Name: universal and efficient electroporation protocol for genetic engineering of gastrointestinal organoids
Uploaded: 2020-02-18T13:30:00
Duration: 7 min 19 s
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हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए जूलियन फोहग्रब, ऐन-क्रिस्टीन मेनेके और मैक्स हीडुक का शुक्रिया अदा करते हैं। ड्यूश क्रेबशिल्फ (कोई 111350 और 70112925), सैंडर स्टिफतुंग (कोई 2014.104.1), हेक्टर स्टिफतुंग (कोई M65.2) और यूरोपीय संघ (ईआरसी नंबर 639050) द्वारा वित्तपोषण प्रदान किया गया था।

टीयू ड्रेसडेन (#EK451122014) की नैतिक समिति से नैतिकता की मंजूरी ली गई थी।
1. इलेक्ट्रोपॉरेशन से पहले ऑर्गेनॉइड कल्चर और तैयारी
<ol><li>ऊतक पाचन द्वारा ऑर्गेनोइड स्थापित करें जैसा कि पहले वर्णित है और उन्हें तहखाने मैट्रिक्स में अपनी संबंधित इकाई विशिष्ट संस्कृति माध्यम से विस्तारित करें (अवलोकन तालिका 1 और सामग्री की तालिकादेखें)11,12,13,14,15,16,17। नोट: मानव ऊतक के नमूनों के लिए सूचित सहमति और एक नैतिक समिति द्वारा अध्ययन के अनुमोदन आवश्यक है ।</li>
	<li>इलेक्ट्रोपोशन सीडिंग के बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रीवार्म 48-कूवित प्लेटें।</li>
	<li>बेसल मीडियम डब्ल्यू/ओ एंटीबायोटिक्स के साथ-साथ एंटिटी स्पेसिफिक ऑर्गेनॉइड कल्चर मीडियम डब्ल्यू/ओ एंटीबायोटिक्स (टेबल 1देखें) तैयार करें जिसमें 10 माइक्रोन वाई-२७६३२ और 3 माइक्रोन चिर99021 शामिल हैं । नोट: विषाक्त प्रभावों को कम करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं की वापसी महत्वपूर्ण है। वाई-27632 और CHIR99021 सुधार सेल वसूली10.</li>
	<li>
ऑर्गेनोइड की तैयारी (चित्रा 1देखें)<ol>
<li>संस्कृति माध्यम में इलेक्ट्रोपोशन सैंपल के प्रति 48-वेल प्लेट में ऑर्गेनॉइड के 5 कुओं की खेती करें। नोट: प्रोलिफेरेटिव ऑर्गेनॉइड का उपयोग किया जाना चाहिए (पिछले बंटवारे के लगभग 2-3 दिन बाद)।</li>
		<li>10 μM Y-27632 प्रति अच्छी तरह से सहित विच्छेदन अभिकर्मक (सामग्री की तालिकादेखें) के 230 μL तैयार करें।</li>
		<li>प्रत्येक कुएं से संस्कृति माध्यम निकालें और तैयार वियोजन मिश्रण के 230 माइक्रोन में यांत्रिक रूप से ऑर्गनॉइड को अलग करें। पूल 5 कुओं प्रति इलेक्ट्रोपोराशन नमूना एक 15 मीटर ट्यूब में ।</li>
		<li>भंवर द्वारा मिश्रण और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-15 मीटर के लिए इनक्यूबेट जब तक 10-15 कोशिकाओं के समूह ों होते हैं। इसलिए, विसोशन माइक्रोस्कोपिक रूप से जांच करें। 10 मीटर तक बेसल मीडियम डब्ल्यू/ओ एंटीबायोटिक्स डालकर पाचन बंद करें। नोट: यह कदम बहुत महत्वपूर्ण है! विद्युत क्रिया क्षमता कम हो जाएगी, जब ऊष्मायन बहुत कम होगा, लेकिन लंबे पाचन से जीवितता कम हो जाएगी।</li>
		<li>कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए 450 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र, सुपरनेटेंट को त्यागें और इलेक्ट्रोपोराशन बफर के 4 मीटर के साथ दो बार धोएं (सामग्री की तालिकादेखें)।</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. इलेक्ट्रोपोरेशन
नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल वर्ग तरंगों में सक्षम इलेक्ट्रोपोरेटर के लिए विकसित किया गया है और अलग पोरिंग और स्थानांतरण पल्स दृश्यों (चित्रा 2देखें) । वैकल्पिक रूप से, बाधा मूल्यों के साथ-साथ नमूने में स्थानांतरित वोल्टेज, धाराओं और ऊर्जा को प्रजनन योग्य प्रयोगों के लिए नियंत्रण के रूप में मापा जा सकता है।
<ol><li>इलेक्ट्रोपोशन बफर के 100 माइक्रोन में ऑर्गेनॉइड पैलेट को फिर से निलंबित करें (सामग्री की तालिकादेखें) जिसमें प्लाज्मिड डीएनए का 30 μg होता है। नोट: प्रयुक्त प्लाज्मिड डीएनए की एकाग्रता इलेक्ट्रोपोराशन प्रक्रिया के दौरान इष्टतम नमक एकाग्रता के लिए 5 μg/μL से अधिक होनी चाहिए । इसलिए, वेक्टर तैयार करने के लिए एंडोफ्री प्लाज्मिड मैक्सी किट (सामग्री की तालिकादेखें) की सिफारिश की जाती है। डीएनए के 45 μg तक कुल राशि साइटोटॉक्सिक प्रभाव के बिना इस्तेमाल किया जा सकता है।</li>
	<li>हवा के बुलबुले का उत्पादन किए बिना 2 मिमी गैप चौड़ाई के साथ एक इलेक्ट्रोपोराशन क्यूवेट में पूर्ण डीएनए-ऑर्गेनॉइड मिश्रण को वितरित करें।</li>
	<li>फुजी एट अल10 के अनुसार इलेक्ट्रोपोरेशन पैरामीटर सेट करें (तालिका 2, चित्रा 2देखें)।</li>
	<li>एक उंगली के साथ cuvette दोहन द्वारा फोमिंग के बिना कोशिकाओं को थोड़ा मिलाएं। क्यूवेट को क्यूवेट चैंबर में रखें।</li>
	<li>इलेक्ट्रोपोरेटर का ω बटन दबाएं और बाधा मूल्य का नोट बनाएं। नोट: 30-40 के बीच एक बाधाω सबसे अच्छा परिणाम दिखाया । सामान्य तौर पर यह 30-55 के बीच की रेंज में होना चाहिएω। यदि यह मामला नहीं है, तो कृपया निम्नलिखित पहलुओं को नियंत्रित करें: उपयोग किए गए क्यूवेट की गैप चौड़ाई, इलेक्ट्रोपोरेटर के केबल कनेक्शन, संभावित हवा के बुलबुले, इलेक्ट्रोपोराशन मिश्रण की सही मात्रा और नमक एकाग्रता।</li>
	<li>इलेक्ट्रोपॉरणेशन प्रोग्राम को निष्पादित करने और प्रदर्शित धाराओं, वोल्टेज और ऊर्जा के मूल्यों को नियंत्रित करने के लिए स्टार्ट बटन दबाएं। नोट: मापा वोल्टेज, धाराओं और ऊर्जा के मूल्यों सेट इलेक्ट्रोपोशन मापदंडों के अनुरूप होना चाहिए । बार-बार प्रयोगों की तुलना के लिए, इन डेटा को नोट करना मददगार हो सकता है।</li>
	<li>इलेक्ट्रोपॉरेशन के बाद, तुरंत संस्कृति माध्यम w/o एंटीबायोटिक दवाओं के ५०० μL जोड़ें (CHIR99021 और Y-२७६३२ के साथ; कदम १.३ देखें) । सफेद फोम को अलग करने के लिए ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं। नोट: सफेद फोम इलेक्ट्रोपोशन प्रक्रिया के बाद दिखाई देता है और कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या से जुड़ा हुआ है । इसलिए कोशिकाओं को न खोने के लिए इसका विसोशन बहुत जरूरी है।</li>
	<li>इलेक्ट्रोपोराशन क्यूवेट से संबंधित पिपेट का उपयोग करके क्यूवेट से नमूना को पूरी तरह से 15 मिलीएल ट्यूब में स्थानांतरित करें (सामग्री की तालिकादेखें)। शेष कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए बेसल माध्यम के साथ फिर से क्यूवेट को फिर से बंद करने की सिफारिश की जाती है।</li>
	<li>कोशिकाओं के उत्थान के लिए, उन्हें कमरे के तापमान पर 40 मीटर के लिए इनक्यूबेट करें।</li>
</ol>3. कोशिकाओं की सीडिंग
<ol><li>कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए 450 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित करें और सुपरनेटेंट को त्यागदें।</li>
	<li>एक पूर्वगरम 48-अच्छी तरह से प्लेट में तहखाने मैट्रिक्स और बीज 20 μL बूंदों के 100 μL में गोली को फिर से निलंबित करें (चरण 1.2 देखें)। बहुलीकरण के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 00 के लिए इनक्यूबेट और संस्कृति माध्यम के 250 μL जोड़ें, जो विकसित ऑर्गेनॉइड (लगभग 5-7 दिनों) के अगले विभाजन तक वाई-27632 और चिर99021 के साथ पूरक है।</li>
</ol>4. ट्रांसफेक्शन दक्षता का निर्धारण
नोट: सामान्य तौर पर, अतिरिक्त ट्रांसफेक्शन नियंत्रण के रूप में फ्लोरेसेंस मार्कर ले जाने वाले वेक्टर को इलेक्ट्रोपोरेट करने की सिफारिश की जाती है। चुने हुए मार्कर और उसके गुणसूत्र परिपक्वता पर निर्भर फ्लोरेसेंस लगभग 24-48 घंटे पोस्ट ट्रांसफेक्शन18के भीतर दिखाई देगा।
<ol><li>ट्रांसफेक्शन कंट्रोल में 24-48 घंटे के बाद फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी की जांच करें (चित्रा 4बीदेखें)।</li>
	<li>
फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल स्कैनिंग (FACS)
	<ol>
<li>कोशिकाओं को 1.4.2-1.4.4 कदम करने के लिए अनुरूप रूप से फसल करें और 10-20 0 0 के आसपास पचाएं जब तक कि एकल कोशिकाएं न हों। फॉस्फेट-बफर्ड लवइन (पीबीएस) के 10 मिलील तक जोड़ें।</li>
		<li>कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए 450 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और अलौकिक त्यागें।</li>
		<li>जीवित कोशिकाओं के भेदभाव के लिए वैकल्पिक रूप से: फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें और एक उपयुक्त एंटीबॉडी जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें) या प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई)। अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए टैप करके और इनक्यूबेट द्वारा बहुत सावधानी से मिलाएं। पीबीएस के 10 mL के साथ धोएं, अपकेंद्री और अतिशयोक्ति त्यागें।</li>
		<li>पीबीएस के 200 माइक्रोन में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें और वैकल्पिक रूप से 100 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से निलंबन को एक FACS ट्यूब में फ़िल्टर करें।</li>
		<li>एक उपयुक्त गेटिंग रणनीति का उपयोग करके एक FACS मशीन द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण करें (चित्रा 3देखें; चित्रा 4ए)और ट्रांसफेक्शन दक्षता निर्धारित करें।</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Werner, K., Weitz, J., Stange, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+Model+Systems+for+Gastrointestinal+Diseases:+Tissue+Engineering+Meets+Genetic+Engineering.">Organoids as Model Systems for Gastrointestinal Diseases: Tissue Engineering Meets Genetic Engineering.</a> Current Pathobiology Reports. 4 (1), 1-9 (2016).</li><li>Olayanju, A., Jones, L., Greco, K., Goldring, C. E., Ansari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+porcine+gastrointestinal+organoid+units+as+a+potential+in+vitro+tool+for+drug+discovery+and+development.">Application of porcine gastrointestinal organoid units as a potential in vitro tool for drug discovery and development.</a> Journal of applied toxicology. 39 (1), 4-15 (2019).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+cancer+mutations+in+cultured+human+intestinal+stem+cells.">Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells.</a> Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).</li><li>Matano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+colorectal+cancer+using+CRISPR-Cas9-mediated+engineering+of+human+intestinal+organoids.">Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 21 (3), 256-262 (2015).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+CRISPR-modified+human+stem+cell+organoids+to+study+the+origin+of+mutational+signatures+in+cancer.">Use of CRISPR-modified human stem cell organoids to study the origin of mutational signatures in cancer.</a> Science. 358 (6360), 234-238 (2017).</li><li>Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+Effects+in+CRISPR/Cas9-mediated+Genome+Engineering.">Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering.</a> Molecular Therapy Nucleic Acids. 4, e264 (2015).</li><li>Tsong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cell+membranes.">Electroporation of cell membranes.</a> Biophysical journal. 60 (2), 297-306 (1991).</li><li>Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genetic+engineering+of+human+intestinal+organoids+using+electroporation.">Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection.">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Hennig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+Expression+Analysis+for+Subtyping+of+Human+Pancreatic+Cancer+Organoids.">CFTR Expression Analysis for Subtyping of Human Pancreatic Cancer Organoids.</a> Stem Cells Int. 2019, 1024614 (2019).</li><li>Seidlitz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gastric+cancer+modelling+using+organoids.">Human gastric cancer modelling using organoids.</a> Gut. 68 (2), 207-217 (2019).</li><li>Stepanenko, O. V., Verkhusha, V. V., Kuznetsova, I. M., Uversky, V. N., Turoverov, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+as+biomarkers+and+biosensors:+throwing+color+lights+on+molecular+and+cellular+processes.">Fluorescent proteins as biomarkers and biosensors: throwing color lights on molecular and cellular processes.</a> Current protein &amp; peptide science. 9 (4), 338-369 (2008).</li><li>Andersson-Rolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+paralogue+knockout+using+a+CRISPR-concatemer+in+mouse+small+intestinal+organoids.">Simultaneous paralogue knockout using a CRISPR-concatemer in mouse small intestinal organoids.</a> Dev Biol. 420 (2), 271-277 (2016).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8, 2281 (2013).</li><li>Merenda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Protocol+for+Multiple+Gene+Knockout+in+Mouse+Small+Intestinal+Organoids+Using+a+CRISPR-concatemer.">A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Lesueur, L. L., Mir, L. M., Andre, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+Specific+Toxicity+of+Large+Plasmids+Electrotransfer+in+Primary+Cells+In+Vitro.">Overcoming the Specific Toxicity of Large Plasmids Electrotransfer in Primary Cells In Vitro.</a> Molecular Therapy Nucleic Acids. 5, e291 (2016).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Darquet, A. M., Cameron, B., Wils, P., Scherman, D., Crouzet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+DNA+vehicle+for+nonviral+gene+delivery:+supercoiled+minicircle.">A new DNA vehicle for nonviral gene delivery: supercoiled minicircle.</a> Gene Therapy. 4 (12), 1341-1349 (1997).</li><li>Jacobi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+CRISPR+tools+for+efficient+genome+editing+and+streamlined+protocols+for+their+delivery+into+mammalian+cells+and+mouse+zygotes.">Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes.</a> Methods. 121-122, 16-28 (2017).</li></ol>

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

यह प्रोटोकॉल विभिन्न ऑर्गेनोइड संस्थाओं के इलेक्ट्रोपोशन को करने के लिए एक कुशल, त्वरित और आसान प्रदर्शन के लिए विस्तृत निर्देश देता है। पीडीएसी, सीआरसी, सीसीसी और जीसी से प्रस्तुत ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के लिए अतिरिक्त, यह स्वस्थ ऊतक ों से प्राप्त ऑर्गेनॉइड के लिए भी सफलतापूर्वक काम करता है। प्रोटोकॉल एक दिन के भीतर किया जा सकता है। प्रकाशित ऑर्गेनोइड ट्रांसफेक्शन प्रोटोकॉल में पूरी प्रक्रिया चार दिनों तक चली जिसमें विभिन्न प्रकार की खेती मीडिया10,21के साथ दो दिन की तैयारी शामिल है । हमारे प्रोटोकॉल में कोई विशेष पूर्वउपचार की आवश्यकता नहीं है। इलेक्ट्रोपोजन से पहले इलेक्ट्रोपोराशन बफर के साथ धोने से मीडिया के एंटीबायोटिक घटकों को धोया गया और इष्टतम बाधा मूल्यों के लिए खारा सांद्रता का समायोजन हासिल किया गया । फिर भी, एक सफल इलेक्ट्रोपोशन के लिए कुछ महत्वपूर्ण पहलुओं पर विचार किया जाना चाहिए:
कक्षों फुजी एट अल द्वारा इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल में10 को एकल कोशिकाओं में ऑर्गेनॉइड को अलग करने और उन्हें 20 माइक्रोन सेल-छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करने की सिफारिश की जाती है। एकल कोशिकाओं के लिए हमारे हाथों में पाचन कोशिकाओं की उत्तरजीविता को दृढ़ता से कम कर देता है। जैसा कि मेरेंडा एट अल21में सुझाव दिया गया है, हमने 10-15 कोशिकाओं के समूहों में ऑर्गेनॉइड को भी विसोशिएट किया और एकल कोशिका विसोशन की तुलना में कम दक्षता निर्धारित नहीं कर सके। इलेक्ट्रोपॉरेज के बाद सफेद फोम को अलग करने के लिए यह एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है, ताकि कोई संलग्न कोशिकाएं खो न जाएं।
2डी सेल संस्कृति के लिए, यह दिखाया गया है कि 40 मिन तक 10 से अधिक के विद्युतीकरण के बाद एक पुनर्जनन समय विशेष रूप से बड़े प्लाज्मिड्स22की उत्तरजीविता और ट्रांसफेक्शन दक्षता को बढ़ाता है। परीक्षण प्रयोगों में, इसे ऑर्गेनॉइड के लिए प्रलेखित किया जा सकता है, जिससे इस प्रोटोकॉल में इलेक्ट्रोपोराशन के बाद 40 मिन का ऊष्मायन कदम हो सकता है। इलेक्ट्रोपॉरेशन से रिकवरी बढ़ाने के लिए हमने उन्हें पांच से सात दिनों23के लिए Rho-संबद्ध प्रोटीन किनेज (रॉक) अवरोधक वाई-२७६३२ के साथ सुसंस्कृत किया । इसी तरह, ग्लाइकोजन सिंथाज काइनाज़ 3 (जीएसके 3) अवरोधक CHIR99021 का अतिरिक्त पूरकीकरण एकल कोशिकाओं को10को ठीक करने में मदद करने के लिए है।
सेटिंग्स उपयोग किए गए इलेक्ट्रोपोरेटर के फायदों में से एक यह है कि बाधा को इष्टतम स्थितियों के लिए इलेक्ट्रोपोराशन से पहले मापा जा सकता है। निर्माता के अनुसार बाधा मान 30-55 होनी चाहिएω। हमारे हाथों में 30-40 के बाधा मानहैंω ने इष्टतम क्षमता दिखाई है। प्रारंभिक प्रयोग में, जीवित रहने की दक्षता का इष्टतम अनुपात खोजने के लिए पोरिंग पल्स के विभिन्न वोल्टेज और पल्स लंबाई मूल्यों को अलग-अलग किया गया था। सारांश में, हम यहां वर्णित विभिन्न संस्थाओं में फुजी एट अल10 के वर्णित मूल्यों की पुष्टि कर सकते हैं।
डीएनए विभिन्न डीएनए मात्रा के प्रभाव का परीक्षण प्रारंभिक प्रयोगों में प्रति नमूने के ४५ μg डीएनए तक किया गया था । कोई साइटोटॉक्सिक प्रभाव का पता नहीं लगाया जा सका। संतृप्ति और 30 μg के साथ एक खुराक निर्भर तरीके से ट्रांसफेक्शन दक्षता में वृद्धि की गई थी। इसलिए, हमने अंतिम प्रोटोकॉल में प्रति नमूना 30 μg का उपयोग किया, लेकिन निश्चित रूप से इसे बढ़ाया जा सकता है (उदाहरण के लिए, समानांतर में अधिक प्लाज्मिड के इलेक्ट्रोपोराशन के लिए)। इसके अतिरिक्त, डीएनए की शुद्धता और एकाग्रता बहुत महत्वपूर्ण प्रतीत होती है। 5 μg/μL से अधिक एकाग्रता इष्टतम ट्रांसफेक्शन क्षमता दिखाया गया है ।
जैसा कि उम्मीद थी, 9.3 केबी प्लाज्मिड छोटे 4.2 केबी प्लाज्मिड (देखें चित्रा 4)की तुलना में कम दक्षता से ट्रांसकिया जा सकता है। 10 केबी से भी बड़े प्लाज्मिड ्स के उपयोग से दक्षता में और कमी होने का अनुमान है। भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए, एक वेक्टर के रूप में मिनीसर्कल डीएनए का परीक्षण करना दिलचस्प हो सकता है, क्योंकि इन जीन वाहकों में प्लाज्मिड की बैक्टीरियल रीढ़ की कमी होती है जो उन्हें24से छोटा बनाती है। इसके परिणामस्वरूप बढ़ी हुई ट्रांसफेक्शन दक्षता होनी चाहिए। इसके अलावा, CRISPR आधारित ऑर्गेनॉइड के जोड़तोड़ के लिए एक रिपोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) परिसर के रूप में Cas9 से बंधे एसजीआरएनए का एक सीधा इलेक्ट्रोपोशन एक विकल्प या इसके अलावा25हो सकता है।

हाल के वर्षों में, एक उपन्यास 3 डी सेल संस्कृति प्रणाली, जिसे ऑर्गेनॉइड कहा जाता है, विभिन्न सामान्य और कैंसर ऊतकों के लिए विकसित किया गया था। ऑर्गेनॉइड कार्यात्मक रूप से और रूपात्मक रूप से उनके मूल के ऊतकों के बहुत करीब होते हैं। वे विभिन्न प्रजातियों से उत्पन्न हो सकते हैं, आसानी से विस्तारयोग्य, मिलनसार रूप से स्थिर और आनुवंशिक रूप से संशोधित होते हैं, जो उन्हें आनुवंशिक जांच के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली बनाता है1,2,3। CRISPR (संकुल नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स) /Cas9 प्रणाली जैसी जेनेटिक इंजीनियरिंग तकनीक विविध जोड़तोड़ को सक्षम करती है । क्लोन के चयन को परिभाषित मीडिया स्थितियों द्वारा महसूस किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, एपीसी (एडेनोमाटोसिस पॉलीपोसिस कोलाई) नॉकआउट क्लोन4,5के लिए डब्ल्यूएनटी लिगलैंड वापसी द्वारा। वैकल्पिक रूप से, चयन मार्कर को लक्ष्यीकरण वेक्टर6,7की मरम्मत के अनुसार निर्देशित द्वारा पेश किया जाना चाहिए। इस तथ्य के कारण कि अक्सर एक से अधिक प्लाज्मिड को पेश करने की आवश्यकता होती है, एक कुशल ट्रांसफेक्शन एक महत्वपूर्ण पैरामीटर बन जाता है। इसके अतिरिक्त, अविशिष्ट ऑफ-टारगेट प्रभावों को कम करने के लिए, Cas9 एंनोटुकलीज की क्षणिक अभिव्यक्ति वांछनीय8है।
इलेक्ट्रोपोराशन डीएनए, आरएनए, प्रोटीन या अन्य मैक्रोअणुओं के साथ कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए तुलनात्मक रूप से सरल विधि है। विद्युत दालों के माध्यम से, कोशिका झिल्ली अधिक सामर्य हो जाती है और9में वृद्धि का कारण बनती है। कोलन ऑर्गेनॉइड के पहले प्रकाशित इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल में एक गुल्लक-बीएसी जीएफपी (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) व्यक्त करने वाले वेक्टर (7.4 केबी) के साथ30%दक्षता चार दिनों की प्रक्रिया 10 में पहुंच गई थी। निम्नलिखित प्रोटोकॉल एकल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) और कै9 एंडोन्यूलीज अनुक्रम (जैसे 9.3 केबी के साथ वेक्टर के रूप में px458) के लिए बड़े प्लाज्मिड्स एन्कोडिंग के साथ कैंसर या स्वस्थ ऑर्गेनॉइड के कुशल ट्रांसफेक्शन को सुविधाजनक बनाने के लिए विकसित किया गया था। पूरी इलेक्ट्रोपोराशन प्रक्रिया एक दिन के भीतर, विशेष इलेक्ट्रोपोशन बफ़र्स के बिना, और विभिन्न गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ऑर्गेनॉइड के बीच कम से कम तुलनीय क्षमताओं के साथ किया जा सकता है, अर्थात् अग्नाशय के डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी), कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी), कोलेंगियोकार्सिनोमा (जीसी) अंग।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>For establishment and culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15] Gastrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9407-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6213.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1859330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hFGF-10</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>basement matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K300.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-Cystein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Conditioned medium produced from HEK293 cells (Hek293-mNoggin-Fc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human HGF</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>100-39H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Conditioned medium produced from HEK293 cells (HA-Rspo1-Fc-293T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27,480,294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604021</td>
			<td>Dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3A</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Conditioned medium produced from L-Wnt3a cells (from Sylvia Boj)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nepa Electroporation Cuvettes 2mm gap w/pipettes</td>
			<td>Nepa Gene Co., Ltd.</td>
			<td>EC-002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 15 ml</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 15 ml low binding</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30122208</td>
			<td>Tubes for FACS preparing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator Nepa21</td>
			<td>Nepa Gene Co., Ltd.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMAFD1000</td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>647800E6</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents and plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead fixable blue dead cell stain kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34962</td>
			<td>Includes antibody for live/dead staining for FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutlin-3</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1061/07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985047</td>
			<td>Electroporation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 gRNA concatemer vector</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>84879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-EGFP</td>
			<td>Nepa Gene Co., Ltd.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>px458 plasmid</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>48138</td>
			<td>coding for sgRNA and Cas9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>px458_Conc2 plasmid</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>134449</td>
			<td>px458 plasmid containing 2x U6 promotors for two different sgRNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA_hTP53_1a</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td><img src="/files/ftp_upload/60704/60704tomeq1.jpg" /></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA_hTP53_1b</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td><img src="/files/ftp_upload/60704/60704tomeq2.jpg" /></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA_hTP53_2a</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td><img src="/files/ftp_upload/60704/60704tomeq3.jpg" /></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA_hTP53_2b</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td><img src="/files/ftp_upload/60704/60704tomeq4.jpg" /></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

universal and efficient electroporation protocol for genetic engineering of gastrointestinal organoids

इलेक्ट्रोपोराशन प्लाज्मा झिल्ली के विद्युत पार्म्यीकरण द्वारा विभिन्न प्रकार के अणुओं के साथ ट्रांसफेक्शन के लिए एक आम विधि है। पिछले वर्षों में प्राथमिक रोगी सामग्री के लिए एक खेती विधि के रूप में ऑर्गेनॉइड के बढ़ते उपयोग के साथ, इस 3 डी संस्कृति प्रणाली में आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए घटकों के कुशल हस्तांतरण तरीकों की आवश्यकता है। विशेष रूप से ऑर्गेनॉइड के लिए, आनुवंशिक जोड़तोड़ की दक्षता एक सफल ट्रांसफेक्शन पर निर्भर करती है। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल ऑर्गेनॉइड के इलेक्ट्रोपोशन को सुविधाजनक बनाने और विभिन्न संस्थाओं में अपनी सार्वभौमिक कार्यक्षमता को साबित करने के लिए विकसित किया गया था। मानव कोलोरेक्टल, अग्नाशय, हेपेटिक और गैस्ट्रिक कैंसर ऑर्गेनॉइड की तुलना में छोटे और बड़े प्लाज्मिड के साथ सफलतापूर्वक इलेक्ट्रोपोरेट किए गए थे। जीएफपी एन्कोडिंग वैक्टर के आधार पर, ट्रांसफेक्शन दक्षता एफएसीएस द्वारा निर्धारित की गई थी। कोशिकाओं या विशेष, लागत-गहन विद्युत बफ़र्स की कोई व्यापक तैयारी आवश्यक नहीं है, और प्रोटोकॉल एक दिन के भीतर किया जा सकता है।

चार अलग-अलग कैंसर संस्थाओं (सीआरसी, सीसीसी, पीडीएसी, जीसी) के ऑर्गेनॉइड को कम से कम 3 बार एक छोटे प्लाज्मिड (पीसीएमवी-ईजीपी, 4.2 केबी) या एक बड़े प्लाज्मिड (px458, 9.3 kb) के 30 μg का उपयोग करके इलेक्ट्रोपोरेट किया गया था। दोनों वैक्टर एक जीएफपी कैसेट लेते हैं जो फ्लो साइटोमेट्री द्वारा इलेक्ट्रोपोरेट के बाद ट्रांसफेक्शन दक्षता 48 एच के निर्धारण की अनुमति देता है। केवल जीवित कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए, स्कैनिंग से पहले एक जीवन मौत एंटीबॉडी के साथ धुंधला प्रदर्शन किया गया था । गेटिंग रणनीति चित्रा 3में दिखाया गया है ।
सभी चार ऑर्गेनोइड संस्थाओं में 4.2 केबी आकार के प्लाज्मिड को बड़े की तुलना में उच्च दक्षता से ट्रांसकिया गया था (चित्रा 4देखें)। छोटे प्लाज्मिड का सबसे कुशल ट्रांसफेक्शन 92.1 ± 5.2% जीएफपी सकारात्मक कोशिकाओं के साथ पीडीएसी ऑर्गेनॉइड में पहुंचा था, जबकि बड़े प्लाज्मिड को 46.7 ± 3.7% (मतलब ± मानक विचलन, एन = 3) की दक्षता से संक्रमित किया गया था। अग्नाशय के कैंसर ऑर्गेनॉइड की तुलना में, बड़ा प्लाज्मिड 53.4 ± 11.7% की औसत दक्षता के साथ सीआरसी ऑर्गेनॉइड में अधिक कुशलता से ट्रांस्प्ड था, जबकि छोटे प्लाज्मिड को 84.3 ± 5.8% की औसत दक्षता से ट्रांसकिया गया था। ट्रांसफेक्ट करने के लिए सबसे कठिन इकाई गैस्ट्रिक कैंसर ऑर्गेनॉइड थी: बड़े और छोटे प्लाज्मिड दोनों के लिए, इस इकाई (क्रमशः 32.3 ± 12.7% और 74.1 ± 5.5%) में सबसे कम ट्रांसफेक्शन दक्षता पहुंच गई थी। सीसीसी ऑर्गेनॉइड ने छोटे प्लाज्मिड के लिए 83.0 ± 13.1% की एक मतलब ट्रांसफेक्शन दक्षता दिखाई और बड़े प्लाज्मिड 39.5 ± 10.4% के लिए प्राप्त किया गया।
अवधारणा के सबूत के रूप में, मानव सामान्य पेट ऑर्गेनॉइड को Cas9, GFP और टीपी53को लक्षित करने वाले दो एसजीआरएनए के लिए प्लाज्मिड एन्कोडिंग के px458_Conc2 के साथ इलेक्ट्रोपोरेट किया गया था। एक्सोन 8 पर Cas9-प्रेरित डबल स्ट्रैंड ब्रेक की मरम्मत गैर-अाहचार अंत में शामिल होने (NHEJ) द्वारा की गई थी, जिसके परिणामस्वरूप फ्रेमशिफ्ट होते हैं और परिणामस्वरूप जीन का नॉकआउट होता है (पूरक चित्रा 1देखें)।
तालिका 1: बेसल मीडिया, पाचन मिश्रण और खेती मीडिया की संरचना। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704_table1.xlsx" target="_blank">कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/60704/60704table2.jpg"> तालिका 2: फुजी एट अल10के अनुसार इलेक्ट्रोपोशन सेटिंग्स ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60704/60704fig1.jpg"> चित्रा 1: इलेक्ट्रोपोशन तैयारी कार्यप्रवाह। सबसे पहले, ऑर्गेनॉइड को 10-15 कोशिकाओं के समूहों से विसोशिएट किया जाना चाहिए और एंटीबायोटिक दवाओं को धोया जाना चाहिए । इलेक्ट्रोपोजन के बाद सफेद फोम को विसोसिएट ेड करने की जरूरत होती है। कमरे के तापमान पर 40 न्यूनतम के लिए पुनर्जीवित करने के बाद कोशिकाओं को वरीयता दी जा सकती है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60704/60704fig2b.jpg"> चित्रा 2: दो कदम इलेक्ट्रोपोराशन। उच्च वोल्टेज und अल्प अवधि के साथ दो poring दालों (१७५ वी और १५७.५ वी, 5 एमएस के लिए प्रत्येक, ५० एमएस के लिए ठहराव, वोल्टेज क्षय 10%) कोशिका झिल्ली में छिद्रों के गठन के लिए सीसा। निम्नलिखित हस्तांतरण दालों कोशिकाओं में डीएनए उद्धार: पांच सकारात्मक हस्तांतरण दालों (20 वी के साथ, 12 वी, 7.2 वी, 4.32 वी और 2,592 वी, प्रत्येक 50 एमएस के लिए, 50 एमएस के लिए ठहराव, वोल्टेज क्षय 40%), इसके बाद पांच ध्रुवीकरण ने हस्तांतरण दालों का आदान-प्रदान किया (20 वी, 12 वी, 7.2 वी, 4.32 वी और 2,592 वी के साथ, प्रत्येक 50 एमएस के लिए ठहराव, वोल्टेज क्षय 40%)। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704fig2blarge.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60704/60704fig3b.jpg"> चित्रा 3: सीसीसी ऑर्गेनॉइड द्वारा दिखाई गई प्रतिनिधि गेटिंग रणनीति। इलेक्ट्रोपोराशन के बाद फ्लो साइटोमेट्री 48 एच द्वारा सभी इलेक्ट्रोपोरेटेड ऑर्गेनॉइड का विश्लेषण किया गया। प्लाज्मिड डीएनए के बिना इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। गेट्स निम्नलिखित के रूप में स्थापित किए गए थे:(ए)सेल आकार के लिए गेटिंग,(बी,सी)एकल कोशिकाओं के लिए गेटिंग (डबल भेदभाव),(डी)जीवित कोशिकाओं के लिए गेटिंग (अपोप्टोटिक कोशिकाओं के लिए एक एंटीबॉडी के साथ दाग) और(ई,एफ)अंत में ईजीएफपी व्यक्त कोशिकाओं (FITC चैनल) के लिए गेटिंग । एफएससी = आगे तितर बितर; एसएससी = साइड स्कैटर। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704fig3blarge.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60704/60704fig4.jpg"> चित्रा 4: चार ऑर्गेनोइड संस्थाओं की इलेक्ट्रोपोरेशन दक्षता। (A)एफएसीएस विश्लेषण (एन = 34, मतलब मानक विचलन और प्रत्येक एक मूल्य दिखाया जाता है) और(ख)फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप द्वारा दृश्य तुलना। स्केल बार = 1,000 माइक्रोन. बीएफ = उज्ज्वल क्षेत्र; सीसीसी = कोलैंगियोकार्सिनोमा; सीआरसी = कोलोरेक्टल कैंसर; जीसी = गैस्ट्रिक कैंसर; पीडीएसी = अग्नाशय के डक्टल एडेनोकार्सिनोमा। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704fig4large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/60704/60704suppfig1a.jpg"> अनुपूरक चित्र 1: अनुकरणीय CRISPR/Cas9-सामान्य मानव पेट ऑर्गेनॉइड में TP53 के नॉकआउट आधारित । px458_Conc2 वेक्टर (सामग्री की तालिकादेखें) 2 gRNA concatemer वेक्टर, बॉन-Kyoung कू19से एक उदार उपहार, px45820के साथ, 2 sgRNAs, Cas9 और GFP के लिए एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग में जिसके परिणामस्वरूप संयोजन द्वारा क्लोन किया गया था । TP53 को लक्षित करने वाले दो एसजीआरएनए को गोल्डन गेट क्लोनिंग (एंडरसन-रॉल्फ एट अल19)द्वारा px458_Conc2 वेक्टर में पेश किया गया था। 10 माइक्रोन प्लाज्मिड डीएनए को मानव सामान्य गैस्ट्रिक ऑर्गेनॉइड(ए)में इलेक्ट्रोपोरेट किया गया था। क्लोन Nutlin3 प्रशासन(बी)द्वारा चुना गया था और TP53 नॉकआउट TOPO टीए क्लोनिंग और एलील्स के अनुक्रमण द्वारा पुष्टि की थी, यहां अनुकरणीय एक क्लोन(सी)के लिए दिखाया गया है । संदर्भ में एसजीआरएनए को रेखांकित किया गया है। स्केल बार = 200 माइक्रोन. BF = उज्ज्वल क्षेत्र। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704suppfig1alarge.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

Watch this Scientific Journal Video about Universal and Efficient Electroporation Protocol for Genetic Engineering of Gastrointestinal Organoids at JoVE.com

Universal and Efficient Electroporation Protocol for Genetic Engineering of Gastrointestinal Organoids

यह प्रोटोकॉल बड़े प्लाज्मिड (10 केबी की सीमा तक) के साथ चार अलग-अलग गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ऑर्गेनॉइड संस्थाओं के ट्रांसफेक्शन के लिए एक कुशल इलेक्ट्रोपोरेशन विधि का वर्णन करता है। यह एक दिन के भीतर किया जा सकता है और व्यापक तैयारी या विशेष, लागत गहन इलेक्ट्रोपोराशन बफ़र्स की आवश्यकता नहीं है।

गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ऑर्गेनॉइड के जेनेटिक इंजीनियरिंग के लिए यूनिवर्सल और कुशल इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल

Electroporation is a common method for transfection with different kinds of molecules by electrical permeabilization of the plasma membrane. With the ...

यह विधि ऑर्गेनॉइड जैसी 3डी सेल संस्कृतियों के कुशल ट्रांसफैक्शन को सक्षम बनाती है। जेनेटिक इंजीनियरिंग के विभिन्न अनुप्रयोगों को सुविधा प्रदान की जा सकती है। प्रोटोकॉल सार्वभौमिक है और एक दिन के भीतर किया जा सकता है।यह व्यापक तैयारी या विशेष, लागत गहन विद्युतीकरण बफ़र्स की जरूरत नहीं है। इस ट्रांसफैक्शन विधि को ट्यूमर और स्वस्थ ऑर्गेनॉइड में प्रदर्शित किया गया था, लेकिन इसे गोलाकार और 2D सेल संस्कृति में भी समायोजित किया जा सकता है। यदि पहली बार इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते हैं, तो उनके व्यक्तिगत प्रसार और वियोजन की प्रतिक्रिया के कारण ऑर्गेनॉइड को देखभाल के साथ संभालना महत्वपूर्ण है।पूरी प्रक्रिया के दौरान सूक्ष्म रूप से उनकी निगरानी करें। पोस्ट इलेक्ट्रोपॉनेशन सीडिंग के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 48-अच्छी प्लेटों को प्रीवार्मिंग करके शुरू करें, फिर पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार बेसल और ऑर्गेनॉइड संस्कृति-विशिष्ट माध्यमों को तैयार करें। 48-वेल प्लेट में इलेक्ट्रोपॉरेशन नमूने के अनुसार ऑर्गेनॉइड के पांच कुओं की खेती करें, 10-माइक्रोमोलर वाई-27632 प्रति कुएं के साथ वियोजन अभिकर्मक के 230 माइक्रोलीटर तैयार करें।एक माइक्रोस्कोप के नीचे ऑर्गेनॉइड की निगरानी करें। कुओं से संस्कृति माध्यम निकालें और तैयार वियोजन मिश्रण में यांत्रिक रूप से ऑर्गेनॉइड को अलग करें। एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में इलेक्ट्रोपॉरेशन नमूना प्रति पूल पांच कुओं ।भंवर से ट्यूब की सामग्री मिलाएं और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर पांच से 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें जब तक कि 10 से 15 कोशिकाओं के समूह न हो जाए, माइक्रोस्कोप के साथ वियोजन की जांच करें। बिना एंटीबायोटिक दवाओं के बेसल माध्यम के 10 मिलीलीटर तक जोड़कर पाचन बंद करें। पांच मिनट के लिए 450 बार जी पर ट्यूब अपकेंद्रित्र करें, सुपरनेट को त्यागें, और कोशिकाओं को चार मिलीलीटर इलेक्ट्रोपॉनेशन बफर के साथ दो बार धोएं।सेंट्रलाइज करें और प्रत्येक धोने के बाद सुपरनेट को त्यागें। वॉश के बाद, 30 माइक्रोग्राम प्लाज्मिड डीएनए के साथ इलेक्ट्रोपॉरेशन बफर के 100 माइक्रोलीटर में ऑर्गेनॉइड पेलेट को फिर से खर्च करें। पूर्ण डीएनए-ऑर्गेनॉइड मिश्रण को इलेक्ट्रोपॉरेशन क्यूवेट में वितरित करें।हवा के बुलबुले से बचने के लिए सुनिश्चित करें। पाठ पांडुलिपि में वर्णित इलेक्ट्रोपॉरेशन मापदंडों को सेट करें और कोशिकाओं को धीरे-धीरे मिलाने के लिए एक उंगली से क्यूवेट को टैप करें। क्यूवेट को क्यूवेट चैंबर में रखें और बाधा मूल्य का नोट बनाने के लिए इलेक्ट्रोपोरेटर पर बाधा बटन दबाएं।इलेक्ट्रोपाउशन प्रोग्राम शुरू करने और प्रदर्शित धाराओं, वोल्टेज और ऊर्जा के मूल्यों को नियंत्रित करने के लिए स्टार्ट बटन दबाएं। इलेक्ट्रोपाउशन के बाद, तुरंत कोशिकाओं को एंटीबायोटिक दवाओं के बिना संस्कृति माध्यम के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं। नमूना को एक नई 15-मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें और शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए बेसल माध्यम के साथ क्यूवेट को कुल्ला करें, फिर 40 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।कोशिकाओं को पांच मिनट के लिए 450 बार जी पर अपकेंद्रित्र करें और सुपरनेट को त्याग दें। बेसमेंट मैट्रिक्स के 100 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से खर्च करें और बीज 20-माइक्रोलीटर एक प्रीवार्मेड 48-वेल प्लेट में गिरता है। पॉलीमराइजेशन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें और वाई-27632 और चिर99021 प्रति अच्छी तरह से पूरक संस्कृति माध्यम के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें।ट्रांसफेक्शन एफिशिएंसी तय करने के लिए, 24 से 48 घंटे के बाद माइक्रोस्कोप के नीचे ट्रांसफेक्शन कंट्रोल में फ्लोरेसेंस की जांच करें। FACS विश्लेषण के लिए, कोशिकाओं को फसल के रूप में पहले वर्णित है और 10 से 20 मिनट के लिए पचा जब तक एकल कोशिकाओं मौजूद हैं । पीबीएस के 10 मिलीलीटर तक जोड़ें और पांच मिनट के लिए 450 बार जी पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें, फिर सुपरनेट को एस्पिरेट करें और त्यागें।जीवित कोशिकाओं के लिए भेदभाव करने के लिए, पीबीएस के एक मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें और एक उपयुक्त एंटीबॉडी या प्रोपिडियम आयोडाइड जोड़ें। धीरे-धीरे कोशिकाओं को टैप करके मिलाएं और अंधेरे में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर उन्हें इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को पीबीएस के 10 मिलीलीटर से धोएं, फिर अपकेंद्रित्र करें और सुपरनेट को त्यागें।पीबीएस के 200 माइक्रोलीटर में सेल पेलेट को फिर से रीसुस्ल करें और 100 माइक्रोमीटर छलनी के माध्यम से निलंबन को एक FACS ट्यूब में फ़िल्टर करें। उपयुक्त गेटिंग रणनीति का उपयोग करके एक FACS मशीन के साथ कोशिकाओं का विश्लेषण करें और ट्रांसफैक्शन दक्षता निर्धारित करें। चार विभिन्न कैंसर संस्थाओं के ऑर्गेनॉइड को एक छोटे प्लाज्मिड या बड़े प्लाज्मिड के 30 माइक्रोग्राम का उपयोग करके कम से कम तीन बार इलेक्ट्रोपेटेड किया गया था।वे इलेक्ट्रोपाउरेशन के 48 घंटे बाद प्रवाह साइटोमेट्री के साथ विश्लेषण किया गया और सेल आकार, एकल कोशिकाओं, जीवित कोशिकाओं और ईजीएफपी अभिव्यक्ति के लिए गेट किया गया। सभी चार ऑर्गेनॉइड संस्थाओं में, छोटे प्लाज्मिड को बड़े की तुलना में उच्च दक्षता से संक्रमित किया गया था। छोटे प्लाज्मिड का सबसे कुशल ट्रांसफैक्शन 92.1% जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं के साथ पीडीएसी ऑर्गेनॉइड में पहुंचा था, जबकि बड़े प्लाज्मिड 46.7% की दक्षता से संक्रमित था बड़ा प्लाज्मिड 53.4% की औसत दक्षता के साथ सीआरसी ऑर्गेनॉइड में अधिक कुशलता से संक्रमित था जबकि छोटे प्लाज्मिड को 84.3% की औसत दक्षता से संक्रमित किया गया था ट्रांसफेक्ट करने के लिए सबसे कठिन इकाई गैस कैंसर ऑर्गेनॉइड थे , जिसने दोनों प्लाज्मिड्स के लिए सबसे कम ट्रांसफैक्शन दक्षता का प्रदर्शन किया।अवधारणा के सबूत के रूप में, मानव सामान्य पेट ऑर्गेनॉइड को Cas9, GFP और 2sgRNAs के लिए प्लाज्मिड एन्कोडिंग के साथ इलेक्ट्रोपेटेड किया गया था, जो टीपी53 को लक्षित करता था। क्लोन Nutlin3 प्रशासन द्वारा चुने गए थे और TP53 नॉकआउट alleles के अनुक्रमण द्वारा पुष्टि की थी । जैसा कि हमने मानव पेट ऑर्गेनॉइड के साथ प्रदर्शन किया, कुशल इलेक्ट्रोपाउशन विभिन्न CRISPR Cas9 आधार जोड़तोड़ को सक्षम बनाता है, जैसे नॉकआउट या नॉकइन, इसलिए विभिन्न बीमारियों को मॉडलिंग किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

अक्षय जैव ईंधन और जैव रासायनिक उत्पादन के लिए एक अपरंपरागत खमीर की जेनेटिक इंजीनियरिंग

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

इंजिनियरिंग कृत्रिम कारक विशेष रूप से मानव कोशिकाओं में वैकल्पिक स्पष्टीकरण में हेरफेर करने के लिए

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

किसी भी डीएनए स्रोत से बड़े पैमाने पर gRNA पुस्तकालय उत्पादन के लिए एक सार्वभौमिक प्रोटोकॉल

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

एक तेजी से चांदी धुंधला प्रोटोकॉल एक गैर denaturing Polyacrylamide जेल का उपयोग कर एसएसआर मार्करों के सरल और कुशल का पता लगाने को सक्षम करने

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

संवैधानिक रोग के आनुवंशिक निर्धारकों का मूल्यांकन करने के लिए लक्षित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण और Bioinformatics पाइपलाइन

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

अलगाव, लक्षण वर्णन और मानव दंत कूप स्टेम सेल के MicroRNA आधारित आनुवंशिक संशोधन

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

बैक्टीरिया पर चयन और विकास के आधार पर Dictyostelium discoideum कोशिकाओं की जेनेटिक इंजीनियरिंग

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

एनेउप्लॉयडी के लिए प्रीमेंप्लांटेशन जेनेटिक टेस्टिंग के लिए सेमीकंडक्टर अनुक्रमण

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Lyssaवायरसों का पता लगाने के लिए एक सार्वभौमिक नेस्टेड रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन Polymerase चेन रिएक्शन का मूल्यांकन

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoप्रोटीन-मध्यस्थ सटीक जीन संपादन द्वारा ट्यूब इलेक्ट्रोपोरेशन

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...