Name: fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein
Uploaded: 2020-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein at JoVE.com

Biz Carissa Grose, Jen Melhalko ve Matt Drew Protein İfade Laboratuvarı, Frederick Ulusal Laboratuvarı Kanser Araştırma için klonlama ve ifade desteği kabul ediyoruz. Bu proje tamamen veya kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Sözleşme No altında Federal fonlar ile finanse edilmiştir. HHSN261200800001E. Bu yayının içeriği, Sağlık ve İnsanI Hizmetler Bakanlığı'nın görüşlerini veya politikalarını yansıtmadığı gibi ticari adlardan, ticari ürünlerden veya kuruluşlardan bahsetmek de ABD Hükümeti tarafından onaylandığı anlamına gelmez.

1. Protein arınması
<ol><li>Tablo 1'degörüldüğü gibi Arabellekleri A-H'yi hazırlayın.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Arabellek çözümü</td>
			<td>Arabelleğe alma aracısı (tüm 20 mM)</td>
			<td>
pH
</td>
			<td>NaCl (mM)</td>
			<td>imidazol (mM)</td>
			<td>MgCl2</td>
			<...

<ol>
	<li>Cox, A. D., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation:+more+than+just+glue.">Protein prenylation: more than just glue.</a> Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).</li><li>Zhang, F. L., Casey, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Prenylation:+Molecular+Mechanisms+and+Functional+Consequences.">Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).</li><li>Hottman, D. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+prenylation+and+synaptic+plasticity:+implications+for+Alzheimer's+disease.">Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease.</a> Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).</li><li>Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+and+cognition+in+neurodegenerative+disorders.">HDL and cognition in neurodegenerative disorders.</a> Neurobiology of Disease. 72, 22-36 (2014).</li><li>Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pleiotropic+effect+of+statins:+prevention+of+cardiac+hypertrophy+by+cholesterol-independent+mechanisms.">A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms.</a> Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).</li><li>Kohnke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPase+prenylation+hierarchy+and+its+potential+role+in+choroideremia+disease.">Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease.</a> PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).</li><li>Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+prenylation+for+cancer+therapy.">Targeting protein prenylation for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).</li><li>Kho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tagging-via-substrate+technology+for+detection+and+proteomics+of+farnesylated+proteins.">A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).</li><li>Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAAX+geranylgeranyl+transferase+transfers+farnesyl+as+efficiently+as+geranylgeranyl+to+RhoB.">CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).</li><li>Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dragging+ras+back+in+the+ring.">Dragging ras back in the ring.</a> Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+in+Membrane+Biochemistry+and+Biophysics.">Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics.</a> Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).</li><li>Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Step-by-step+Method+for+the+Reconstitution+of+an+ABC+Transporter+into+Nanodisc+Lipid+Particles.">A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).</li><li>Dementiev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-Ras4B+lipoprotein+synthesis:+biochemical+characterization,+functional+properties,+and+dimer+formation.">K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation.</a> Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+recombinant+human+Kirsten-ras+(4B)+p21+produced+at+high+levels+in+Escherichia+coli+and+insect+baculovirus+expression+systems.">Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).</li><li>Gillette, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Farnesylated+and+Methylated+Proteins+in+an+Engineered+Insect+Cell+System.">Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).</li><li>Agamasu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS+Prenylation+Is+Required+for+Bivalent+Binding+with+Calmodulin+in+a+Nucleotide-Independent+Manner.">KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner.</a> Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).</li><li>Talsania, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Assembly+and+Annotation+of+the+Trichoplusia+ni+Tni-FNL+Insect+Cell+Line+Enabled+by+Long-Read+Technologies.">Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies.</a> Genes. 10 (2), 79 (2019).</li><li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RAS+function+through+targeting+an+allosteric+regulatory+site.">Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site.</a> Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).</li><li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+polyisoprenylated+Ras+proteins+in+the+insect/baculovirus+system.">Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system.</a> Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).</li><li>Dharmaiaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+recognition+of+farnesylated+and+methylated+KRAS4b+by+PDE&#948;.">Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDE&#948;.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).</li><li>Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanism+of+drug/Lipid+membrane+interactions+using+Biacore.">Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore.</a> Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).</li><li>Fisher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interactions+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+with+oligonucleotides.">Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).</li><li>Lakshman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+biophysical+analysis+defines+key+components+modulating+recruitment+of+the+GTPase+KRAS+to+the+plasma+membrane.">Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).</li></ol>

Temsilci Sonuçları bölümünde belirtildiği gibi, arınma sırasında ki en kritik adım, numunenin daha düşük tuzda olduğu süre boyunca işlenmesidir. Numunenin 200 mM'den daha az NaCl'ye maruz kalma süresini sınırlamak yağışı azaltmaya ve numune verimini artırmaya yardımcı olacaktır. Profil beklentilerle uyuşmuyorsa CEX sonuçlarının yorumlanması zor olabilir (bkz. Şekil 2). Protokol rutin hale gelene kadar, ileriye götürülmeyen CEX elüs fraksiyonlarının, uyg...

Posttranslational değişiklikler proteinlerin fonksiyonel aktivitesinin tanımlanmasında önemli bir rol oynamaktadır. Fosforilasyon ve glikozilasyon gibi modifikasyonlar iyi belirlenmiştir. Lipid modifikasyonları daha az iyi karakterize, ancak. Tüm hücresel proteinlerin %0.5'inin prenylatedolabileceğitahmin edilmektedir. Prenilasyon 15 karbonlu farnesil veya 20 karbonlu geranylgeranyl lipid zincirinin CAAXmotifi 2içeren bir kabul proteinine aktarılmasıdır. Prenylated proteinler erken yaşlanma da dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıklarının ilerlemesi karıştığı olmuştur3, Alzheimer4, kardiyak disfonksiyon5, koreideremia6, ve kanser7. Küçük GTPases, HRAS, NRAS, ve KRAS1, nükleer lamininler, ve kinetochores CENP-E ve F bazal durum altında farneslü proteinlerdir. Diğer küçük GTPases, yani RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42, ve RRAS geranylgeranylated8, RhoB farneslü veya geranylgeranylated olabilir ise9.
Küçük GTPase KRAS4b moleküler bir anahtar olarak işlev görür, aslında hücre içi sinyal iletim yolları sinyal yoluyla hücre içi sinyal iletim yolları, birden fazla protein-protein etkileşimleri yoluyla. KRAS4b biyokimyasının aktivitesi için gerekli olan iki temel yönü vardır. İlk olarak, protein aktif olmayan bir GSYİh ile aktif GTP bağlı durum arasında döngüler ve bu da aktif olarak efektörlerle etkileşime girer. İkinci olarak, Bir C-terminal poli-lizin bölgesi ve farnesile ve karboksimetilile sistein plazma membran protein doğrudan, işe alma ve downstream efektörleri aktivasyonu sağlayan. Mutant KRAS4b pankreas bir onkojenik sürücü, kolorektal, ve akciğer kanseri10, ve gibi, terapötik müdahale büyük bir klinik yararı olurdu. Farnesile ve karboksimetilated otantik modifiye rekombinant protein üretimi lipozomlar veya lipid nanodiskler 11 gibi membran suretleri ile birlikte KRAS4b kullanarak biyokimyasal tarama sağlayacak11,12.
Farnesyl transferaz (FNT), KRAS4b'deki CAAX motifinde farnesil pirofosfat ın C-terminal sisteinına eklenmesini katalizler. Prenilasyondan sonra protein endoplazmik retikuluma (ER) kaçırılır ve Ras dönüştürücü enzim (RCE1) üç C-terminal kalıntısını bırakır. İşleme de son adım ER membran proteini, isoprenylsistein karboksil metiltransferaz (ICMT) tarafından yeni C-terminal farnesylsistein kalıntısı metilasyon olduğunu. E. coli rekombinant KRAS4b ifadesi değiştirilmemiş bir protein üretimi ile sonuçlanır. İşlenmiş KRAS4b üretmek için önceki girişimleri yapısal veya ilaç tarama deneyleri için yetersiz verim nedeniyle sınırlı olmuştur ya da yerli tam uzunlukta olgun protein13,14recapitulate başarısız oldu. Burada sunulan protokol, hücre kültürünün 5 mg/L verimlerinde yüksek oranda saflaştırılmış, tam olarak işlenmiş KRAS4b üreten, tasarlanmış bakülovirüs tabanlı böcek hücresi ekspresyonu sistemi ve arınma yöntemini kullanmaktadır.
Yapısal biyoloji veya ilaç tarama çalışmalarına başlamadan önce rekombinant proteinlerin kalitesini doğrulamak için dikkatli protein karakterizasyonu gereklidir. Tam olarak işlenmiş KRAS4b'in iki temel parametresi doğru prenyl modifikasyonunun doğrulanması ve farnesile ve karboksimetilileli C terminusun (FMe) membran ikameleri veya lipidleri ile etkileşim için kullanılabilirliğidir. KraS4b-FMe elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (ESI-MS) moleküler ağırlığı ölçmek ve farnesyl ve karboksimetil modifikasyonları varlığını doğrulamak için kullanılmıştır. Numunelerin nondenaturing çözücülerle püskürtüldüğü yerli kütle spektrometresi, KRAS4b-FMe'nin de GSYİh kofaktöre bağlı olduğunu göstermek için kullanıldı. Son olarak, yüzey plazmon rezonans spektroskopisi immobilize lipozomlar ile KRAS4b-FMe doğrudan bağlanmasını ölçmek için kullanılmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>30211SS-1232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>850457</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS)</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>840034</td>
			<td>purchase as liquid stocks in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5427R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A998-1 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09689-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>ARUP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate 384</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore T200 Instrument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Snap-It Seals, T/S</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-54B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonic Bath</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-336-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation Exchange Chromatography (CEX) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018183</td>
			<td>HiPrep SP Sepharose High Performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyna Pro Plate Reader</td>
			<td>Wyatt Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exactive Plus EMR Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0507-500Ml</td>
			<td>Use Reagent Grade or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson vials 7x14 mm Tubes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass screw thread vials with PTFE foam liners</td>
			<td>Scientific Specialities</td>
			<td>B69302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed/benchtop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>05-112-114D</td>
			<td>capable of up to 4,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>92414</td>
			<td>Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9365-51</td>
			<td>HisPrep FF 16/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-House Water Supply, Arium Advance</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td></td>
			<td>Resistivity of 18 M&#937;0-cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid extruder set with holder</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI-DEWAR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M110-EH microfluidizer</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 &#197;, 2.1 x 150 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>088790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagTran software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC Grade</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>BDH20864.400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>78880002</td>
			<td>NGC QuestTM 100 Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Caps type 3</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series S Sensor Chip L1</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29104993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>13-400-519</td>
			<td>Absorbace at 280nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>PES membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima - L80K</td>
			<td>capable of 100,000 xg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733-1L</td>
			<td>May use in-house water source (see below)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter</td>
			<td>GE Healthcare - Whatman</td>
			<td>6994-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur QualBrowser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>proteomics software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully processed recombinant kras4b: isolating and characterizing the farnesylated and methylated protein

Protein prenilasyon hücre içi membranlara proteinleri hedeflemekten sorumlu önemli bir değişikliktir. İnsan kanserlerinin %22'sinde mutasyona uğrayan KRAS4b, C-terminusta 'CAAX' kutu motifinin varlığı nedeniyle farnesilasyon ve karboksimetilasyon ile işlenir. Böcek hücrelerinde farnesile ve karboksimetillenmiş KRAS4b'yi ifade etmek için tasarlanmış bir baculovirus sistemi kullanılmıştır ve daha önce tanımlanmıştır. Burada proteinin detaylı, pratik saflaştırma ve biyokimyasal karakterizasyonu anlatılır. Özellikle proteini homojenliğe çıkarmak için yakınlık ve iyon değişimi kromatografisi kullanılmıştır. KRAS4b'nin doğru modifikasyonunun doğrulanması ve nükleotit bağlanmasının doğrulanması için sağlam ve yerli kütle spektrometresi kullanılmıştır. Son olarak, yüzey plazmon rezonans spektroskopisi ile farneslü ve karboksimetillenmiş KRAS4b'in membran ilişkisi ölçüldü.

Protokoldeki en büyük değişkenlerden biri ifade edilen hedef protein miktarıdır (His6-MBP-tev-KRAS4b). Bu protokol bir Trichoplusia ni hücre hattı bir izole kullanılarak geliştirilmiştir, Tni-FNL17, süspansiyon büyüme için uyarlanmış ve serum dan kesilmiş. Baculovirus ekspresyon sistemi ile çeşitli böcek hücre hatları arasında bildirilen sonuçların geniş göz önüne alındığında, Tni-FNL, en azından başlangıçta, KRAS4b-FMe üretilen kullanılması tavsiy...

Watch this Scientific Journal Video about Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein at JoVE.com

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Prenilasyon periferik membran bağlayıcı proteinler üzerinde önemli bir değişikliktir. Böcek hücreleri, protein-protein ve protein-lipid etkileşimlerinin biyofiziksel ölçümlerini sağlayan miktarlarda farnesile tedavüle ve karboksimetilatlanmış KRAS4b üretmek için manipüle edilebilir.

Tam İşlenmiş Rekombinant KRAS4b: Farnesile ve Metillenmiş Proteini Yalıtma ve Karakterize Etme

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Protokolümüz, yüksek verimde düzgün işlenmiş KRAS'lerin izolasyona ve ayrılmasına olanak sağlar. Otantik osuruklu ve karboksimetillenmiş KRAS üretimi, tıpkı memeli hücrelerinde olduğu gibi zarlarında KRAS olan deneylericra etmeyi mümkün kılar. Protokolün yüksek verimi onu önceki çalışmalarından ayırır.Biz genellikle ifade malzemenin litre başına protein 3-5 miligram arındırmak. Bu bize biyofiziksel ve yapısal biyoloji deneyleri çeşitli yürütmek için izin verir. KRAS kanserlerin% 20 ve pankreas kanserlerinde% 90 mutasyona uğrar.Yani otantik işlenmiş protein üretmek için bir protokole sahip olmak, kanser hücrelerinin zarında olduğu gibi gerçek proteini inceleyebilmeniz için ilaç ekranları geliştirmek için oldukça yararlıdır. Bu protokol aynı zamanda farnesile tedve tam olarak hücrelerde işlenmiş diğer proteinlerin incelenmesi için de çok yararlıdır. Ve bu yüzden, tek yapmanız gereken KRAS'ı ilgi proteiniyle takas etmek ve baculovirüse koymak.Kritik adımlar katyon değişimi kromatografisi etrafında olanlar. Uygun kolon kullanarak ve protein düşük tuz tampon içinde zaman sınırlayan başarı için gereklidir. Yağışın bir kar küresi türü olmadığınıanlamak, protokole yeni katılanlara rehberlik eder.Bu, katyon değişim sütunu yükünü birden çok küçük yüke bölme gereksinimi gösterilerek güçlendirilmiştir. Hücreleri lysing sonra, lysate açıklığa kavuşturulması, ve IMAC ile hedef protein arındırıcı, SDS sayfası ve Coomassie boyama kullanarak protein fraksiyonları analiz. Havuz tepe fraksiyonları ve dört santigrat derece tampon D iki litre karşı bir gecede havuz diyaliz.Ertesi gün, diyaliz den örnek çıkarın ve herhangi bir çökelti kaldırmak için 10 dakika boyunca 4.000 kez g santrifüj. Son diyalizve açıklık örneği genellikle hala puslu dur, ancak daha fazla işleme gerek kalmadan CEX sütununa uygulanabilir. Tampon G üç sütun hacimleri ile yıkayarak 20 mililitre katyon değişim sütunu hazırlayın, sonra tampon F.Next üç sütun hacimleri ile, tampon E 20 mililitre ekleyerek 100 milimolar son sodyum klorür konsantrasyonu için diyaliz numune20 mililitre seyreltmek ve değişim sütununa örnek uygulayın.Numunenin küçük bir miktarının tek seferde seyreltilmesi çok önemlidir ve seyreltilmiş numuneler, proteinin yağışını sınırlamak için seyreltildikten hemen sonra kolona uygulanmalıdır. Önceki seyreltme yükün sonuna yaklaştıkça, kolona taze seyreltilmiş numune yüklemeye devam edin. Ardından, genellikle üç sütun hacmi gerektiren arabellek F ile sütunu taban çizgisi emici 280'e yıkayın.Tampon F'den %65 tampon G'ye kadar 400 mililitrelik degradeile kolondaki proteini, elüent'i altı mililitre kesirlerde toplayarak elüent'i toplayın. Degrade tamamlandıktan sonra, %65 tampon G.SDS sayfası ve Coomassie Blue leke analizinin yanı sıra kromatogramın UV izini kontrol eden pozitif kesirleri seçin. Daha sonra proteini birleştirin ve el yazması talimatlara göre His6 TEV proteaz ile sindirin.Sindirim ve diyalizden sonra, proteini dakikada üç mililitre tampon A ile dengelenir 20 mililitrelik IMAC sütununa yükleyin. Bu kromatografi sırasında yedi mililitre fraksiyonları toplamak ve tampon A üç sütun hacmi toplam veya taban çizgisi absorbans ulaşıncaya kadar sütun yıkayın. Tampon C'nin beş sütun hacim gradyanı ile hedef proteini %0'dan %10'a kadar eve alın ve yedi mililitre fraksiyon toplayın.Ardından Pozitif kesirleri SDS sayfası ile tanımlayın. SDS sayfası ile analiz edildiğinde, açıklık lısat füzyon proteinhis6-MBP-tev-KRAS4b karşılık gelen yaklaşık 65 kilodalton göç karanlık bir bant içermelidir. Ortak ifade FNTAb 48 kilodaltons göç eder.Proteoziz derecesini azaltır ve tam olarak işlenmiş protein zenginleştirir, çünkü arıtma içinde CEX adım önemlidir, ancak protokolün en karmaşık parçasıdır. Bu adımdan tipik bir sonuç KRAS4b-FMe ile belirgin bir tepe üç vardır, ancak elüsasyon profilleri değişken olabilir. ESIMS kullanılarak yapılan sağlam kütle analizi proteinlerin kesin moleküler kütlesini ve böylelikle farnesilasyon veya karboksimetilasyonun göreceli oranını doğrular.Tipik son kuralar bazı saptanabilir KRAS4b-FARN içermekle birlikte, bu oran bu analizden en yüksek yükseklik açısından %15'ten daha azdı. KRAS4b'nin GSYİh'ya bağlı kütlesini belirlemek için yerli kitle analizi kullanılmıştır. Örnek çözücü, doğal kompleksin bozulmadan kalmasını sağlayan daha yumuşak bir iyonizasyon sağlamak için amonyum asetat ile değiştirildi.KRAS4b-FMe ve lipozomların etkileşimi yüzey plazmon rezonansı ile ölçüldü ve KRAS4b-FMe'nin membranlara bağlanması için farneslasyon ve karboksimetilasyonu doğrulamak için gereklidir. Beklendiği gibi, KRAS4b-FMe işlenmemiş KRAS4b vermedi ise lipozomlar bağlı. Proteinin düşük tuza maruz kalma süresini en aza indirmek, protokolün verimi etkileyen en kritik tek yönüdür.Protein sadece kısa bir süre tampon E.The protein seyreltme aşağıdaki bu düşük tuz konsantrasyonu olan protein lipozomlar veya nanodiskler gibi membran mimetikler kullanan biyofiziksel deneyler çeşitli için hangi lipidler KRAS ile etkileşime araştırmak için kullanılabilir. Bu verileri kullanarak, KRAS'ın hücrenin plazma zarı yla nasıl etkileştiğini tahmin etmeye başlayabiliriz. Saflaştırılmış KRAS-FMe kullanarak, meslektaşlarımız kras'ın karmaşık x-ışını kristal yapısını bu proteinin farneslü ve metillenmiş formuna özgü bir şaperonla çözmeyi başardılar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Hazırlık ve Seri Femtosecond Kristalografi için lipidik Cubic Faz Protein mikro kristallerinin teslimi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Rekombinant Archaeal proteazomlar ve Nondenaturing PAGE ile Proteozom Meclisi İncelenmesi: Durum bir Kombine Yaklaşım

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Birliğin Rekombinant Protein Ekspresyonu, Kristalleştirilmesi ve Biyofiziksel Araştırmaları<em&gt; Bacillus</em&gt; - Konserve Nükleotid Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Tamamen Özerk karakterizasyonu ve biyolojik oluştururlar kristalleri üzerinden veri toplama

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Protein ayrımı ve karakterizasyonu için birden fazla açıyla ışık saçılma (MALS) birleştiğinde iyon Kromatografi (IEX)

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Bireysel Protein Agregalarının Kızılötesi Nanospektroskopi ve Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Karakterizeleştirilmesi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...