Name: fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein
Uploaded: 2020-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein at JoVE.com

Vi erkänner kloning och uttrycks stöd från Carissa Grose, Jen Melhalko, och Matt Drew i protein Expression Laboratory, Frederick National laboratorium för cancer forskning. Detta projekt har finansierats helt eller delvis med federala medel från National Cancer Institute, National Institutes of Health, enligt kontrakt nr. HHSN261200800001E. Innehållet i denna publikation återspeglar inte nödvändigtvis åsikter eller politik Institutionen för hälsa och mänskliga tjänster, inte heller nämner handelsnamn, kommersiella produkter eller organisationer innebär godkännande av den amerikanska regeringen

1. protein rening
<ol><li>Förbered buffertarna A – H, som framgår av tabell 1.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Buffertlösning</td>
			<td>Buffrande medel (alla 20 mM)</td>
			<td>
pH
</td>
			<td>NaCl (mM)</td>
			<td>Imidazol (mM)</td>
			<td>MgCl2</td>
			<td>
TCE<str...

<ol>
	<li>Cox, A. D., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation:+more+than+just+glue.">Protein prenylation: more than just glue.</a> Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).</li><li>Zhang, F. L., Casey, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Prenylation:+Molecular+Mechanisms+and+Functional+Consequences.">Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).</li><li>Hottman, D. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation+and+synaptic+plasticity:+implications+for+Alzheimer's+disease.">Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease.</a> Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).</li><li>Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+and+cognition+in+neurodegenerative+disorders.">HDL and cognition in neurodegenerative disorders.</a> Neurobiology of Disease. 72, 22-36 (2014).</li><li>Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pleiotropic+effect+of+statins:+prevention+of+cardiac+hypertrophy+by+cholesterol-independent+mechanisms.">A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms.</a> Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).</li><li>Kohnke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPase+prenylation+hierarchy+and+its+potential+role+in+choroideremia+disease.">Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease.</a> PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).</li><li>Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+prenylation+for+cancer+therapy.">Targeting protein prenylation for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).</li><li>Kho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tagging-via-substrate+technology+for+detection+and+proteomics+of+farnesylated+proteins.">A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).</li><li>Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAAX+geranylgeranyl+transferase+transfers+farnesyl+as+efficiently+as+geranylgeranyl+to+RhoB.">CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).</li><li>Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dragging+ras+back+in+the+ring.">Dragging ras back in the ring.</a> Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+in+Membrane+Biochemistry+and+Biophysics.">Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics.</a> Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).</li><li>Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Step-by-step+Method+for+the+Reconstitution+of+an+ABC+Transporter+into+Nanodisc+Lipid+Particles.">A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).</li><li>Dementiev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-Ras4B+lipoprotein+synthesis:+biochemical+characterization,+functional+properties,+and+dimer+formation.">K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation.</a> Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+recombinant+human+Kirsten-ras+(4B)+p21+produced+at+high+levels+in+Escherichia+coli+and+insect+baculovirus+expression+systems.">Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).</li><li>Gillette, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Farnesylated+and+Methylated+Proteins+in+an+Engineered+Insect+Cell+System.">Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).</li><li>Agamasu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS+Prenylation+Is+Required+for+Bivalent+Binding+with+Calmodulin+in+a+Nucleotide-Independent+Manner.">KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner.</a> Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).</li><li>Talsania, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Assembly+and+Annotation+of+the+Trichoplusia+ni+Tni-FNL+Insect+Cell+Line+Enabled+by+Long-Read+Technologies.">Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies.</a> Genes. 10 (2), 79 (2019).</li><li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RAS+function+through+targeting+an+allosteric+regulatory+site.">Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site.</a> Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+polyisoprenylated+Ras+proteins+in+the+insect/baculovirus+system.">Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system.</a> Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).</li><li>Dharmaiaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+recognition+of+farnesylated+and+methylated+KRAS4b+by+PDE&#948;.">Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDE&#948;.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).</li><li>Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanism+of+drug/Lipid+membrane+interactions+using+Biacore.">Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore.</a> Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).</li><li>Fisher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interactions+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+with+oligonucleotides.">Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).</li><li>Lakshman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+biophysical+analysis+defines+key+components+modulating+recruitment+of+the+GTPase+KRAS+to+the+plasma+membrane.">Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).</li></ol>

Som nämnts i avsnittet representativa resultat är det mest kritiska steget under rening hanteringen av provet under den tid det är i lägre salt. Att begränsa den tid som provet utsätts för mindre än 200 mM NaCl hjälper till att minska nederbörden och öka prov avkastningen. Tolkningen av resultaten av CEX kan vara svår om profilen inte motsvarar förväntningarna (se figur 2). Fram till dess att protokollet har blivit rutinmässigt, rekommenderas att de CEX-elutionsfraktioner som ...

Posttranslationella modifieringar spelar en viktig roll för att definiera proteiners funktionella aktivitet. Förändringar såsom fosforylering och glykosylering är väl etablerade. Lipid modifieringar är mindre väl kännetecknas, dock. Det uppskattas att så mycket som 0,5% av alla cellulära proteiner kan vara prenylated1. Prenylation är överföringen av en 15-kol enzymet eller en 20-kol geranylgeranyl lipid kedja till ett acceptor protein som innehåller caax motiv2. Prenylerade proteiner har varit inblandade i utvecklingen av flera mänskliga sjukdomar inklusive för tidigt åldrande3, Alzheimers4, hjärtdysfunktion5, choroideremia6, och cancer7. De små GTPases, HRAS, NRAS, och KRAS1, nukleära lamininer, och kinetochores cenp-E och F är farnesylated proteiner under basal villkoret. Andra små GTPases, nämligen RhoA, RhoC, Rac1, CDC-42, och RRAS är geranylgeranylated8, medan rhob kan vara farnesylated eller geranylgeranylated9.
Den lilla GTPase KRAS4b fungerar som en molekylär switch, i huvudsak sänder extracellulära tillväxtfaktor signalering till intracellulära signaltransduktion vägar som stimulerar celltillväxt och spridning, via flera protein-protein interaktioner. Det finns två viktiga aspekter av KRAS4b biokemi som är viktiga för dess verksamhet. Först, proteinet cykler mellan en inaktiv BNP och en aktiv GTP bunden stat där den aktivt engagerar med effectors. För det andra, en C-Terminal Poly-Lysine regionen och en farnesylated och karboxymetylerade cystein direkt proteinet till plasmamembranet, möjliggör rekrytering och aktivering av nedströms effectors. Mutant KRAS4b är en onkogena förare i bukspottskörteln, kolorektal, och lungcancer10, och som sådan, terapeutiska ingrepp skulle ha en enorm klinisk nytta. Framställning av autentiskt modifierat rekombinant protein som är farnesylerat och karboxymetylerat skulle möjliggöra biokemisk screening med KRAS4b i kombination med membran surrogat såsom liposomer eller lipidnanoskivor11,12.
Enzymet transferas (FNT) katalyserar tillsatsen av enzymet pyrofosfat till C-terminalen cystein i caax motiv i KRAS4b. Efter prenylering, är proteinet smugglas till endoplasmatiska Retikulum (ER) där ras omvandla enzymet (RCE1) klyver de tre C-Terminal rester. Det sista steget i behandlingen är metylering av den nya C-terminalen farnesylcystein rester av ER membranprotein, isoprenylcystein karboxyl metyltransferas (ICMT). Uttryck för rekombinant KRAS4b i E. coli resulterar i produktion av ett icke modifierat protein. Tidigare försök att producera bearbetade KRAS4b har begränsats på grund av otillräcklig avkastning för strukturella eller Drug screening experiment eller har misslyckats med att recapitulate den infödda fullängds mogna protein13,14. Det protokoll som presenteras här använder en konstruerad Baculovirus-baserade insekt cell Expression system och reningsmetod som genererar mycket renas, fullt bearbetade KRAS4b på avkastningen på 5 mg/L cellkultur.
Noggrann proteinkarakterisering är avgörande för att validera kvaliteten på rekombinanta proteiner innan man påbörjar strukturell biologi eller drog screening studier. Två viktiga parametrar för fullt bearbetade KRAS4b är validering av korrekt av modifiering och tillgängligheten av farnesylated och karboxymetylerade C-terminus (FME) för interaktion med membran substitut eller lipider. Electrospray jonisering masspektrometri (ESI-MS) av KRAS4b-FME användes för att mäta molekylvikt och bekräfta närvaron av enzymet och karboxymetylmodifikationer. Native masspektrometri, där proverna sprejas med nondenaturing lösningsmedel, användes för att visa att KRAS4b-FMe också var bunden till sin BNP-kofaktor. Slutligen användes ytplasmon resonans spektroskopi för att mäta den direkta bindningen av KRAS4b-FMe med immobiliserade liposomer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>30211SS-1232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>850457</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>840034</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5427R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A998-1 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09689-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>ARUP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate 384</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore T200 Instrument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Snap-It Seals, T/S</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-54B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonic Bath</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-336-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation Exchange Chromatography (CEX) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018183</td>
			<td>HiPrep SP Sepharose High Performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyna Pro Plate Reader</td>
			<td>Wyatt Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exactive Plus EMR Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0507-500Ml</td>
			<td>Use Reagent Grade or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson vials 7x14 mm Tubes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass screw thread vials with PTFE foam liners</td>
			<td>Scientific Specialities</td>
			<td>B69302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed/benchtop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>05-112-114D</td>
			<td>capable of up to 4,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>92414</td>
			<td>Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9365-51</td>
			<td>HisPrep FF 16/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-House Water Supply, Arium Advance</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td></td>
			<td>Resistivity of 18 M&#937;0-cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid extruder set with holder</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI-DEWAR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M110-EH microfluidizer</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 &#197;, 2.1 x 150 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagTran software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC Grade</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>BDH20864.400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>78880002</td>
			<td>NGC QuestTM 100 Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Caps type 3</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series S Sensor Chip L1</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29104993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>13-400-519</td>
			<td>Absorbace at 280nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>PES membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima - L80K</td>
			<td>capable of 100,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733-1L</td>
			<td>May use in-house water source (see below)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter</td>
			<td>GE Healthcare - Whatman</td>
			<td>6994-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur QualBrowser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>proteomics software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein

Proteinprenylering är en viktig modifiering som är ansvarig för att rikta proteiner till intracellulära membran. KRAS4b, som är muterad i 22% av mänskliga cancerformer, bearbetas av farnesylation och karboxymetylering på grund av närvaron av en "CAAX" låda motiv på C-Terminus. Ett konstruerat baculoviridae-system användes för att uttrycka farnesylerade och karboxymetylerade KRAS4b i insekts celler och har beskrivits tidigare. Här beskriver vi den detaljerade, praktiska renings-och biokemiska karakteriseringen av proteinet. Specifikt användes affinitet och jonbyteskromatografi för att rena proteinet till homogenitet. Intakt och infödd masspektrometri användes för att validera den korrekta modifieringen av KRAS4b och för att verifiera nukleotidbindning. Slutligen, membran Association av farnesylated och karboxymetylerade KRAS4b till liposomer mättes med hjälp av ytan plasmon resonans spektroskopi.

En av de största variablerna i protokollet är mängden uttryckt målprotein (His6-MBP-TeV-KRAS4b). Detta protokoll utvecklades med hjälp av ett isolat från en Trichoplusia ni -celllinje, TNI-FNL17, anpassad för suspension tillväxt och avvanda från serum. Med tanke på det stora utbudet av resultat som rapporteras över de olika insekternas cellinjer med baculoviridae Expression system, är det tillrådligt att TNI-FNL användas, åtminstone inledningsvis, för att produceras KRAS4b...

Watch this Scientific Journal Video about Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein at JoVE.com

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Prenylering är en viktig modifiering av perifera membran bindnings proteiner. Insekts celler kan manipuleras för att producera farnesylerade och karboxymetylerade KRAS4b i mängder som möjliggör biofysiska mätningar av interaktioner mellan protein och protein och lipider

Fullständigt bearbetat rekombinant KRAS4b: isolerar och karakteriserar det farnesylerade och metylerade proteinet

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Vårt protokoll möjliggör isolering och separation av korrekt bearbetade KRAS vid hög avkastning. Produktionen av autentiskt farnesylerade och karboxylerade KRAS gör det möjligt att utföra experiment som har KRAS i sitt membran precis som i däggdjursceller. Den höga avkastningen av protokollet skiljer det från tidigare arbete.Vi renar typiskt tre till fem milligram protein per liter uttrycksmaterial. Detta gör det möjligt för oss att genomföra en mängd olika biofysiska och strukturella biologi experiment. KRAS är muterad i 20% av cancer och 90%i cancer i bukspottskörteln.Så att ha ett protokoll för att producera autentiskt bearbetat protein är ganska användbart för att utveckla läkemedelsskärmar så att du kan studera det faktiska proteinet som det skulle vara på membranet av cancerceller. Detta protokoll är också mycket användbart för att studera andra proteiner som är farnesylerade och helt bearbetade i cellerna. Och som sådan, allt du behöver göra är att byta ut KRAS med protein av intresse och lägga den i baculovirus.De kritiska stegen är de runt katjonbyteskromatografin. Använda rätt kolumn och begränsa den tid proteinet är i låg saltbuffert är avgörande för framgång. Förstå att nederbörden inte är en snö klot typ av händelse hjälper vägleda de nya till protokollet.Detta förstärks genom att visa behovet av att dela in katjonutbyteskolumnens belastning i flera mindre laster. Efter att celler har lyst, klarlägga lysate, och rening av målproteinet genom IMAC, analysera proteinfraktionerna med hjälp av SDS-sida och Coomassie-färgning. Pool toppen fraktioner och dialyze poolen över natten mot två liter buffert D vid fyra grader Celsius.På nästa dag, ta bort provet från dialys och centrifug den vid 4, 000 gånger g i 10 minuter för att avlägsna eventuell fällning. Det slutliga dialyserade och klargj橬一j provet är ofta stilla diszy men kan appliceras till CEX-kolonnen utan mer ytterligare behandling. Förbered 20 milliliter katjon utbyte kolumn genom att tvätta den med tre kolumn volymer buffert G, sedan med tre kolumn volymer buffert F.Next, späd 20 milliliter av dialyserade provet till en slutlig natriumklorid koncentration av 100 millimolar genom att lägga till 20 milliliter av buffert E och tillämpa provet till utbyte kolumnen.Det är avgörande att späda ut den lilla mängden av provet i stället för alla på en gång och de utspädda proverna bör appliceras på kolonnen omedelbart efter spädning för att begränsa utfällningen av proteinet. Fortsätt att belasta kolonnen med nyspädda prov när den föregående spädningen närmar sig lastens ände. Tvätta sedan kolonnen till baslinjen absorbans 280 med buffert F som normalt kräver tre kolumnvolymer.Elute proteinet från kolonnen med en 400 milliliter gradient från buffert F till 65%buffert G, samla eluent i sex milliliter fraktioner. När övertoningen är klar, fortsätt tvätta kolonnen för ytterligare 1,5 kolonnvolymer på 65%buffert G.Välj de positiva fraktionerna baserat på både SDS-sidan och Coomassie Blue-fläckanalys samt inspektion av UV-spår av kromatogrammet. Sedan poola proteinet och smälta det med His6 TEV proteas enligt manuskriptet riktningar.Efter matsmältning och dialys, ladda proteinet på en 20 milliliter IMAC kolumn ekvilirated med buffert A på tre milliliter per minut. Samla in sju milliliterfraktioner under denna kromatografi och tvätta kolonnen med totalt tre kolonnvolymer av buffert A eller tills baslinjens absorbans har uppnåtts. Elute målet proteinet med fem kolumn volymgradient av buffert C från 0%till 10%och samla in sju milliliter fraktioner.Identifiera sedan de positiva bråktalen med SDS-sidan. När den analyseras med SDS sida, den förtydligade lysate bör innehålla ett mörkt band som migrerar till cirka 65 kilodalton som motsvarar fusion proteinEt His6-MBP-tev-KRAS4b. Den co-uttryckta FNTAb migrerar till 48 kilodalton.CEX-steget inom reningen är kritiskt eftersom det minskar proteolysens omfattning och berikar det fullt bearbetade proteinet, men är den mest komplicerade delen av protokollet. Ett typiskt resultat från detta steg har en framträdande topp tre med KRAS4b-FMe men elution profiler kan vara variabel. Intakt massanalys med hjälp av ESIMS bekräfta den exakta molekylära massan av proteinerna och därigenom den relativa andelen farnesylation eller karboxyletylering.Medan typiska slutliga partier innehöll några detekterbara KRAS4b-FARN, var denna andel mindre än 15%när det gäller topphöjd från denna analys. Native massanalys användes för att bestämma massan av KRAS4b bunden till BNP. Provet lösningsmedel utbyttes mot ammoniumacetat för att säkerställa en mjukare jonisering gör det möjligt för den inhemska komplexet att stanna intakt.Interaktionen mellan KRAS4b-FMe och liposomer mättes med ytan plasmon resonans för att validera farnesylation och karboxymetylering krävs för KRAS4b-FMe att binda till membran. Som väntat, KRAS4b-FMe bunden till liposomer medan obearbetade KRAS4b inte. Minimera den tid proteinet utsätts för låg salt är den enskilt mest kritiska aspekten av protokollet som påverkar avkastningen.Proteinet är bara kortfattat på denna låga saltkoncentration efter utspädningen i buffert E.The proteinet kan användas för en mängd olika biofysiska experiment som använder membran mimetika som liposomer eller nanodiscer för att undersöka vilka lipider KRAS interagerar med. Med hjälp av dessa data kan vi börja extrapolera hur KRAS interagerar med cellens plasmamembran. Med hjälp av renad KRAS-FMe kunde våra kollegor lösa kras-kristallstrukturen med röntgenkristallstruktur i komplex med ett förkläde som är specifikt för den farnesylerade och metylerade formen av detta protein.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Beredning och leverans av protein mikrokristaller i lipida kubiska fasen för Serial Femtosecond Kristallografi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Undersöka Proteasome Montering med rekombinant archaeal proteasomerna och Nondenaturing SIDA: Fallet för ett kombinerat tillvägagångssätt

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Rekombinant Proteinuttryck, Kristallisation och Biofysiska Studier av a<em&gt; Bacillus</em&gt; -konserverad nukleotidpyrofosforylas, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: enstegs affinitet rening för parallell analys av Protein-Protein och Protein-metaboliten komplex

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analys av proteinveckning, Transport och nedbrytning i levande celler av radioaktiva puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Helt självständigt karakterisering och datainsamling från kristaller av biologiska makromolekyler

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Jonbyteskromatografi (IEX) kopplat till multi-Angle ljusspridning (MALS) för Protein Separation och karakterisering

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakterisera enskilda protein aggregat med infraröd Nanospektroskopi och atomkraft mikroskopi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...