Name: universal and efficient electroporation protocol for genetic engineering of gastrointestinal organoids
Uploaded: 2020-02-18T13:30:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Universal and Efficient Electroporation Protocol for Genetic Engineering of Gastrointestinal Organoids at JoVE.com

Мы благодарим Джулиана Фохруба, Анн-Кристин Мейнеке и Макса Хайдука за отличную техническую помощь. Финансирование обеспечили Deutsche Krebshilfe (No 111350 и 70112925), Сандер Стифтунг (No 2014.1), Гектор Стифтунг (No M65.2) и Европейский союз (ERC No 639050).

Разрешение на этику было получено от комитета по этике Дрездена (#EK451122014).
1. Органоидная культура и препараты перед электропорированием
<ol><li>Установить органоиды по перевариванию тканей, как описано ранее, и расширить их с соответствующей сущности конкретной среды культуры в подвале матрицы (обзор см. Таблица 1 и Таблица материалов)11,12,13,14,15,16,17. ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов тканей человека необходимо информированное согласие и одобрение исследования этическим комитетом.</li>
	<li>Предопрогрейте 48-колодные пластины при 37 градусах Посева при 37 градусах по Цельсию для постэлектропорации.</li>
	<li>Подготовка базальных средних без антибиотиков, а также лица конкретных органоидных культуры среднего ж / о антибиотиков (см. Таблица 1) в том числе 10 МКм Y-27632 и 3 мкм CHIR99021. ПРИМЕЧАНИЕ: Отмена антибиотиков имеет важное значение для уменьшения токсического воздействия. Y-27632 и CHIR99021 улучшение восстановления клеток10.</li>
	<li>
Приготовление органоидов (см. рисунок 1)<ol>
<li>Выращивайте 5 скважин органоидов в 48-колодецной пластине на образец электропорации в культурной среде. ПРИМЕЧАНИЕ: Пролиферативные органоиды должны быть использованы (около 2-3 дней после последнего расщепления).</li>
		<li>Подготовьте 230 злицитационный реагент (см. Таблицу Материалов),в том числе 10 мкм Y-27632 на скважину.</li>
		<li>Удалите культурную среду из каждой скважины и механически разъедините органоиды в 230 злицы подготовленной диссоциационистской смеси. Бассейн 5 скважин на электропорацию образца в одну трубку 15 мл.</li>
		<li>Смешайте путем вихря и инкубировать в течение 5-15 мин при 37 градусах Цельсия, пока кластеры 10-15 клеток происходят. Поэтому проверьте диссоциационную микроскопию. Остановить пищеварение, добавив базальные средние антибиотики w/o до 10 мл. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг очень важен! Эффективность электропорации будет снижена, когда инкубация слишком коротка, но длительное пищеварение снизит живучесть.</li>
		<li>Центрифуга при температуре 450 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, отбросьте супернатант и дважды промойте 4 мл электропоряционного буфера (см. Таблица материалов).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Электропорация
ПРИМЕЧАНИЕ: Для электропороров, способных к квадратным волнам и разделенным последовательности пульса (см. рисунок 2),разработан следующий протокол. Дополнительно значения импедеданции, а также напряжения, токи и энергии, передаваемые в выборку, могут быть измерены как контроль для воспроизводимых экспериментов.
<ol><li>Отрепетить органоидные гранулы в 100 зл и буферэлектроационных (см. Таблица материалов),содержащий 30 мкг плазмидной ДНК. ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация используемой плазмидной ДНК должна превышать 5 мкг/Л для оптимальной концентрации соли в процессе электропорации. Поэтому для приготовления переносчиков рекомендуются эндофри-плазменные макси-наборы (см. Таблица материалов). Общее количество до 45 мкг ДНК может быть использовано без цитотоксического воздействия.</li>
	<li>Распределите полную ДНК-органоидную смесь в кювет электропорации с шириной 2 мм, не производя пузырьков воздуха.</li>
	<li>Установите параметры электропорации в соответствии с Fujii et al.10 (см. Таблица 2, Рисунок 2).</li>
	<li>Смешайте клетки немного без вспенивания, нажав на кювет пальцем. Поместите кювет в камеру кювета.</li>
	<li>Нажмите кнопку электропоратора и сделайте заметку о значении импедеданса. ПРИМЕЧАНИЕ: Импеданс между 30-40 и показал лучшие результаты. В общем, он должен находиться в диапазоне от 30-55 евро. Если это не так, пожалуйста, контролируйте следующие аспекты: ширина зазора используемого кветка, кабельные соединения электропорера, возможные пузырьки воздуха, правильный объем и концентрация соли смеси электропорации.</li>
	<li>Нажмите кнопку «Пуск», чтобы выполнить программу электропорации и контролировать значения показанных токов, напряжений и энергий. ПРИМЕЧАНИЕ: Значения измеренных напряжений, токов и энергий должны соответствовать установленным параметрам электропорации. Для сравнения повторных экспериментов, это может быть полезно отметить эти данные.</li>
	<li>После электропорации немедленно добавляйте 500 зЛ культурных антибиотиков w/o (с CHIR99021 и Y-27632; см. шаг 1.3). Смешайте путем pipetting вверх и вниз, чтобы разъединить белую пену. ПРИМЕЧАНИЕ: Белая пена появляется после процесса электропорации и значительное количество клеток прилагается к нему. Таким образом, диссоциация его очень важно для не потерять клетки.</li>
	<li>Передача образца полностью из кювета в новую трубку 15 мл с помощью пипетки, принадлежащей к кювету электропорации (см. Таблица материалов). Промыть квет снова с базальной среды рекомендуется для получения оставшихся клеток.</li>
	<li>Для регенерации клеток инкубировать их в течение 40 минут при комнатной температуре.</li>
</ol>3. Посев клеток
<ol><li>Центрифуги клетки на 450 х г в течение 5 минут при комнатной температуре и отбросить супернатант.</li>
	<li>Повторите гранулы в 100 qL фундаментальной матрицы и семени 20 капель L в предварительно разогретой 48-хорошо пластины (см. шаг 1.2). Инкубировать в течение 10 мин при 37 градусах По Цельсия для полимеризации и добавить 250 кЛ культуры среды, которая дополняется Y-27632 и CHIR99021 до следующего расщепления выросли органоиды (около 5-7 дней).</li>
</ol>4. Определение эффективности трансфекции
ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, рекомендуется электропоратный вектор, несущий флуоресценционный маркер в качестве дополнительного контроля трансфекции. В зависимости от выбранного маркера и его созревания хромофора флуоресценция будет видна в пределах 24-48 ч после трансфекции18.
<ol><li>Проверьте флуоресценцию микроскопически после 24-48 ч в трансфекционном контроле (см. рисунок 4B).</li>
	<li>
Флуоресцентное активированное сканирование клеток (FACS)
	<ol>
<li>Урожай клетки аналогично шаг 1.4.2-1.4.4 и переварить около 10-20 мин, пока Есть одиночные клетки. Добавьте до 10 мл фосфатно-буферизированного сольятого раствора (PBS).</li>
		<li>Центрифуга при температуре 450 х г в течение 5 мин при комнатной температуре и отбрасываете супернатант.</li>
		<li>Дополнительно для дискриминации живых клеток: Приостановить гранулы в 1 мл фосфат-буферизированного солей (PBS) и добавить подходящее антитело (см. Таблица материалов)или пропидий йодид (PI). Смешайте очень тщательно только нажав и инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Вымойте 10 мл PBS, центрифуги и отбросить супернатант.</li>
		<li>Приостановите действие клеточных гранул в 200 Л ПБС и дополнительно процедите подвеску через 100 мкм-ситечко в трубку FACS.</li>
		<li>Анализ клеток с помощью машины FACS с помощью соответствующей стратегии gating (см. Рисунок 3; Рисунок 4А) и определить эффективность трансфекции.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Werner, K., Weitz, J., Stange, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+Model+Systems+for+Gastrointestinal+Diseases:+Tissue+Engineering+Meets+Genetic+Engineering.">Organoids as Model Systems for Gastrointestinal Diseases: Tissue Engineering Meets Genetic Engineering.</a> Current Pathobiology Reports. 4 (1), 1-9 (2016).</li><li>Olayanju, A., Jones, L., Greco, K., Goldring, C. E., Ansari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+porcine+gastrointestinal+organoid+units+as+a+potential+in+vitro+tool+for+drug+discovery+and+development.">Application of porcine gastrointestinal organoid units as a potential in vitro tool for drug discovery and development.</a> Journal of applied toxicology. 39 (1), 4-15 (2019).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+cancer+mutations+in+cultured+human+intestinal+stem+cells.">Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells.</a> Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).</li><li>Matano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+colorectal+cancer+using+CRISPR-Cas9-mediated+engineering+of+human+intestinal+organoids.">Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 21 (3), 256-262 (2015).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+CRISPR-modified+human+stem+cell+organoids+to+study+the+origin+of+mutational+signatures+in+cancer.">Use of CRISPR-modified human stem cell organoids to study the origin of mutational signatures in cancer.</a> Science. 358 (6360), 234-238 (2017).</li><li>Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+Effects+in+CRISPR/Cas9-mediated+Genome+Engineering.">Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering.</a> Molecular Therapy Nucleic Acids. 4, e264 (2015).</li><li>Tsong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cell+membranes.">Electroporation of cell membranes.</a> Biophysical journal. 60 (2), 297-306 (1991).</li><li>Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genetic+engineering+of+human+intestinal+organoids+using+electroporation.">Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection.">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Hennig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+Expression+Analysis+for+Subtyping+of+Human+Pancreatic+Cancer+Organoids.">CFTR Expression Analysis for Subtyping of Human Pancreatic Cancer Organoids.</a> Stem Cells Int. 2019, 1024614 (2019).</li><li>Seidlitz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gastric+cancer+modelling+using+organoids.">Human gastric cancer modelling using organoids.</a> Gut. 68 (2), 207-217 (2019).</li><li>Stepanenko, O. V., Verkhusha, V. V., Kuznetsova, I. M., Uversky, V. N., Turoverov, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+as+biomarkers+and+biosensors:+throwing+color+lights+on+molecular+and+cellular+processes.">Fluorescent proteins as biomarkers and biosensors: throwing color lights on molecular and cellular processes.</a> Current protein &amp; peptide science. 9 (4), 338-369 (2008).</li><li>Andersson-Rolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+paralogue+knockout+using+a+CRISPR-concatemer+in+mouse+small+intestinal+organoids.">Simultaneous paralogue knockout using a CRISPR-concatemer in mouse small intestinal organoids.</a> Dev Biol. 420 (2), 271-277 (2016).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8, 2281 (2013).</li><li>Merenda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Protocol+for+Multiple+Gene+Knockout+in+Mouse+Small+Intestinal+Organoids+Using+a+CRISPR-concatemer.">A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Lesueur, L. L., Mir, L. M., Andre, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+Specific+Toxicity+of+Large+Plasmids+Electrotransfer+in+Primary+Cells+In+Vitro.">Overcoming the Specific Toxicity of Large Plasmids Electrotransfer in Primary Cells In Vitro.</a> Molecular Therapy Nucleic Acids. 5, e291 (2016).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Darquet, A. M., Cameron, B., Wils, P., Scherman, D., Crouzet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+DNA+vehicle+for+nonviral+gene+delivery:+supercoiled+minicircle.">A new DNA vehicle for nonviral gene delivery: supercoiled minicircle.</a> Gene Therapy. 4 (12), 1341-1349 (1997).</li><li>Jacobi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+CRISPR+tools+for+efficient+genome+editing+and+streamlined+protocols+for+their+delivery+into+mammalian+cells+and+mouse+zygotes.">Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes.</a> Methods. 121-122, 16-28 (2017).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Этот протокол дает подробные инструкции для эффективного, быстрого и легкого для выполнения электропорации различных органоидных сущностей. Помимо представленных опухолевых органоидов из PDAC, CRC, CCC и GC, он успешно работает для органоидов, полученных из здоровых тканей, а также. Протокол может быть выполнен в течение одного дня. В опубликованных протоколах органоидной трансфекции вся процедура длилась четыре дня, включая два дня препаратов с различными типами культивирования носителей10,21. В нашем протоколе не требуется специальной предварительной обработки. Путем мытья с буфером электропорации перед электропорированием компоненты антибиотика средств были вымыты вне и регулировка концентраций солиней для оптимальных значений impedance была достигнута. Тем не менее, некоторые критические аспекты должны быть рассмотрены для успешного электропорации:
Клетки В протоколе электропорации Fujii et al.10 рекомендуется отмежевать органоиды к одиночным клеткам и фильтровать их через 20 мкм-ситечко. В наших руках пищеварение в одиночные клетки сильно снижает живучесть клеток. Как было предложено в Merenda et al.21,мы также разъединили органоиды на кластеры 10-15 клеток и не могли определить пониженную эффективность по сравнению с одноклеточной диссоциацией. После электропорации, это очень важный шаг, чтобы разъединить белую пену, так что никакие прикрепленные клетки не теряются.
Для 2D-клеточной культуры было показано, что время регенерации после электропорации более 10 мин до 40 мин повышает живучесть и эффективность трансфекции, особенно крупных плазмидов22. В тестовых экспериментах то же самое можно задокументировать для органоидов, что привело к инкубации шаг 40 мин после электропорации в этом протоколе. Для того, чтобы увеличить восстановление после электропорации, мы культивировали их с Род-ассоциированным ингибитором белка киназы (ROCK) Y-27632 в течение пяти-семи дней23. Аналогичным образом, дополнительные добавки гликогена синтазы киназы 3 (GSK3) ингибитор CHIR99021 предназначен, чтобы помочь одиночных клеток для восстановления10.
Параметры Одним из преимуществ используемого электропорера является то, что импеданс может быть измерен до электропорации для оптимальных условий. По мнению производителя, значения импедеданса должны составить 30-55 евро. В наших руках импедеданные значения 30-40 и 30-40 евро показали оптимальную эффективность. В ходе предварительного эксперимента различные напряжения и значения длины пульса пульса были изменены, чтобы найти оптимальную пропорцию эффективности к живучести. Таким образом, мы могли бы подтвердить описанные значения Fujii et al.10 в различных сущностях, описанных здесь.
Днк Эффект различных количеств ДНК был протестирован в ходе предварительных экспериментов до 45 мкг ДНК на образец. Никаких цитотоксических эффектов обнаружено не может. Эффективность трансфекции была увеличена в дозе зависимым способом с насыщением и 30 мкг. Таким образом, мы использовали 30 мкг на образец в итоговом протоколе, но, конечно, он может быть увеличен (например, для электропорации более плазмиды параллельно). Кроме того, чистота и концентрация ДНК, как представляется, очень важно. Концентрация, превышающая 5 мкг/л, показала оптимальную эффективность трансфекции.
Как и ожидалось, плазмида 9,3 кВ может быть трансфицируется с меньшей эффективностью, чем меньший плазмид 4,2 кВ (см. рисунок 4). Ожидается, что использование еще больших плазмидов, чем 10 кВ, приведет к дальнейшему снижению эффективности. Для будущих применений, это может быть интересно проверить мини-круг ДНК в качестве вектора, так как эти генные носители отсутствие бактериальной позвоночника плазмиды, что делает их меньше24. Это должно привести к повышению эффективности трансфекции. Кроме того, для CRISPR основе манипуляций органоидов прямой электропорации sgRNAs связаны cas9 как рибонуклеопротеин (RNP) комплекс может быть альтернативой илидополнением 25.

В последние годы, новая система 3D-клеточной культуры, называется органоидов, была разработана для различных нормальных и раковых тканей. Органоиды функционально и морфологически очень близки к их ткани происхождения. Они могут быть получены из различных видов, легко расширяемые, геномно стабильны и генетически изменяемы, что делает их идеальной модельной системой для генетических исследований1,2,3. Методы генной инженерии, такие как CRISPR (кластерные регулярно межпространственные короткие палиндромные повторы)/Система Cas9 позволяют осуществлять разнообразные манипуляции. Выбор клонов может быть реализован по определенным медиа-условиям, например, путем вывода ЛИГАнд WNT для APC (Adenomatosis Polyposis Coli) нокаутклонов4,5. Кроме того, маркеры отбора должны быть введены гомологичным направленным ремонтом вектор таргетинга6,7. В связи с тем, что часто требуется внедрять более одного плазмида, эффективная трансфекция становится важнейшим параметром. Кроме того, чтобы уменьшить неспецифические вне целевых эффектов, переходное выражение cas9 эндонуклеазы желательно8.
Электропорация является сравнительно простым методом трансфектных клеток с ДНК, РНК, белками или другими макромолекулами. С помощью электрических импульсов, клеточная мембрана становится более проницаемой и вызывает увеличение поглощения9. В ранее опубликованном протоколе электропорации органов толстой кишки 30% эффективность с поросенок-бак GFP (зеленый флуоресцентный белок) выражая вектор (7.4 кB) была достигнута в четырехдневной процедуре10. Следующий протокол был разработан для облегчения эффективного трансфекции раковых или здоровых органоидов с большими плазмидами, кодируя для однонаправной РНК (sgRNA) и последовательности эндонуклеаза Cas9 (например, px458 как вектор с 9,3 кб). Весь процесс электропорации может быть выполнен в течение одного дня, без специальных буферов электропорации, и по крайней мере сопоставимых эффективности между различными желудочно-кишечных органоидов, а именно поджелудочной железы протоковой аденокарциномы (PDAC), колоректального рака (CRC), холангиокарцинома (CCC) и желудочного рака (ГК).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>For establishment and culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15] Gastrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9407-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6213.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1859330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hFGF-10</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>basement matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K300.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-Cystein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Conditioned medium produced from HEK293 cells (Hek293-mNoggin-Fc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human HGF</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>100-39H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Conditioned medium produced from HEK293 cells (HA-Rspo1-Fc-293T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27,480,294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604021</td>
			<td>Dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3A</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Conditioned medium produced from L-Wnt3a cells (from Sylvia Boj)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nepa Electroporation Cuvettes 2mm gap w/pipettes</td>
			<td>Nepa Gene Co., Ltd.</td>
			<td>EC-002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 15 ml</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 15 ml low binding</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30122208</td>
			<td>Tubes for FACS preparing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator Nepa21</td>
			<td>Nepa Gene Co., Ltd.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMAFD1000</td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>647800E6</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents and plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead fixable blue dead cell stain kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34962</td>
			<td>Includes antibody for live/dead staining for FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutlin-3</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1061/07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985047</td>
			<td>Electroporation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 gRNA concatemer vector</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>84879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-EGFP</td>
			<td>Nepa Gene Co., Ltd.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>px458 plasmid</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>48138</td>
			<td>coding for sgRNA and Cas9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>px458_Conc2 plasmid</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>134449</td>
			<td>px458 plasmid containing 2x U6 promotors for two different sgRNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA_hTP53_1a</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td><img src="/files/ftp_upload/60704/60704tomeq1.jpg" /></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA_hTP53_1b</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td><img src="/files/ftp_upload/60704/60704tomeq2.jpg" /></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA_hTP53_2a</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td><img src="/files/ftp_upload/60704/60704tomeq3.jpg" /></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA_hTP53_2b</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td><img src="/files/ftp_upload/60704/60704tomeq4.jpg" /></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

universal and efficient electroporation protocol for genetic engineering of gastrointestinal organoids

Электропорация является распространенным методом трансфекции с различными видами молекул путем электрической пермяки плазменной мембраны. С увеличением использования органоидов в качестве культивирования метода первичного материала пациента в последние годы, эффективные методы передачи компонентов для генной инженерии в этой системе 3D культуры нуждаются. Особенно для органоидов эффективность генетических манипуляций зависит от успешной трансфекции. Таким образом, этот протокол был разработан для облегчения электропорации органоидов и для доказательства его универсальной функциональности в различных сущностях. Человеческие колоректальные, поджелудочные, печеночные и раковые органоиды желудка были успешно электропоранированы с малыми и большими плазмидами в сравнении. На основе векторов кодирования GFP эффективность трансфекции определялась FACS. Нет необходимости в обширной подготовке клеток или специальных, затратоемких электропорных буферов, и протокол может быть выполнен в течение одного дня.

Органоиды четырех различных онкологических образований (CRC, CCC, PDAC, GC) были электропоированы не менее 3 раз с использованием 30 мкг небольшой плазмиды (pCMV-EGFP, 4,2 кб) или большой плазмиды (px458, 9.3 кБ). Оба вектора несут кассету GFP, позволяющую определить эффективность трансфекции 48 ч после электропорации цитометрией потока. Анализировать только живые клетки, окрашивание антителами смерти жизни перед сканированием. Стратегия gating показана на рисунке 3.
Во всех четырех органоидных сущностях плазмида размером 4,2 кБ была трансинфицирована с более высокой эффективностью по сравнению с более крупной (см. рисунок 4). Наиболее эффективная трансфекция мелкой плазмиды была достигнута в органоидах PDAC с 92,1 и 5,2% Положительных клеток GFP, в то время как большая плазмида была трансинфицирована с эффективностью 46,7 и 3,7% (среднее стандартное отклонение, n No 3). По сравнению с органоидами рака поджелудочной железы, большая плазмида была более эффективно трансфицирована в органоиды CRC со средней эффективностью 53,4 и 11,7%, в то время как небольшая плазмида была трансинфицирована со средней эффективностью 84,3 и 5,8 %. Наиболее сложными для трансфекта были органоиды рака желудка: как для больших, так и для небольшой плазмиды, самая низкая эффективность трансфекции была достигнута в этом субъекте (32,3 и 12,7% и 74,1 и 5,5%, соответственно). Органоиды CCC показали среднее трансфекционную эффективность 83.0 и 13.1 % для малого плазмиды и для большой плазмиды 39.5 и 10.4% были получены.
В качестве доказательства концепции, нормальные органоиды желудка человека были электропоидированы с px458_Conc2 плазмид кодирования для Cas9, GFP и два sgRNAs ориентации TP53. Cas9-индуцированных двойных нитей перерывы на экзон 8 были отремонтированы не-гомологичное окончание (NHEJ), в результате чего frameshifts и, следовательно, нокаут гена (см. Дополнительная рисунок 1).
Таблица 1: Состав базальных носителей, смесей пищеварения и средств культивирования. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704_table1.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/60704/60704table2.jpg"> Таблица 2: Настройки электропорации в соответствии с Fujii и др.10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60704/60704fig1.jpg"> Рисунок 1: Рабочий процесс подготовки электропорации. Во-первых, органоиды должны быть разобщены с кластерами из 10-15 клеток и антибиотики должны быть вымываются. После электропорации белую пену необходимо разъединить. Клетки могут быть посеяны после регенерации в течение 40 минут при комнатной температуре. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60704/60704fig2b.jpg"> Рисунок 2: Двухступенчатая электропорация. Два poring импульса с более высоким напряжением и короткой продолжительностью (175 V и 157.5 V, каждый на 5 мс, пауза на 50 мс, распад напряжения 10%) привести к образованию пор в клеточных мембранах. Следующие импульсы передачи поставляют дна в клетки: 5 положительных ИМПы ульс перехода (с 20 V, 12 V, 7.2 V, 4.32 V и 2,592 V, каждый на 50 мс, пауза на 50 мс, распад напряжения 40%), а затем пять полярности обменялись импульсами передачи (с 20 V, 12 V, 7.2 V, 4.32 V и 2,592 V, каждый на 50 мс, пауза на 50 мс, напряжение распада 40%). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704fig2blarge.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60704/60704fig3b.jpg"> Рисунок 3: Представитель gating стратегии показано CCC органоидов. Все электропорированные органоиды были проанализированы цитометрией течения 48 h после электропорации. Клетки, электропозаливаемые без плазмидной ДНК, использовались в качестве отрицательного контроля. Ворота были установлены следующим образом: (A) gating для формы клетки, (B,C) gating для одиночных клеток (двойная дискриминация), (D) gating для живых клеток (окрашенных с антителом для апоптотические клетки) и (E,F) наконец gating для eGFP выражая клетки (FITC канал). FSC - рассеяние вперед; SSC и боковой рассеяние. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704fig3blarge.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60704/60704fig4.jpg"> Рисунок 4: Эффективность электропорации четырех органоидных сущностей. (A) анализ FACS (n no 34, среднее стандартное отклонение и каждое отдельное значение показано) и (B)визуальное сравнение флуоресцентным микроскопом. Шкала бар - 1000 мкм. BF - яркое поле; КСК и холангиокарцинома; CRC - колоректальный рак; GC - рак желудка; PDAC - аденокарцинома поджелудочной железы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/60704/60704suppfig1a.jpg"> Дополнительная фигура 1: Образцовый CRISPR/Cas9 на основе нокаута TP53 в нормальных органов желудка человека. Вектор px458_Conc2 (см. Таблица материалов) был клонирован путем объединения 2 gRNA конкатетер вектор, щедрый подарок от Bon-Kyoung Koo19, с px45820, в результате плазмид кодирования для 2 sgRNAs, Cas9 и GFP. Два sgRNA ориентации TP53 были введены в px458_Conc2 вектор омрачительным клонированием золотых ворот (аналогично Андерссон-Рольф и др.19). 10 мкг плазмидной ДНК были электропоированы в нормальных желудочных органоидах человека(А). Клоны были выбраны Nutlin3 администрации (B) и TP53 нокаут был подтвержден TOPO TA клонирования и последовательности аллелей, здесь образцовое показано для одного клона (C). SgRNA подчеркнуты в справке. Шкала бар 200 мкм. BF - яркое поле. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704suppfig1alarge.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Universal and Efficient Electroporation Protocol for Genetic Engineering of Gastrointestinal Organoids at JoVE.com

Universal and Efficient Electroporation Protocol for Genetic Engineering of Gastrointestinal Organoids

Этот протокол описывает эффективный метод электропорации для трансфекции четырех различных органоидов желудочно-кишечного тракта с более крупными плазмидами (в размере 10 кВ). Она может быть выполнена в течение одного дня и не нуждается в обширной подготовке или специальных, затратных электропорация буферов.

Универсальный и эффективный протокол электропорации для генной инженерии гастроэнтепробий органоидов

Electroporation is a common method for transfection with different kinds of molecules by electrical permeabilization of the plasma membrane. With the ...

Этот метод обеспечивает эффективную трансфекцию 3D-клеточных культур, таких как органоиды. Различные применения генной инженерии могут быть облегчены. Протокол является универсальным и может быть выполнен в течение одного дня.Он не нуждается в обширной подготовке или специальных, экономически интенсивных буферах электропорации. Этот метод трансфекции был продемонстрирован в опухоли и здоровых органоидов, но он может быть скорректирован на сфероиды и 2D-клеточной культуры, тоже. При выполнении этого протокола в первый раз, важно обращаться с органоидами с осторожностью из-за их индивидуального распространения и реакции на диссоциацию.Мониторинг их микроскопически в течение всей процедуры. Начните с prewarming 48-хорошо пластин при 37 градусов по Цельсию для пост электропорации посева, а затем подготовить базальные и органоидные культуры конкретных средах в соответствии с рукописными направлениями. Выращивайте пять колодцев органоидов на образец электропорации в пластине 48 скважин, подготовьте 230 микролитров диссоциативного реагента с 10-микромолярной Y-27632 на скважину.Мониторинг органоидов под микроскопом. Удалите культурную среду из колодцев и отмежевать органоиды механически в подготовленной диссоциации смеси. Бассейн пять скважин на образец электропорации в одну 15-миллилитровую трубку.Смешайте содержимое трубки путем вихрей и инкубировать его в течение пяти-15 минут при 37 градусах по Цельсию, пока не возникнут кластеры от 10 до 15 клеток, проверяя диссоциацию с помощью микроскопа. Остановите пищеварение, добавив до 10 миллилитров базальной среды без антибиотиков. Центрифуга трубки в 450 раз г в течение пяти минут, отказаться от супернатанта, и мыть клетки в два раза с четырьмя миллилитров электропорации буфера.Центрифуга и отказаться от супернатанта после каждой стирки. После мытья, resuspend органоидных гранул в 100 микролитров электропорации буфера с 30 микрограммов плазмидной ДНК. Вылейте полную ДНК-органоидную смесь в кюветт электропорации.Убедитесь в том, чтобы избежать пузырьков воздуха. Установите параметры электропорации, описанные в текстовой рукописи, и коснитесь кюветта пальцем, чтобы аккуратно перемешать клетки. Поместите кювет в камеру cuvette и нажмите кнопку опоясыватель на электропораторе, чтобы сделать заметку о значении неуступучих.Нажмите кнопку «Пуск», чтобы инициировать программу электропорации и контролировать значения отображаемых течений, напряжения и энергий. После электропорации, немедленно добавить 500 микролитров среды культуры без антибиотиков в клетки и перемешать путем пипетки вверх и вниз. Перенесите образец в новую 15-миллилитровую трубку и промойте кюветт базальной средой, чтобы собрать оставшиеся клетки, затем инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 40 минут.Центрифуга клетки на 450 раз г в течение пяти минут и отказаться от супернатанта. Resuspend гранулы в 100 микролитров подвал матрицы и семян 20-микролитер капель в предварительной 48-хорошо пластины. Инкубировать пластину в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия для полимеризации и добавить 250 микролитров культуры среды дополнены Y-27632 и CHIR99021 на колодец.Чтобы определить эффективность трансфекции, проверьте флуоресценцию в контроле трансфекции под микроскопом через 24-48 часов. Для анализа FACS, урожай клеток, как описано ранее и переварить в течение 10 до 20 минут, пока одиночные клетки присутствуют. Добавить до 10 миллилитров PBS и центрифуги клетки в 450 раз г в течение пяти минут, затем аспирировать и отказаться от супернатанта.Чтобы дискриминировать живые клетки, опорообразуйте гранулы в один миллилитр PBS и добавьте подходящее антитело или йодидный пропидий. Аккуратно смешайте клетки, постукивая и инкубировать их при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте. После инкубации вымойте клетки 10 миллилитров PBS, затем центрифугу и отбросьте супернатант.Перепройдите гранулы клетки в 200 микролитров PBS и фильтровать подвеску через 100-микрометровый ситечко в трубку FACS. Проанализируйте ячейки с помощью машины FACS, используя соответствующую стратегию гатинга и определите эффективность трансфекции. Органоиды четырех различных раковых образований были электропотезированы по крайней мере три раза с помощью 30 микрограммов небольшой плазмиды или большой плазмиды.Они были проанализированы с цитометрией потока через 48 часов после электропорации и закрыты для формы клеток, одиночных клеток, живых клеток и экспрессии eGFP. Во всех четырех органоидных образованиях небольшая плазмида была трансфицирована с более высокой эффективностью, чем большая. Наиболее эффективная трансфекция малой плазмиды была достигнута в органоидах PDAC с 92,1%GFP-положительными клетками, в то время как большая плазмида была трансфицирована с эффективностью 46,7%Большая плазмида была более эффективно трансфицирована в органоиды CRC со средним эффективностью 53,4%, в то время как небольшая плазмида была трансфицирована со всей эффективностью 84,3%Самая трудная сущность для трансфекта были органоиды рака желудка , которая продемонстрировала самую низкую эффективность трансфекции для обеих плазмидов.В качестве доказательства концепции, человека нормальный органоид желудка были электропотери с плазмидной кодирования для Cas9, GFP, и 2sgRNAs ориентации TP53. Клоны были выбраны администрацией Nutlin3, и нокаут TP53 был подтвержден секвенированием аллелей. Как мы показали с органоидами желудка человека, эффективная электропорация позволяет различные базовые манипуляции CRISPR Cas9 органоидных культур, таких как нокаут или стукины, так что различные заболевания могут быть смоделированы.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Генетическая инженерия нетрадиционный дрожжей по возобновляемым источникам биотоплива и биохимической производства

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Инженерной искусственных факторов в частности Манипулирование альтернативного сплайсинга в клетках человека

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Универсальный протокол для крупномасштабных gRNA библиотека производства из любого источника ДНК

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

Быстро Серебряный пятнать протокол позволяет простой и эффективного обнаружения ССР маркеры с помощью Non Денатурирующий гель полиакриламида

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Секвенирование нового поколения и биоинформатики трубопровода для оценки генетических детерминант конституционных болезни

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Изоляция, характеристика и микроРНК основе генетической модификации человека Стоматологическая фолликула стволовых клеток

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Генная инженерия сапротрофные discoideum клетки на основе выбора и роста бактерий

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Полупроводниковое секвенирование для предимплантационного генетического тестирования на анеуплоидию

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Оценка универсального вложенного обратного транскрипционного цепной реакции для обнаружения Лисовивирусов

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Рибонуклеопротеин-опосредовано Точное редактирование генов трубэлектрогенерации

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...