie Blue, así como la inspección del rastro UV del cromatograma. Luego une la proteína y digiere con His6 TEV proteasa de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.Después de la digestión y la diálisis, cargue la proteína en una columna IMAC de 20 mililitros equilibrada con tampón A a tres mililitros por minuto. Recoger siete fracciones de mililitros durante esta cromatografía y lavar la columna con un total de tres volúmenes de columna de tampón A o hasta que se alcance la absorbancia basal. Eluda la proteína diana con un gradiente de volumen de cinco columnas del tampón C del 0% al 10% y recoja siete fracciones de mililitros.A continuación, identifique las fracciones positivas con la página SDS. Cuando se analiza con la página SDS, el lysate clarificado debe contener una banda oscura que migra a unos 65 kilodaltones que corresponde a la proteína de fusión His6-MBP-tev-KRAS4b. El FNTAb co-expresado migra a 48 kilodaltons.El paso CEX dentro de la purificación es crítico porque reduce el alcance de la proteólisis y enriquece la proteína totalmente procesada, pero es la parte más complicada del protocolo. Un resultado típico de este paso tiene un pico prominente tres con el KRAS4b-FMe, pero los perfiles de elución pueden ser variables. El análisis de masa intacto utilizando ESIMS confirma la masa molecular precisa de las proteínas y, por lo tanto, la proporción relativa de farnesilación o carboximetilación.Mientras que los lotes finales típicos contenían algunos KRAS4b-FARN detectables, esta proporción era inferior al 15% en términos de altura máxima a partir de este análisis. El análisis de masa nativo se utilizó para determinar la masa del KRAS4b vinculado al PIB. El disolvente de muestra se cambió por acetato de amonio para garantizar una ionización más suave que permite que el complejo nativo permanezca intacto.La interacción de KRAS4b-FMe y los liposomas se midió con resonancia de plasmon superficial para validar que la farnesilación y la carboximetilación son necesarias para que KRAS4b-FMe se una a las membranas. Como era de esperar, KRAS4b-FMe se unió a los liposomas, mientras que KRAS4b sin procesar no lo hizo. Minimizar el tiempo que la proteína está expuesta a la sal baja es el aspecto más crítico del protocolo que afecta el rendimiento.La proteína sólo está brevemente en esta baja concentración de sal después de la dilución en el tampón E.La proteína se puede utilizar para una variedad de experimentos biofísicos que utilizan miméticos de membrana como liposomas o nanodiscos para investigar con qué lípidos interactúa KRAS. Usando estos datos, podemos comenzar a extrapolar cómo KRAS interactúa con la membrana plasmática de la célula. Utilizando KRAS-FMe purificado, nuestros colegas fueron capaces de resolver la estructura de cristal de rayos X de KRAS en complejo con un chaperone que es específico para la forma farnesilada y metilada de esta proteína.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Investigación

Bioquímica

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