Name: universal and efficient electroporation protocol for genetic engineering of gastrointestinal organoids
Uploaded: 2020-02-18T13:30:00
Duration: 7 min 19 s
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Wir danken Juliane Fohgrub, Ann-Christin Meinecke und Max Heiduk für die hervorragende technische Unterstützung. Gefördert wurden die Deutsche Krebshilfe (Nr. 111350 und 70112925), die Sander Stiftung (Nr. 2014.104.1), die Hector Stiftung (Nr. M65.2) und die Europäische Union (ERC-Nr. 639050).

Die Ethik-Zulassung wurde von der Ethikkommission der TU Dresden (#EK451122014 eingeholt.
1. Organoidkultur und Zubereitungen vor der Elektroporation
<ol><li>Organoide nach Gewebeverdauung wie zuvor beschrieben festlegen und mit ihrem entsprechenden entitätsspezifischen Kulturmedium in einer Kellermatrix erweitern (Übersicht siehe Tabelle 1 und Tabelle der Materialien)11,12,13,14,15,16,17. HINWEIS: Für menschliche Gewebeproben ist die zustimmung s in Kenntnis der Einwilligung und Genehmigung der Studie durch eine Ethikkommission erforderlich.</li>
	<li>48-Well-Platten bei 37 °C für die Nachelektroporation vorwärmen.</li>
	<li>Bereiten Sie basales Medium mit Antibiotika sowie ein unternehmensspezifisches organoides Kulturmedium mit Antibiotika vor (siehe Tabelle 1), einschließlich 10 M Y-27632 und 3 M CHIR99021. HINWEIS: Der Entzug von Antibiotika ist wichtig, um toxische Wirkungen zu reduzieren. Y-27632 und CHIR99021 zur Zellrückgewinnung10.</li>
	<li>
Vorbereitung der Organoide (siehe Abbildung 1)<ol>
<li>Kultivieren Sie 5 Brunnen von Organoiden in einer 48-Well-Platte pro Elektroporationsprobe in Kulturmedium. HINWEIS: Proliferative Organoide sollten verwendet werden (ca. 2-3 Tage nach der letzten Spaltung).</li>
		<li>Bereiten Sie 230 L Dissoziationsreagenz (siehe Materialtabelle) vor, einschließlich 10 M Y-27632 pro Bohrplatz.</li>
		<li>Entfernen Sie das Kulturmedium aus jedem Brunnen und dissoziieren Sie die Organoide mechanisch in 230 l des vorbereiteten Dissoziationsgemisches. 5 Brunnen pro Elektroporationsprobe in ein 15 ml-Rohr geben.</li>
		<li>Mischen Sie durch Wirbel und inkubieren Sie für 5-15 min bei 37 °C, bis Cluster von 10-15 Zellen auftreten. Überprüfen Sie daher die Dissoziation mikroskopisch. Stoppen Sie die Verdauung durch Zugabe von Basalmedium mit Antibiotika bis zu 10 ml. HINWEIS: Dieser Schritt ist sehr kritisch! Die Elektroporationseffizienz wird reduziert, wenn die Inkubation zu kurz ist, aber eine lange Verdauung die Überlebensfähigkeit verringert.</li>
		<li>Zentrifuge bei 450 x g für 5 min bei Raumtemperatur, den Überstand entsorgen und zweimal mit 4 ml Elektroporationspuffer waschen (siehe Materialtabelle).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Elektroporation
HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde für Elektroporatoren entwickelt, die in der Lage sind, quadratische Wellen und getrennte Poring- und Übertragungspulssequenzen zu verwenden (siehe Abbildung 2). Optional können Impedanzwerte sowie die in die Probe übertragenen Spannungen, Ströme und Energien als Steuerung für reproduzierbare Experimente gemessen werden.
<ol><li>Setzen Sie das Organoidpellet in 100 l Elektroporationspuffer (siehe Materialtabelle) mit 30 g Plasmid-DNA aus. HINWEIS: Die Konzentration der verwendeten Plasmid-DNA sollte 5 g/l überschreiten, um eine optimale Salzkonzentration während des Elektroporationsprozesses zu erhalten. Daher werden endofreie Plasmid-Maxi-Kits (siehe Materialtabelle) zur Herstellung von Vektoren empfohlen. Eine Gesamtmenge von bis zu 45 g DNA kann ohne zytotoxische Wirkungen verwendet werden.</li>
	<li>Geben Sie die komplette DNA-Organoid-Mischung in eine Elektroporationsküvette mit 2 mm Spaltbreite, ohne Luftblasen zu erzeugen.</li>
	<li>Stellen Sie die Elektroporationsparameter nach Fujii et al.10 ein (siehe Tabelle 2, Abbildung 2).</li>
	<li>Mischen Sie die Zellen leicht, ohne zu schäumen, indem Sie mit einem Finger auf die Küvette tippen. Legen Sie die Küvette in die Küvettenkammer.</li>
	<li>Drücken Sie die Taste des Elektroporators, und notieren Sie sich den Impedanzwert. HINWEIS: Eine Impedanz zwischen 30-40 x zeigte die besten Ergebnisse. Im Allgemeinen sollte es im Bereich zwischen 30-55 ° liegen. Wenn dies nicht der Fall ist, steuern Sie bitte die folgenden Aspekte: Spaltbreite der verwendeten Küvette, Kabelanschlüsse des Elektroporators, mögliche Luftblasen, korrektes Volumen und Salzkonzentration des Elektroporationsgemisches.</li>
	<li>Drücken Sie die Starttaste, um das Elektroporationsprogramm auszuführen und die Werte der angezeigten Ströme, Spannungen und Energien zu steuern. HINWEIS: Die Werte der gemessenen Spannungen, Ströme und Energien sollten den eingestellten Elektroporationsparametern entsprechen. Für den Vergleich wiederholter Experimente kann es hilfreich sein, diese Daten zu notieren.</li>
	<li>Nach der Elektroporation sofort 500 l Kulturmedium mit Antibiotika hinzufügen (mit CHIR99021 und Y-27632; siehe Schritt 1.3). Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten, um den weißen Schaum zu dissoziieren. HINWEIS: Der weiße Schaum erscheint nach dem Elektroporationsprozess und eine erhebliche Anzahl von Zellen ist daran befestigt. Also, Dissoziation davon ist sehr wichtig, um zellenlos nicht zu verlieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Probe vollständig von der Küvette in ein neues 15 ml Rohr mit der Pipette, die zu den Elektroporationsküvetten gehört (siehe Tabelle der Materialien). Es wird empfohlen, die Küvette wieder mit Basalmedium zu spülen, um verbleibende Zellen zu erhalten.</li>
	<li>Zur Regeneration der Zellen 40 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
</ol>3. Aussaat von Zellen
<ol><li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 450 x g für 5 min bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Setzen Sie das Pellet in 100 l Kellermatrix und Samen 20 l Tropfen in einer vorgewärmten 48-Well-Platte (siehe Schritt 1.2). 10 min bei 37 °C zur Polymerisation inkubieren und 250 L Kulturmedium hinzufügen, das mit Y-27632 und CHIR99021 bis zur nächsten Spaltung der angebauten Organoide (ca. 5-7 Tage) ergänzt wird.</li>
</ol>4. Bestimmung der Transfektionseffizienz
HINWEIS: Im Allgemeinen wird empfohlen, einen Vektor, der einen Fluoreszenzmarker trägt, als zusätzliche Transfektionskontrolle zu elektroporatisieren. Abhängig vom gewählten Marker und seiner Chromophorreifung wird die Fluoreszenz innerhalb von etwa 24-48 h nach der Transfektion18sichtbar sein.
<ol><li>Überprüfen Sie die Fluoreszenz mikroskopisch nach 24-48 h in der Transfektionskontrolle (siehe Abbildung 4B).</li>
	<li>
Fluoreszierendes aktiviertes Zellscannen (FACS)
	<ol>
<li>Ernten Sie die Zellen analog zu Schritt 1.4.2-1.4.4 und verdauen Sie etwa 10-20 min, bis es einzelne Zellen gibt. Addieren Sie bis zu 10 ml Phosphat-gepufferte Saline (PBS).</li>
		<li>Zentrifuge bei 450 x g für 5 min bei Raumtemperatur und den Überstand entsorgen.</li>
		<li>Optional zur Diskriminierung lebender Zellen: Das Pellet in 1 ml phosphatgepufferter Saline (PBS) aussetzen und einen geeigneten Antikörper (siehe Materialtabelle)oder Propidiumjodid (PI) hinzufügen. Mischen Sie sehr sorgfältig nur durch Tippen und inkubieren für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. Mit 10 ml PBS, Zentrifuge waschen und den Überstand entsorgen.</li>
		<li>Setzen Sie das Zellpellet in 200 l PBS wieder auf und filtern Sie die Suspension optional durch ein 100-m-Zellsieb in ein FACS-Rohr.</li>
		<li>Analysieren Der Zellen anhand einer FACS-Maschine mithilfe einer geeigneten Gating-Strategie (siehe Abbildung 3; Abbildung 4A) und bestimmen die Transfektionseffizienz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Werner, K., Weitz, J., Stange, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+Model+Systems+for+Gastrointestinal+Diseases:+Tissue+Engineering+Meets+Genetic+Engineering.">Organoids as Model Systems for Gastrointestinal Diseases: Tissue Engineering Meets Genetic Engineering.</a> Current Pathobiology Reports. 4 (1), 1-9 (2016).</li><li>Olayanju, A., Jones, L., Greco, K., Goldring, C. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+Specific+Toxicity+of+Large+Plasmids+Electrotransfer+in+Primary+Cells+In+Vitro.">Overcoming the Specific Toxicity of Large Plasmids Electrotransfer in Primary Cells In Vitro.</a> Molecular Therapy Nucleic Acids. 5, e291 (2016).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Darquet, A. M., Cameron, B., Wils, P., Scherman, D., Crouzet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+DNA+vehicle+for+nonviral+gene+delivery:+supercoiled+minicircle.">A new DNA vehicle for nonviral gene delivery: supercoiled minicircle.</a> Gene Therapy. 4 (12), 1341-1349 (1997).</li><li>Jacobi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+CRISPR+tools+for+efficient+genome+editing+and+streamlined+protocols+for+their+delivery+into+mammalian+cells+and+mouse+zygotes.">Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes.</a> Methods. 121-122, 16-28 (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen für eine effiziente, schnelle und einfach durchzuführende Elektroporation verschiedener organoider Einheiten. Zusätzlich zu den vorgestellten Tumororganoiden von PDAC, CRC, CCC und GC, funktioniert es erfolgreich für Organoide aus gesundem Gewebe sowie. Das Protokoll kann innerhalb eines Tages ausgeführt werden. In veröffentlichten Organoid-Transfektionsprotokollen dauerte das gesamte Verfahren vier Tage, einschließlich zwei Tage Vorbereitungen mit verschiedenen Arten von Anbaumedien10,21. In unserem Protokoll ist keine spezielle Vorbehandlung erforderlich. Durch Waschen mit Elektroporationspuffer vor der Elektroporation wurden die antibiotischen Komponenten der Medien ausgewaschen und eine Einstellung der Saline-Konzentrationen für optimale Impedanzwerte erreicht. Dennoch sollten einige kritische Aspekte für eine erfolgreiche Elektroporation in Betracht gezogen werden:
Zellen Im Elektroporationsprotokoll von Fujii et al.10 wird empfohlen, Organoide mit Einzelzellen zu dissoziieren und durch ein 20-m-Zell-Sieb zu filtern. In unseren Händen verringert die Verdauung einzelner Zellen die Überlebensfähigkeit der Zellen stark. Wie in Merenda et al.21vorgeschlagen, dissoziierten wir auch Organoide zu Clustern von 10-15 Zellen und konnten keine verminderte Effizienz im Vergleich zur Einzelzelldissoziation bestimmen. Nach der Elektroporation ist es ein sehr wichtiger Schritt, den weißen Schaum zu dissoziieren, so dass keine angeschlossenen Zellen verloren gehen.
Für die 2D-Zellkultur hat sich gezeigt, dass eine Regenerationszeit nach Elektroporation von mehr als 10 min bis zu 40 min die Überlebensfähigkeit und Transfektionseffizienz insbesondere bei großen Plasmiden erhöht22. In Testexperimenten konnte dasselbe für Organoide dokumentiert werden, was zu einem Inkubationsschritt von 40 min nach Elektroporation in diesem Protokoll führte. Um die Erholung von der Elektroporation zu erhöhen, kultivierten wir sie mit Rho-assoziiertem Proteinkinase (ROCK) Inhibitor Y-27632 für fünf bis sieben Tage23. In ähnlicher Weise soll die zusätzliche Supplementierung von Glykogen-Synthase-Kinase-3-Hemmer CHIR99021 einzelnen Zellen helfen,10zurückzugewinnen.
Einstellungen Einer der Vorteile des verwendeten Elektroporators ist, dass die Impedanz vor der Elektroporation für optimale Bedingungen gemessen werden kann. Nach Angaben des Herstellers sollten die Impedanzwerte 30-55 ° betragen. In unseren Händen haben Impedanzwerte von 30-40 ° eine optimale Effizienz gezeigt. In einem vorderen Experiment wurden unterschiedliche Spannungen und Pulslängenwerte des Porenimpulses variiert, um den optimalen Anteil der Effizienz an der Überlebensfähigkeit zu finden. Zusammenfassend konnten wir die beschriebenen Werte von Fujii et al.10 in den verschiedenen hier beschriebenen Entitäten bestätigen.
Dna Die Wirkung unterschiedlicher DNA-Mengen wurde in Vorversuchen bis zu 45 g DNA pro Probe getestet. Es konnten keine zytotoxischen Wirkungen festgestellt werden. Die Transfektionseffizienz wurde in einer dosisabhängigen Weise mit Sättigung > 30 g erhöht. Wir haben also im Endprotokoll 30 g pro Probe verwendet, aber natürlich kann sie erhöht werden (z.B. für die Parallelelektroporation von mehr Plasmiden). Darüber hinaus scheint die Reinheit und Konzentration der DNA sehr wichtig zu sein. Eine Konzentration von mehr als 5 g/l hat eine optimale Transfektionseffizienz gezeigt.
Wie erwartet konnte das 9,3 kB-Plasmid mit einem geringeren Wirkungsgrad transfiziert werden als das kleinere 4,2 kB-Plasmid (siehe Abbildung 4). Die Verwendung von noch größeren Plasmiden als 10 kB wird die Effizienz weiter verringern. Für zukünftige Anwendungen könnte es interessant sein, Minikreis-DNA als Vektor zu testen, da diesen Genträgern das bakterielle Rückgrat eines Plasmids fehlt, was sie kleiner macht24. Dies sollte zu einer verbesserten Transfektionseffizienz führen. Darüber hinaus könnte für CRISPR-basierte Manipulationen von Organoiden eine direkte Elektroporation von sgRNAs, die an Cas9 als Ribonukleoprotein (RNP) Komplex gebunden sind, eine Alternative oder Ergänzung sein25.

In den letzten Jahren wurde ein neuartiges 3D-Zellkultursystem, die so genannten Organoide, für verschiedene normale und krebserende Gewebe entwickelt. Organoide sind funktionell und morphologisch sehr nah an ihrem Ursprungsgewebe. Sie können aus verschiedenen Arten erzeugt werden, sind leicht erweiterbar, genomstabil und genetisch veränderbar, was sie zu einem idealen Modellsystem für genetische Untersuchungen1,2,3macht. Gentechnik-Techniken wie das CRISPR -System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9-System ermöglichen vielfältige Manipulationen. Die Auswahl der Klone kann durch definierte Medienbedingungen realisiert werden, z.B. durch WNT-Ligandentzug für APC (Adenomatosis Polyposis Coli) Knockout-Klone4,5. Alternativ müssen Selektionsmarker durch homologe gezielte Reparatur eines Targeting-Vektors6,7eingeführt werden. Aufgrund der Tatsache, dass oft mehr als ein Plasmid eingeführt werden muss, wird eine effiziente Transfektion zu einem entscheidenden Parameter. Um unspezifische Off-Target-Effekte zu reduzieren, ist eine vorübergehende Expression der Cas9-Endonuklease wünschenswert8.
Elektroporation ist eine vergleichsweise einfache Methode, um Zellen mit DNA, RNA, Proteinen oder anderen Makromolekülen zu transfekieren. Durch elektrische Impulse wird die Zellmembran durchlässiger und verursacht eine erhöhte Aufnahme9. In einem zuvor veröffentlichten Elektroporationsprotokoll von Kolonorganoiden wurde in einem viertägigen Verfahren10ein 30 %iger Wirkungsgrad mit einem Piggy-Bac GFP (grünes fluoreszierendes Protein) Exzessvektor (7,4 kB) erreicht. Das folgende Protokoll wurde entwickelt, um eine effiziente Transfektion von Krebs oder gesunden Organoiden mit großen Plasmiden zu ermöglichen, die für Single Guide RNA (sgRNA) und die Cas9 Endonuklease-Sequenz (z.B. px458 als Vektor mit 9,3 kb) kodieren. Der gesamte Elektroporationsprozess kann innerhalb eines Tages ohne spezielle Elektroporationspuffer und mit mindestens vergleichbaren Wirkungsgraden zwischen verschiedenen gastrointestinalen Organoiden, nämlich pankreastischem duktogalem Adenokarzinom (PDAC), Dickdarmkrebs (CRC), Cholangiokarzinom (CCC) und Magenkrebs (GC) Organoiden durchgeführt werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>For establishment and culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15] Gastrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9407-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6213.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1859330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hFGF-10</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>basement matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K300.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-Cystein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Conditioned medium produced from HEK293 cells (Hek293-mNoggin-Fc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human HGF</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>100-39H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Conditioned medium produced from HEK293 cells (HA-Rspo1-Fc-293T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27,480,294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604021</td>
			<td>Dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3A</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Conditioned medium produced from L-Wnt3a cells (from Sylvia Boj)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nepa Electroporation Cuvettes 2mm gap w/pipettes</td>
			<td>Nepa Gene Co., Ltd.</td>
			<td>EC-002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 15 ml</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 15 ml low binding</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30122208</td>
			<td>Tubes for FACS preparing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator Nepa21</td>
			<td>Nepa Gene Co., Ltd.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMAFD1000</td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>647800E6</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents and plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead fixable blue dead cell stain kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34962</td>
			<td>Includes antibody for live/dead staining for FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutlin-3</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1061/07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985047</td>
			<td>Electroporation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 gRNA concatemer vector</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>84879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-EGFP</td>
			<td>Nepa Gene Co., Ltd.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>px458 plasmid</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>48138</td>
			<td>coding for sgRNA and Cas9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>px458_Conc2 plasmid</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>134449</td>
			<td>px458 plasmid containing 2x U6 promotors for two different sgRNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA_hTP53_1a</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td><img src="/files/ftp_upload/60704/60704tomeq1.jpg" /></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA_hTP53_1b</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td><img src="/files/ftp_upload/60704/60704tomeq2.jpg" /></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA_hTP53_2a</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td><img src="/files/ftp_upload/60704/60704tomeq3.jpg" /></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA_hTP53_2b</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td><img src="/files/ftp_upload/60704/60704tomeq4.jpg" /></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

universal and efficient electroporation protocol for genetic engineering of gastrointestinal organoids

Elektroporation ist eine gängige Methode zur Transfektion mit verschiedenen Arten von Molekülen durch elektrische Permeabilisierung der Plasmamembran. Mit dem zunehmenden Einsatz von Organoiden als Kultivierungsmethode für Primärpatientenmaterial in den letzten Jahren sind effiziente Übertragungsmethoden von Komponenten für die Gentechnik in diesem 3D-Kultursystem notwendig. Besonders bei Organoiden hängt die Effizienz genetischer Manipulationen von einer erfolgreichen Transfektion ab. So wurde dieses Protokoll entwickelt, um die Elektroporation von Organoiden zu erleichtern und seine universelle Funktionalität in verschiedenen Einheiten zu beweisen. Humane Dickdarm-, Bauchspeicheldrüsen-, Leber- und Magenkrebs-Organoide wurden im Vergleich mit kleinen und großen Plasmiden erfolgreich elektropoiert. Basierend auf GFP-Codierungsvektoren wurde die Transfektionseffizienz von FACS bestimmt. Eine umfangreiche Vorbereitung der Zellen oder spezielle, kostenintensive Elektroporationspuffer sind nicht erforderlich, und das Protokoll kann innerhalb eines Tages durchgeführt werden.

Organoide von vier verschiedenen Krebsentitäten (CRC, CCC, PDAC, GC) wurden mindestens dreimal mit 30 g eines kleinen Plasmids (pCMV-EGFP, 4,2 kb) oder einem großen Plasmid (px458, 9,3 kb) elektropoiert. Beide Vektoren tragen eine GFP-Kassette, die die Bestimmung der Transfektionseffizienz 48 h nach Elektroporation durch Durchflusszytometrie ermöglicht. Um nur lebende Zellen zu analysieren, wurde vor dem Scannen mit einem lebensbedrohlichen Antikörper gefärbt. Die Gating-Strategie ist in Abbildung 3dargestellt.
In allen vier organoiden Einheiten wurde das 4,2 kB große Plasmid mit höherer Effizienz im Vergleich zu dem größeren transfiziert (siehe Abbildung 4). Die effizienteste Transfektion des kleinen Plasmids wurde bei PDAC-Organoiden mit 92,1 x 5,2 % GFP-positiven Zellen erreicht, während das große Plasmid mit einem Wirkungsgrad von 46,7 x 3,7 % transfiziert wurde (mittlere Standardabweichung, n = 3). Im Vergleich zu Pankreaskrebsorganoiden wurde das größere Plasmid effizienter in CRC-Organoide mit einem mittleren Wirkungsgrad von 53,4 x 11,7 % transfiziert, während das kleine Plasmid mit einem mittleren Wirkungsgrad von 84,3 x 5,8 % transfiziert wurde. Am schwierigsten zu transfeken waren Magenkrebs-Organoide: Sowohl für das große als auch für das kleine Plasmid wurde in dieser Einheit die geringste Transfektionseffizienz erreicht (32,3 x 12,7 % bzw. 74,1 % bzw. 5,5 %). CCC-Organoide zeigten eine mittlere Transfektionseffizienz von 83,0 x 13,1 % für das kleine Plasmid und für das große Plasmid wurden 39,5 x 10,4 % ermittelt.
Als Beweis des Konzepts wurden menschliche normale Magenorganoide mit einem px458_Conc2 Plasmid-Codierung für Cas9, GFP und zwei sgRNAs für TP53elektropoiert. Die Cas9-induzierten Doppelstrangbrüche am Exon 8 wurden durch nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) repariert, was zu Frameverschiebungen und damit zu einem Knockout des Gens führte (siehe Ergänzende Abbildung 1).
Tabelle 1: Zusammensetzung von Basalmedien, Verdauungsmischungen und Kultivierungsmedien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704_table1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/60704/60704table2.jpg"> Tabelle 2: Elektroporationseinstellungen nach Fujii et al.10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60704/60704fig1.jpg"> Abbildung 1: Workflow zur Elektroporationsvorbereitung. Erstens sollten Organoide zu Clustern von 10-15 Zellen dissoziiert werden und Antibiotika sollten ausgewaschen werden. Nach der Elektroporation muss der weiße Schaum stofft werden. Zellen können nach 40 min Regenerierung bei Raumtemperatur ausgesät werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60704/60704fig2b.jpg"> Abbildung 2: Zweistufige Elektroporation. Zwei Poringimpulse mit höherer Spannung und kurzer Dauer (175 V und 157,5 V, jeweils für 5 ms, Pause für 50 ms, Spannungsabfall 10%) zur Bildung von Poren in Zellmembranen führen. Folgende Transferimpulse liefern die DNA in die Zellen: fünf positive Transferimpulse (mit 20 V, 12 V, 7,2 V, 4,32 V und 2.592 V, jeweils 50 ms, Pause für 50 ms, Spannungsabfall 40%), gefolgt von fünf polaritätsgetauchten Übertragungsimpulsen (mit 20 V, 12 V, 7,2 V, 4,32 V und 2.592 V, jeweils 50 ms, Pause für 50 ms, Spannungsabfall 40%). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704fig2blarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60704/60704fig3b.jpg"> Abbildung 3: Repräsentative Gating-Strategie, die von CCC-Organoiden gezeigt wird. Alle elektropoierten Organoide wurden durch Durchflusszytometrie 48 h nach Elektroporation analysiert. Zellen, die ohne Plasmid-DNA elektropoiert wurden, wurden als Negativkontrollen verwendet. Die Tore wurden wie folgt gesetzt: (A) Gating für Zellform, (B,C) Gating für einzelne Zellen (doppelte Diskriminierung), (D) Gating für lebende Zellen (mit einem Antikörper für apoptotische Zellen gefärbt) und (E,F) schließlich Gating für eGFP-exemittierende Zellen (FITC-Kanal). FSC = Vorwärtsstreuung; SSC = Seitenstreuung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704fig3blarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60704/60704fig4.jpg"> Abbildung 4: Elektroporationseffizienz von vier organoiden Einheiten. (A) FACS-Analyse (n = 34, mittlere Standardabweichung und jeder einzelne Wert werden dargestellt) und (B) visueller Vergleich mit dem Fluoreszenzmikroskop. Skalenbalken = 1.000 m. BF = helles Feld; CCC = Cholangiokarzinom; CRC = Dickdarmkrebs; GC = Magenkrebs; PDAC = pankreasische duktale Adenokarzinom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/60704/60704suppfig1a.jpg"> Ergänzende Abbildung 1: Beispielhafter CRISPR/Cas9-basierter Knockout von TP53 in normalen menschlichen Magenorganoiden. Der px458_Conc2 Vektor (siehe Materialtabelle) wurde durch die Kombination des 2 gRNA Concatemer Vektors geklont, ein großzügiges Geschenk von Bon-Kyoung Koo19, mit px45820, was zu einer Plasmid-Codierung für 2 sgRNAs, Cas9 und GFP führte. Zwei sgRNAs, die auf TP53 abzielen, wurden in px458_Conc2 Vektor durch Golden Gate Klonen eingeführt (analog zu Andersson-Rolf et al.19). 10 g Plasmid-DNA wurden in menschlichen normalen Magenorganoiden (A) elektropoiert. Klone wurden von der Nutlin3-Administration ausgewählt (B) und der TP53 Knockout wurde durch TOPO TA Klonen und Sequenzieren der Allele bestätigt, hier exemplarisch für einen Klon gezeigt (C). Die sgRNAs werden in der Referenz unterstrichen. Skala bar = 200 m. BF = helles Feld. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704suppfig1alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Universal and Efficient Electroporation Protocol for Genetic Engineering of Gastrointestinal Organoids

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Elektroporationsmethode zur Transfektion von vier verschiedenen gastrointestinalen organoiden Entitäten mit größeren Plasmiden (bis zu 10 kB). Es kann innerhalb eines Tages durchgeführt werden und benötigt keine umfangreiche Vorbereitung oder spezielle, kostenintensive Elektroporationspuffer.

Universelles und effizientes Elektroporationsprotokoll für die Gentechnik von gastrointestinalen Organoiden

Electroporation is a common method for transfection with different kinds of molecules by electrical permeabilization of the plasma membrane. With the ...

Diese Methode ermöglicht eine effiziente Transfektion von 3D-Zellkulturen wie Organoiden. Verschiedene Anwendungen der Gentechnik können erleichtert werden. Das Protokoll ist universell und kann innerhalb eines Tages ausgeführt werden.Es bedarf keiner umfangreichen Vorbereitung oder speziellen, kostenintensiven Elektroporationspuffer. Diese Transfektionsmethode wurde bei Tumoren und gesunden Organoiden demonstriert, kann aber auch an Sphäroide und 2D-Zellkultur angepasst werden. Wenn Sie dieses Protokoll zum ersten Mal durchführen, ist es wichtig, die Organoide wegen ihrer individuellen Proliferation und Reaktion auf Dissoziation mit Vorsicht zu behandeln.Überwachen Sie sie während des gesamten Eingriffs mikroskopisch. Beginnen Sie mit der Vorwärmung von 48-Well-Platten bei 37 Grad Celsius für die Post-Elektroporation-Aussaat, dann bereiten Sie basal- und organoide kulturspezifische Medien nach Manuskriptanweisungen vor. Kultivieren Sie fünf Brunnen von Organoiden pro Elektroporationsprobe in einer 48-Well-Platte, bereiten Sie 230 Mikroliter Dissoziationsreagenz mit 10-Mikromolar Y-27632 pro Brunnen vor.Überwachen Sie die Organoide unter dem Mikroskop. Entfernen Sie das Kulturmedium aus den Brunnen und dissoziieren Sie die Organoide mechanisch in der vorbereiteten Dissoziationsmischung. Fünf Brunnen pro Elektroporationsprobe in einem 15-Milliliter-Rohr bündeln.Mischen Sie den Inhalt des Rohres durch Wirbeln und inkubieren Sie es für fünf bis 15 Minuten bei 37 Grad Celsius, bis Cluster von 10 bis 15 Zellen auftreten, wobei die Dissoziation mit einem Mikroskop überprüft wird. Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie bis zu 10 Milliliter Basalmedium ohne Antibiotika hinzufügen. Zentrifugieren Sie das Rohr fünf Minuten lang mit 450 mal g, entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen zweimal mit vier Milliliterelektroporationspuffer.Zentrifugieren und entsorgen Sie den Überstand nach jeder Wäsche. Nach den Waschungen, setzen Sie das Organoidpellet in 100 Mikroliter Elektroporationspuffer mit 30 Mikrogramm Plasmid-DNA. Geben Sie die komplette DNA-Organoid-Mischung in eine Elektroporationsküvette.Achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden. Stellen Sie die Elektroporationsparameter ein, wie im Textmanuskript beschrieben, und tippen Sie mit einem Finger auf die Küvette, um die Zellen sanft zu mischen. Legen Sie die Küvette in die Küvettenkammer und drücken Sie die Impedanztaste am Elektroporator, um den Impedanzwert zu notieren.Drücken Sie die Starttaste, um das Elektroporationsprogramm zu initiieren und die Werte der angezeigten Ströme, Spannungen und Energien zu steuern. Nach der Elektroporation sofort 500 Mikroliter Kulturmedium ohne Antibiotika in die Zellen geben und durch Pipetieren nach oben und unten mischen. Übertragen Sie die Probe in ein neues 15-Milliliter-Rohr und spülen Sie die Küvette mit Basalmedium, um die verbleibenden Zellen zu sammeln, und inkubieren Sie die Zellen dann 40 Minuten lang bei Raumtemperatur.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 450 mal g für fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Das Pellet in 100 Mikroliter Kellermatrix und Samen 20-Mikroliter Tropfen in einer vorgewärmten 48-Well-Platte wieder aufhängen. Inkubieren Sie die Platte für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius für die Polymerisation und fügen Sie 250 Mikroliter Kulturmedium mit Y-27632 und CHIR99021 pro Brunnen ergänzt.Um die Transfektionseffizienz zu bestimmen, überprüfen Sie die Fluoreszenz in der Transfektionskontrolle unter dem Mikroskop nach 24 bis 48 Stunden. Für die FACS-Analyse ernten Sie die Zellen wie zuvor beschrieben und verdauen Sie 10 bis 20 Minuten, bis einzelne Zellen vorhanden sind. Addieren Sie bis zu 10 Milliliter PBS und zentrifugieren Sie die Zellen bei 450 mal g für fünf Minuten, dann aspirieren und entsorgen Sie den Überstand.Um lebende Zellen zu unterscheiden, setzen Sie das Pellet in einem Milliliter PBS wieder aus und fügen Sie einen geeigneten Antikörper oder Propidiumjodid hinzu. Mischen Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie sie tippen und bei Raumtemperatur für 30 Minuten im Dunkeln inkubieren. Nach der Inkubation die Zellen mit 10 MilliliterPBS waschen, dann zentrifugieren und den Überstand entsorgen.Setzen Sie das Zellpellet in 200 Mikroliter PBS wieder auf und filtern Sie die Suspension durch ein 100-Mikrometer-Sieb in ein FACS-Rohr. Analysieren Sie die Zellen mit einer FACS-Maschine mit der entsprechenden Gating-Strategie und bestimmen Sie die Transfektionseffizienz. Organoide von vier verschiedenen Krebsentitäten wurden mindestens dreimal mit 30 Mikrogramm eines kleinen Plasmids oder eines großen Plasmids elektropoiert.Sie wurden mit Durchflusszytometrie 48 Stunden nach der Elektroporation analysiert und für Zellform, Einzelzellen, lebende Zellen und eGFP-Expression abgegrenzt. In allen vier organoiden Entitäten wurde das kleine Plasmid mit einer höheren Effizienz transfiziert als das größere. Die effizienteste Transfektion des kleinen Plasmids wurde bei PDAC-Organoiden mit 92,1%GFP-positiven Zellen erreicht, in der Erwägung, dass das große Plasmid mit einem Wirkungsgrad von 46,7% transfiziert wurde Das größere Plasmid wurde effizienter in CRC-Organoide mit einer mittleren Effizienz von 53,4% transfiziert, während das kleine Plasmid mit einem mittleren Wirkungsgrad von 84,3% transfiziert wurde. , die die niedrigste Transfektionseffizienz für beide Plasmide zeigte.Als Beweis des Konzepts wurden menschliche normale Magenorganoide mit einem Plasmid, das für Cas9, GFP und 2sgRNAs für TP53 kodiert, elektropoiert. Klone wurden von der Nutlin3-Administration ausgewählt und der TP53-Knockout wurde durch Sequenzierung der Allele bestätigt. Wie wir mit den menschlichen Magenorganoiden demonstriert haben, ermöglicht eine effiziente Elektroporation verschiedene CRISPR Cas9-Basismanipulationen von Organoidkulturen, wie Knockout oder Knockins, so dass verschiedene Krankheiten modelliert werden können.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Forschung

Genetik

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Engineering künstliche Faktoren zur Speziellen Manipulation alternativen Spleißen in menschlichen Zellen

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Ein universelles Protokoll für groß angelegte gRNA Bibliothek Produktion aus jeder DNA-Quelle

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