Name: universal and efficient electroporation protocol for genetic engineering of gastrointestinal organoids
Uploaded: 2020-02-18T13:30:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Universal and Efficient Electroporation Protocol for Genetic Engineering of Gastrointestinal Organoids at JoVE.com

Vi takker Juliane Fohgrub, Ann-Christin Meinecke og Max Heiduk for fremragende teknisk bistand. Deutsche Krebshilfe (nr. 111350 og 70112925), Sander Stiftung (nr. 2014.104.1), Hector Stiftung (nr.

Der blev indhentet etisk godkendelse fra det etiske udvalg i TU Dresden (#EK451122014).
1. Organoid Kultur og præparater før elektroporation
<ol><li>Etablere organoider ved vævsfordøjelse som beskrevet tidligere og udvide dem med deres tilsvarende enhedsspecifikke kulturmedium i en kældermatrix (oversigt se tabel 1 og materialetabel)11,12,13,14,15,16,17. BEMÆRK: For humane vævsprøver informeret samtykke og godkendelse af undersøgelsen af et etisk udvalg er nødvendig.</li>
	<li>Prewarm 48-brøndplader ved 37 °C til postelektroporation af såning.</li>
	<li>Forbered basalmedium w/o antibiotika samt enhedsspecifikke organoidkulturmedium w/o antibiotika (se tabel 1),herunder 10 μM Y-27632 og 3 μM CHIR99021. BEMÆRK: Tilbagetrækning af antibiotika er vigtigt at reducere toksiske virkninger. Y-27632 og CHIR99021forbedrecelleopsving10.</li>
	<li>
Fremstilling af organoider (se figur 1)<ol>
<li>Dyrk 5 brønde af organoider i en 48-brønds plade pr elektroporation prøve i kulturmedium. BEMÆRK: Der bør anvendes proliferatoroider (ca. 2-3 dage efter sidste opdeling).</li>
		<li>Der fremstilles 230 μL dissociationreagens (se materialetabellen),herunder 10 μM Y-27632 pr. brønd.</li>
		<li>Fjern dyrkningsmediet fra hver brønd, og dissociaterorierne mekanisk i 230 μL af den forberedte dissociationblanding. Pool 5 brønde pr elektroporation prøve i en 15 ml rør.</li>
		<li>Bland ved vortexing og inkubering i 5-15 min ved 37 °C, indtil der opstår klynger af 10-15 celler. Kontroller derfor dissociationen mikroskopisk. Stop fordøjelsen ved at tilføje basal medium w / o antibiotika op til 10 ml. BEMÆRK: Dette trin er meget kritisk! Elektroporation effektivitet vil blive reduceret, når inkubation er for kort, men lang fordøjelse vil reducere overlevelsesevne.</li>
		<li>Centrifugeres ved 450 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, kassér supernatantet og vaskes to gange med 4 ml elektroporationsbuffer (se Materialetabellen).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Elektroporation
BEMÆRK: Følgende protokol er udviklet til elektroporatorer, der kan finde firkantede bølger og adskilte poring- og overførselspulssekvenser (se figur 2). Eventuelt kan impedansværdier samt de spændinger, strømme og energier, der overføres til prøven, måles som kontrol for reproducerbare eksperimenter.
<ol><li>Kasekoling af organoidpellet i 100 μL elektroporationsbuffer (se Materialetabel),der indeholder 30 μg plasmid-DNA. BEMÆRK: Koncentrationen af det anvendte plasmid DNA skal overstige 5 μg/μL for en optimal saltkoncentration under elektroporeringsprocessen. Derfor anbefales endofree plasmid maxi kits (se Tabel over materialer)til fremstilling af vektorer. Der kan anvendes en samlet mængde på op til 45 μg DNA uden cytotoksiske virkninger.</li>
	<li>Dispenser den komplette DNA-organoid blanding i en elektroporation cuvette med 2 mm mellemrum bredde uden at producere luftbobler.</li>
	<li>Indstil elektroporationsparametrene i henhold til Fujii et al.10 (se tabel 2, figur 2).</li>
	<li>Bland cellerne lidt uden at skumme ved at trykke på cuvetten med en finger. Placer cuvetten i cuvettekammeret.</li>
	<li>Tryk på Ω-knappen på elektroporatoren, og noter impedansværdien. BEMÆRK: En impedans mellem 30-40 Ω viste de bedste resultater. Generelt bør det være i intervallet mellem 30-55 Ω. Hvis dette ikke er tilfældet, skal du styre følgende aspekter: mellemrumsbredden af den anvendte cuvette, elektroporatorens kabelforbindelser, mulige luftbobler, korrekt volumen og saltkoncentration af elektroporationsblandingen.</li>
	<li>Tryk på knappen Start for at udføre elektroporeringsprogrammet, og styr værdierne af strømme, spændinger og energier, der vises. BEMÆRK: Værdierne af målte spændinger, strømme og energier skal svare til de indstillede elektroporationsparametre. Til sammenligning af gentagne eksperimenter kan det være nyttigt at notere disse data.</li>
	<li>Efter elektroporation tilsættes straks 500 μL kulturmedium w/o antibiotika (med CHIR99021 og Y-27632; se trin 1.3). Bland ved pipetting op og ned for at adskille det hvide skum. BEMÆRK: Det hvide skum vises efter elektroporeringsprocessen, og der er knyttet et betydeligt antal celler til den. Så dissociation af det er meget vigtigt for ikke at miste celler.</li>
	<li>Prøven overføres helt fra cuvetten til et nyt 15 ml rør ved hjælp af den pipette, der tilhører elektroporeringscuvetterne (se Materialetabel). Skylning af cuvetten igen med basalmedium anbefales at opnå resterende celler.</li>
	<li>For regenerering af cellerne, inkubere dem i 40 minutter ved stuetemperatur.</li>
</ol>3. Seedning af celler
<ol><li>Centrifugerne centrifugeres ved 450 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, og supernatanten kasseres.</li>
	<li>Opslæm pellet i 100 μL af kælderen matrix og frø 20 μL dråber i en forvarmet 48-brønd plade (se trin 1,2). Inkuberes i 10 min ved 37 °C til polymerisering og tilsættes 250 μL kulturmedium, som suppleres med Y-27632 og CHIR99021 indtil den næste opdeling af de dyrkede organoider (ca. 5-7 dage).</li>
</ol>4. Bestemmelse af transfektionseffektivitet
BEMÆRK: Generelt anbefales det at elektroporate redegøre en vektor med en fluorescensmarkør som yderligere transfektionskontrol. Afhængigt af den valgte markør og dens kromforemodning vil fluorescensen være synlig inden for ca. 24-48 h efter omladning18.
<ol><li>Kontroller fluorescensmikroskopisk efter 24-48 timer i transfektionskontrollen (se figur 4B).</li>
	<li>
Fluorescerende aktiveret cellescanning (FACS)
	<ol>
<li>Høst cellerne tilsvarende til trin 1.4.2-1.4.4 og fordøje omkring 10-20 min, indtil der er enkelte celler. Der tilsættes op til 10 ml fosfatbuffered saltvand (PBS).</li>
		<li>Centrifugeres ved 450 x g i 5 minutter ved stuetemperatur og kassér supernatantet.</li>
		<li>Eventuelt til forskelsbehandling af levende celler: Resuspender pellet i 1 ml fosfat-buffered saltvand (PBS) og tilføje et passende antistof (se Tabel over materialer)eller propidium iodid (PI). Bland kun meget omhyggeligt ved at trykke og inkubere i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke. Vask med 10 ml PBS, centrifugeog kassér supernatantet.</li>
		<li>Opslæm cellepelletiet i 200 μL PBS og filtreres eventuelt suspensionen gennem en 100 μm cellesii i et FACS-rør.</li>
		<li>Analysere cellerne ved hjælp af en FACS-maskine ved hjælp af en passende gatingstrategi (se figur 3; Figur 4A) og bestemme omladningseffektiviteten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Werner, K., Weitz, J., Stange, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+Model+Systems+for+Gastrointestinal+Diseases:+Tissue+Engineering+Meets+Genetic+Engineering.">Organoids as Model Systems for Gastrointestinal Diseases: Tissue Engineering Meets Genetic Engineering.</a> Current Pathobiology Reports. 4 (1), 1-9 (2016).</li><li>Olayanju, A., Jones, L., Greco, K., Goldring, C. E., Ansari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+porcine+gastrointestinal+organoid+units+as+a+potential+in+vitro+tool+for+drug+discovery+and+development.">Application of porcine gastrointestinal organoid units as a potential in vitro tool for drug discovery and development.</a> Journal of applied toxicology. 39 (1), 4-15 (2019).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+cancer+mutations+in+cultured+human+intestinal+stem+cells.">Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells.</a> Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).</li><li>Matano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+colorectal+cancer+using+CRISPR-Cas9-mediated+engineering+of+human+intestinal+organoids.">Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 21 (3), 256-262 (2015).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+CRISPR-modified+human+stem+cell+organoids+to+study+the+origin+of+mutational+signatures+in+cancer.">Use of CRISPR-modified human stem cell organoids to study the origin of mutational signatures in cancer.</a> Science. 358 (6360), 234-238 (2017).</li><li>Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+Effects+in+CRISPR/Cas9-mediated+Genome+Engineering.">Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering.</a> Molecular Therapy Nucleic Acids. 4, e264 (2015).</li><li>Tsong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cell+membranes.">Electroporation of cell membranes.</a> Biophysical journal. 60 (2), 297-306 (1991).</li><li>Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genetic+engineering+of+human+intestinal+organoids+using+electroporation.">Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection.">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Hennig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+Expression+Analysis+for+Subtyping+of+Human+Pancreatic+Cancer+Organoids.">CFTR Expression Analysis for Subtyping of Human Pancreatic Cancer Organoids.</a> Stem Cells Int. 2019, 1024614 (2019).</li><li>Seidlitz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gastric+cancer+modelling+using+organoids.">Human gastric cancer modelling using organoids.</a> Gut. 68 (2), 207-217 (2019).</li><li>Stepanenko, O. V., Verkhusha, V. V., Kuznetsova, I. M., Uversky, V. N., Turoverov, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+as+biomarkers+and+biosensors:+throwing+color+lights+on+molecular+and+cellular+processes.">Fluorescent proteins as biomarkers and biosensors: throwing color lights on molecular and cellular processes.</a> Current protein &amp; peptide science. 9 (4), 338-369 (2008).</li><li>Andersson-Rolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+paralogue+knockout+using+a+CRISPR-concatemer+in+mouse+small+intestinal+organoids.">Simultaneous paralogue knockout using a CRISPR-concatemer in mouse small intestinal organoids.</a> Dev Biol. 420 (2), 271-277 (2016).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8, 2281 (2013).</li><li>Merenda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Protocol+for+Multiple+Gene+Knockout+in+Mouse+Small+Intestinal+Organoids+Using+a+CRISPR-concatemer.">A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Lesueur, L. L., Mir, L. M., Andre, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+Specific+Toxicity+of+Large+Plasmids+Electrotransfer+in+Primary+Cells+In+Vitro.">Overcoming the Specific Toxicity of Large Plasmids Electrotransfer in Primary Cells In Vitro.</a> Molecular Therapy Nucleic Acids. 5, e291 (2016).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Darquet, A. M., Cameron, B., Wils, P., Scherman, D., Crouzet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+DNA+vehicle+for+nonviral+gene+delivery:+supercoiled+minicircle.">A new DNA vehicle for nonviral gene delivery: supercoiled minicircle.</a> Gene Therapy. 4 (12), 1341-1349 (1997).</li><li>Jacobi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+CRISPR+tools+for+efficient+genome+editing+and+streamlined+protocols+for+their+delivery+into+mammalian+cells+and+mouse+zygotes.">Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes.</a> Methods. 121-122, 16-28 (2017).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Denne protokol giver detaljerede instruktioner til en effektiv, hurtig og nem at udføre elektroporation af forskellige organoid enheder. Ud over de præsenterede tumor organoider fra PDAC, CRC, CCC og GC, det virker med succes for organoider stammer fra sundt væv samt. Protokollen kan udføres inden for en dag. I offentliggjorte organoidomladningsprotokoller varede hele proceduren fire dage , herunder to dages præparater med forskellige typer dyrkningsmedier10,21. I vores protokol kræves der ingen særbehandling. Ved at vaske med elektroporation buffer før elektroporation antibiotiske komponenter i medierne blev vasket ud og en justering af saltvand koncentrationer for optimal impedans værdier blev opnået. Ikke desto mindre bør nogle kritiske aspekter overvejes for en vellykket elektroporation:
Celler I fujii et al.10's elektroporationsprotokol anbefales det at adskille organoider til enkelte celler og filtrere dem gennem en cellesier på 20 μm. I vores hænder fordøjelse til enkelte celler kraftigt nedsætter overlevelsesevne af celler. Som foreslået i Merenda et al.21,vi også dissociated organoider til klynger af 10-15 celler og kunne ikke bestemme en nedsat effektivitet i forhold til en enkelt celle dissociation. Efter elektroporation, er det et meget vigtigt skridt at adskille det hvide skum, således at ingen vedhæftede celler er faret vild.
For 2D celle kultur, har det vist sig, at en regenerering tid efter elektroporation på mere end 10 min op til 40 min øger overlevelsesevne og omplantning effektivitet især af store plasmider22. I testforsøg kunne det samme dokumenteres for organoider, hvilket fører til et inkubationstrin på 40 min efter elektroporation i denne protokol. For at øge inddrivelsen fra elektroporationen, vi dyrkede dem med Rho-associerede protein kinase (ROCK) hæmmer Y-27632 i fem til syv dage23. Tilsvarende, den ekstra tilskud af glykogen syntase kinase 3 (GSK3) hæmmer CHIR99021 er beregnet til at hjælpe enkelte celler til at inddrive10.
Indstillinger En af fordelene ved den brugte elektroporator er, at impedansen kan måles før elektroporation for optimale forhold. Ifølge producenten skal impedansværdierne være 30-55 Ω. I vores hænder har impedansværdier på 30-40 Ω vist optimal effektivitet. I et indledende eksperiment blev forskellige spændinger og pulslængdeværdier for poringpulsen varieret for at finde den optimale andel af effektiviteten til overlevelsesevne. Sammenfattende kunne vi bekræfte de beskrevne værdier Fujii et al.10 i de forskellige enheder, der er beskrevet her.
Dna Virkningen af forskellige DNA-mængder blev testet i indledende forsøg på op til 45 μg DNA pr. prøve. Der kunne ikke påvises cytotoksiske virkninger. Transfektionseffektiviteten blev øget på en dosisafhængig måde med mætning > 30 μg. Så vi brugte 30 μg pr. prøve i den endelige protokol, men den kan naturligvis øges (f.eks. til elektroporation af flere plasmider parallelt). Derudover synes dna'ets renhed og koncentration at være meget vigtig. En koncentration på over 5 μg/μL har vist optimal transfektionseffektivitet.
Som forventet kunne plasmiden på 9,3 kB transfected med en lavere effektivitet end de mindre 4,2 kB plasmid (se figur 4). Brugen af endnu større plasmider end 10 kB forventes at yderligere mindske effektiviteten. For fremtidige anvendelser, kan det være interessant at teste minicircle DNA som en vektor, da disse genbærere mangler den bakterielle rygrad en plasmid hvilket gør dem mindre24. Dette bør resultere i en forbedret transfektionseffektivitet. Desuden, for CRISPR-baserede manipulationer af organoider en direkte elektroporation af sgRNAs bundet til Cas9 som en ribonucleoprotein (RNP) kompleks kunne være et alternativ eller tilføjelse25.

I de seneste år, en ny 3D celle kultur system, benævnt organoider, blev udviklet til forskellige normale og kræftvæv. Organoider er funktionelt og morfologisk meget tæt på deres væv af oprindelse. De kan genereres fra forskellige arter, er let kan udvides, genomisk stabil og genetisk modificerbare, hvilket gør dem til et ideelt modelsystem for genetiske undersøgelser1,2,3. Genteknologiske teknikker som CRISPR (Clustered Regelmæssigt Interspaced Short Palindromic Repeats) / Cas9 system giver forskellige manipulationer. Udvælgelsen af kloner kan realiseres ved definerede medieforhold, for eksempel ved WNT ligand tilbagetrækning for APC (Adenomaosis Polyposis Coli) knockout kloner4,5. Alternativt skal markeringsmarkørerne indføres ved homologrettet reparation af en målretningsvektor6,7. På grund af det faktum, at ofte mere end én plasmid skal indføres, en effektiv omladning bliver et afgørende parameter. For at reducere uspecifikke virkninger uden for målet er det desuden ønskeligt, at Cas9-endonuclease er forbigående8.
Elektroporation er en forholdsvis enkel metode til at transfect celler med DNA, RNA, proteiner eller andre makromolekyler. Ved hjælp af elektriske impulser bliver cellemembranen mere gennemtrængelig og forårsager en øget optagelse9. I en tidligere offentliggjort elektroporation protokol af kolon organoider en 30 % effektivitet med en piggy-bac GFP (grøn fluorescerende protein) udtrykke vektor (7,4 kB) blev nået i en fire dages procedure10. Følgende protokol blev udviklet for at lette en effektiv transfection af kræft eller sunde organoider med store plasmider kodning for enkelt guide RNA (sgRNA) og Cas9 endonuclease sekvens (f.eks px458 som vektor med 9,3 kb). Hele elektroporationsprocessen kan udføres inden for en dag, uden særlige elektroporation buffere, og med mindst sammenlignelige effektivitetsgevinster mellem forskellige gastrointestinale organoider, nemlig pancreas ductal adenocarcinom (PDAC), kolorektal cancer (CRC), cholangiocarcinoma (CCC) og mavekræft (GC) organoids.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>For establishment and culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15] Gastrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9407-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6213.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1859330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hFGF-10</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>basement matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K300.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-Cystein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Conditioned medium produced from HEK293 cells (Hek293-mNoggin-Fc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human HGF</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>100-39H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Conditioned medium produced from HEK293 cells (HA-Rspo1-Fc-293T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27,480,294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604021</td>
			<td>Dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3A</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Conditioned medium produced from L-Wnt3a cells (from Sylvia Boj)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nepa Electroporation Cuvettes 2mm gap w/pipettes</td>
			<td>Nepa Gene Co., Ltd.</td>
			<td>EC-002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 15 ml</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 15 ml low binding</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30122208</td>
			<td>Tubes for FACS preparing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator Nepa21</td>
			<td>Nepa Gene Co., Ltd.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMAFD1000</td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>647800E6</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents and plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead fixable blue dead cell stain kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34962</td>
			<td>Includes antibody for live/dead staining for FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutlin-3</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1061/07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985047</td>
			<td>Electroporation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 gRNA concatemer vector</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>84879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-EGFP</td>
			<td>Nepa Gene Co., Ltd.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>px458 plasmid</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>48138</td>
			<td>coding for sgRNA and Cas9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>px458_Conc2 plasmid</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>134449</td>
			<td>px458 plasmid containing 2x U6 promotors for two different sgRNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA_hTP53_1a</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td><img src="/files/ftp_upload/60704/60704tomeq1.jpg" /></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA_hTP53_1b</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td><img src="/files/ftp_upload/60704/60704tomeq2.jpg" /></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA_hTP53_2a</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td><img src="/files/ftp_upload/60704/60704tomeq3.jpg" /></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA_hTP53_2b</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td><img src="/files/ftp_upload/60704/60704tomeq4.jpg" /></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

universal and efficient electroporation protocol for genetic engineering of gastrointestinal organoids

Elektroporation er en almindelig metode til omladning med forskellige typer af molekyler ved elektrisk permeabilisering af plasmamembranen. Med den stigende brug af organoider som en dyrkningsmetode for primærpatientmateriale i de seneste år er der behov for effektive overførselsmetoder for komponenter til genteknologi i dette 3D-kultursystem. Især for organoider, effektiviteten af genetiske manipulationer afhænger af en vellykket transfection. Denne protokol blev således udviklet for at lette elektroporationen af organoider og for at bevise dens universelle funktionalitet i forskellige enheder. Human kolorektal, pancreas, hepatisk og gastrisk kræft organoids blev med succes elektroporated med små og store plasmider i sammenligning. Baseret på GFP-kodningsvektorer blev transfektionseffektiviteten bestemt af FACS. Ingen omfattende forberedelse af cellerne eller særlige, omkostningskrævende elektroporation buffere er nødvendige, og protokollen kan udføres inden for en dag.

Organoider af fire forskellige kræftenheder (CRC, CCC, PDAC, GC) blev elektroporated mindst 3 gange ved hjælp af 30 μg af en lille plasmid (pCMV-EGFP, 4,2 kb) eller en stor plasmid (px458, 9,3 kb). Begge vektorer bærer en GFP kassette, der gør det muligt at bestemme transfektionseffektivitet 48 timer efter elektroporation ved flow cytometri. At analysere kun levende celler, farvning med et liv-død antistof før scanning blev udført. Gating-strategien er vist i figur 3.
I alle fire organoidenheder blev plasmid på 4,2 kB mellemstore plasmid transfected med højere effektivitet sammenlignet med den større (se figur 4). Den mest effektive transfection af den lille plasmid blev nået i PDAC-organoider med 92,1 ± 5,2 % GFP-positive celler, mens den store plasmid blev transfunderet med en effektivitet på 46,7 ± 3,7 % (gennemsnitlig ± standardafvigelse, n = 3). Sammenlignet med organoider i bugspytkirtlen blev den større plasmid mere effektivt transfunderet i CRC-organoider med en gennemsnitlig effektivitet på 53,4 ± 11,7 %, mens den lille plasmid blev transfunderet med en gennemsnitlig effektivitet på 84,3 ± 5,8 %. Den vanskeligste enhed at ombære var fogtkræftorganoider: For både de store og de små plasmid blev den laveste transfektionseffektivitet nået i denne enhed (henholdsvis 32,3 ± 12,7 % og 74,1 ± 5,5 %). CCC-organoider udviste en gennemsnitlig transfektionseffektivitet på 83,0 ± 13,1 % for den lille plasmid og for de store plasmider 39,5 ± 10,4 % blev opnået.
Som proof of concept, menneskelige normale mave organoids blev elektroporated med en px458_Conc2 plasmid kodning for Cas9, GFP og to sgRNAs rettet mod TP53. Cas9-inducerede dobbeltstrengbrud på exon 8 blev repareret ved ikke-homolog e-end-sammenføjning (NHEJ), hvilket resulterede i rammeskift og dermed en udskæring af genet (se supplerende figur 1).
Tabel 1: Sammensætning af basale medier, fordøjelsesblandinger og dyrkningsmedier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704_table1.xlsx" target="_blank">Klik her for at se denne fil (højreklik for at downloade).</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/60704/60704table2.jpg"> Tabel 2: Elektroporation indstillinger i henhold til Fujii et al.10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60704/60704fig1.jpg"> Figur 1: Arbejdsgang for forberedelse af elektroporering. For det første bør organoider adskilles til klynger af 10-15 celler og antibiotika bør blive vasket ud. Efter elektroporation skal det hvide skum adskilles. Celler kan ses efter regenerering i 40 min ved stuetemperatur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60704/60704fig2b.jpg"> Figur 2: To-trins elektroporation. To poring impulser med højere spænding og kort varighed (175 V og 157,5 V, hver for 5 ms, pause i 50 ms, spænding henfald 10%) føre til dannelse af porer i cellemembraner. Følgende overførselsimpulser leverer DNA'et ind i cellerne: fem positive overførselsimpulser (med 20 V, 12 V, 7,2 V, 4,32 V og 2.592 V, hver for 50 ms, pause i 50 ms, spænding henfald 40%), efterfulgt af fem polaritet udvekslet overførsel impulser (med 20 V, 12 V, 7,2 V, 4,32 V og 2.592 V, hver for 50 ms, pause for 50 ms, spænding henfald 40%). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704fig2blarge.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60704/60704fig3b.jpg"> Figur 3: Repræsentativ gatingstrategi vist ved CCC organoids. Alle elektroporated organoider blev analyseret ved flow cytometri 48 h efter elektroporation. Celler, der blev elektrodeklassificeret uden plasmid-DNA, blev brugt som negative kontroller. Portene blev sat som følger: (A) gating for celleform (B,C) gating for enkelte celler (dobbelt forskelsbehandling),(D)gating for levende celler (farves med et antistof til apoptotiske celler) og (E,F) endelig gating for eGFP udtrykke celler (FITC kanal). FSC = fremad scatter; SSC = sidescatter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704fig3blarge.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60704/60704fig4.jpg"> Figur 4: Elektroporation effektivitet af fire organoid enheder. A) FACS-analyse (n = 34, gennemsnitlig standardafvigelse og hver enkelt værdi er vist) ogb) visuel sammenligning med fluorescensmikroskop. Skalabjælke = 1.000 μm. BF = lyst felt; CCC = cholangiocarcinoma; CRC = kolorektal cancer; GC = mavekræft; PDAC = pancreas ductal adenocarcinoma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/60704/60704suppfig1a.jpg"> Supplerende figur 1: Eksemplarisk CRISPR/Cas9-baseret knockout af TP53 i normale menneskelige mave organoider. Den px458_Conc2 vektor (se Tabel over materialer)blev klonet ved at kombinere 2 gRNA concatemer vektor, en generøs gave fra Bon-Kyoung Koo19, med px45820, hvilket resulterer i en plasmid kodning for 2 sgRNAs, Cas9 og GFP. To sgRNAs rettet mod TP53 blev indført i px458_Conc2 vektor ved golden gate kloning (svarende til Andersson-Rolf et al.19). 10 μg plasmid DNA blev elektrodeklassificeret i humannormal gastrisk etonosider (A). Kloner blev udvalgt af Nutlin3 administration(B) og TP53 knockout blev bekræftet af TOPO TA kloning og sekventering af alleler, her eksemplarisk vist for en klon (C). SGRNA'erne understreges i referencen. Skalabjælke = 200 μm. BF = lyst felt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704suppfig1alarge.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Universal and Efficient Electroporation Protocol for Genetic Engineering of Gastrointestinal Organoids at JoVE.com

Universal and Efficient Electroporation Protocol for Genetic Engineering of Gastrointestinal Organoids

Denne protokol beskriver en effektiv elektroporationsmetode til omladning af fire forskellige gastrointestinale organoidenheder med større plasmider (i det omfang 10 kB). Det kan udføres inden for en dag og behøver ikke omfattende forberedelse eller særlige, omkostningskrævende elektroporation buffere.

Universal og effektiv elektroporation protokol for genteknologi af gastrointestinale organoider

Electroporation is a common method for transfection with different kinds of molecules by electrical permeabilization of the plasma membrane. With the ...

Denne metode muliggør effektiv transinfektion af 3D-cellekulturer såsom organoider. Forskellige anvendelser af genteknologi kan lettes. Protokollen er universel og kan udføres inden for en dag.Det behøver ikke omfattende forberedelse eller særlige, omkostningstunge elektroporation buffere. Denne transfektionsmetode blev demonstreret i tumor og sunde organoider, men det kan justeres til sfæroider og 2D cellekultur, også. Hvis du udfører denne protokol for første gang, er det vigtigt at håndtere organoider med omhu på grund af deres individuelle spredning og reaktion på dissociation.Overvåg dem mikroskopisk under hele proceduren. Start med at prævarme 48-brønd plader ved 37 grader Celsius for post elektroporation såning, derefter forberede basal og organoid kultur-specifikke medier i henhold til manuskript retninger. Dyrk fem brønde af organoider pr elektroporationsprøve i en 48-brøndplade, forberede 230 mikroliter af dissociation reagens med 10-mikromolar Y-27632 per brønd.Monitorer organoiderne under et mikroskop. Fjern kulturmediet fra brøndene og dissocier organoiderne mekanisk i den forberedte dissociationsblanding. Pool fem brønde pr elektroporationsprøve i et 15-milliliterrør.Bland indholdet af røret ved vortexing og inkubere det i fem til 15 minutter ved 37 grader Celsius, indtil klynger af 10 til 15 celler opstår, kontrol af dissociation med et mikroskop. Stop fordøjelsen ved at tilføje op til 10 milliliter basalt medium uden antibiotika. Centrifuge røret ved 450 gange g i fem minutter, kassér supernatanten og vask cellerne to gange med fire milliliter elektroporationsbuffer.Centrifuge og kassér supernatanten efter hver vask. Efter vaskene opsuspenrede organoidpellet i 100 mikroliter af elektroporationsbuffer med 30 mikrogram plasmid DNA. Dispensere den komplette DNA-organoid blanding i en elektroporation cuvette.Sørg for at undgå luftbobler. Indstil elektroporationsparametrene som beskrevet i tekstmanuskriptet, og tryk på kuvette med en finger for forsigtigt at blande cellerne. Anbring kuvette i cuvettekammeret, og tryk på impedansknappen på elektroporatoren for at notere impedansværdien.Tryk på knappen Start for at starte elektroporationsprogrammet og styre værdierne for de strømme, spændinger og energier, der vises. Efter elektroporation, straks tilføje 500 mikroliter af kultur medium uden antibiotika til cellerne og blandes ved pipettering op og ned. Prøven overføres til et nyt 15-milliliterrør, og cuvette med basalt medium skylles for at opsamle de resterende celler, hvortilinkuberes cellerne ved stuetemperatur i 40 minutter.Centrifuge cellerne ved 450 gange g i fem minutter og kassér supernatanten. Resuspend pellet i 100 mikroliter af kælderen matrix og frø 20-mikroliter dråber i en advaret 48-brønd plade. Inkuber pladen i 10 minutter ved 37 grader Celsius for polymerisering og tilsæt 250 mikroliter af kultur medium suppleret med Y-27632 og CHIR99021 per brønd.For at bestemme transfektionseffektiviteten skal fluorescensen i transfektionskontrollen under mikroskopet kontrolleres efter 24 til 48 timer. Til FACS-analyse høstes cellerne som tidligere beskrevet og fordøjes i 10 til 20 minutter, indtil enkelte celler er til stede. Der tilsættes op til 10 milliliter PBS, og cellerne centrifugeres ved 450 gange g i fem minutter, hvortil der aspireres og kasseres supernatanten.For at diskriminere for levende celler, resuspend pellet i en milliliter PBS og tilsæt et egnet antistof eller propidium iodid. Bland cellerne forsigtigt ved at banke på og inkubere dem ved stuetemperatur i 30 minutter i mørke. Efter inkubationen vaskes cellerne med 10 milliliter PBS, hvord.Opslæmmet cellepilpellen i 200 mikroliter PBS og filtrere suspensionen gennem en 100-mikrometers si i et FACS-rør. Analysér cellerne med en FACS-maskine ved hjælp af den relevante gatingstrategi, og bestem transfektionseffektiviteten. Organoider af fire forskellige kræftenheder blev elektroporeret mindst tre gange ved hjælp af 30 mikrogram af en lille plasmid eller stor plasmid.De blev analyseret med flow cytometri 48 timer efter elektroporation og gated for celleform, enkelte celler, levende celler, og eGFP udtryk. I alle fire organoid enheder, den lille plasmid blev transficeret med højere effektivitet end den større. Den mest effektive transinfektion af den lille plasmid blev nået i PDAC organoider med 92,1% GFP-positive celler, der henviser til, at den store plasmid blev transficeret med en effektivitet på 46,7%Den større plasmid blev mere effektivt transficeret i CRC organoider med en gennemsnitlig effektivitet på 53,4%, mens den lille plasmid blev transfet med en gennemsnitlig effektivitet på 84,3%Den vanskeligste enhed til transfect var gastrisk kræft organoids , som viste den laveste transfektionseffektivitet for begge plasmider.Som proof of concept, menneskelige normale mave organoider blev elektroporated med en plasmid kodning for Cas9, GFP, og 2sgRNAs rettet mod TP53. Kloner blev udvalgt af Nutlin3 administration og TP53 knockout blev bekræftet ved sekvensering af allelerne. Som vi demonstrerede med de menneskelige maveorganoider, muliggør effektiv elektroporation forskellige CRISPR Cas9-basemanipulationer af organoidkulturer, såsom knockout eller knockins, så forskellige sygdomme kan modelleres.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Genetic Engineering af en utraditionel Gær for Vedvarende Biobrændsel og biokemisk Produktion

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Tekniske kunstige faktorer til specifikt manipulation af alternativ splejsning i humane celler

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

En universel protokol for storstilet gRNA bibliotek produktion fra enhver kilde, DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

Et hurtigt sølv farvning protokollen muliggør enkel og effektiv påvisning af SSR markører ved hjælp af en ikke-denatureringen polyacrylamid Gel

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Målrettet næste generation Sequencing og bioinformatik rørledningen for at evaluere genetiske determinanter for forfatningsmæssige sygdom

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolation, karakterisering og mikroRNA-baseret genetisk modificering af menneskelige Dental follikel stamceller

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Gensplejsning af Dictyostelium discoideum celler baseret på udvælgelse og vækst på bakterier

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Halvleder sekvensering for præimplantations genetisk testning for Aneuploidy

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Evaluering af en universel indlejret reverse transkription polymerase kædereaktion til påvisning af Lyssavira

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-medieret præcis Genredigering ved Rørelektroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...