Name: universal and efficient electroporation protocol for genetic engineering of gastrointestinal organoids
Uploaded: 2020-02-18T13:30:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Universal and Efficient Electroporation Protocol for Genetic Engineering of Gastrointestinal Organoids at JoVE.com

Biz mükemmel teknik yardım için Juliane Fohgrub, Ann-Christin Meinecke ve Max Heiduk teşekkür ederiz. Finansman Deutsche Krebshilfe (No 111350 ve 70112925), Sander Stiftung (No 2014.104.1), Hector Stiftung (No M65.2) ve Avrupa Birliği (ERC No 639050) tarafından sağlanmıştır.

Etik onayı TU Dresden etik komitesinden (#EK451122014) alındı.
1. Elektroporasyon Öncesi Organoid Kültür ve Preparatlar
<ol><li>Daha önce açıklandığı gibi doku sindirim tarafından organoidler kurmak ve bir bodrum matris (genel bakış tablo 1 ve Malzeme Tablosubakınız)11,12,13,14,15,16,17ilgili varlık özel kültür ortamı ile genişletin . NOT: İnsan doku örnekleri için bilgilendirilmiş onay ve etik bir komite tarafından çalışmanın onayı gereklidir.</li>
	<li>Prewarm 48-iyi plakalar 37 °C post-elektroporasyon tohumlama için.</li>
	<li>10 μM Y-27632 ve 3 μM CHIR99021 dahil olmak üzere bazal orta w/o antibiyotiklerin yanı sıra varlığa özgü organoid kültür orta w/o antibiyotikleri (bkz. Tablo 1)hazırlayın. NOT: Antibiyotiklerin çekilmesi toksik etkileri azaltmak için önemlidir. Y-27632 ve CHIR99021 iyileştirici hücre kurtarma10.</li>
	<li>
Organoidlerin hazırlanması (Bkz. Şekil 1)<ol>
<li>Kültür ortamında elektroporasyon numunesi başına 48 kuyuluk bir tabakta 5 adet organoid yetiştirin. NOT: Proliferatif organoidler kullanılmalıdır (son bölünmeden yaklaşık 2-3 gün sonra).</li>
		<li>Kuyu başına 10 μM Y-27632 dahil olmak üzere 230 μL dissosiasyon reaktifi hazırlayın (bkz.</li>
		<li>Kültür ortamını her kuyudan çıkarın ve organoidleri hazırlanan ayrışma karışımının 230 μL'lik bir kısmını mekanik olarak ayrıştırın. Bir 15 mL tüp içine elektroporasyon numunebaşına havuz 5 kuyu.</li>
		<li>10-15 hücre kümeleri meydana gelene kadar 37 °C'de 5-15 dakika girdap ve kuluçka ile karıştırın. Bu nedenle, ayrışma mikroskopik kontrol edin. 10 mL'ye kadar bazal orta w/o antibiyotikler ekleyerek sindirimi durdurun. NOT: Bu adım çok önemlidir! Kuluçka çok kısa olduğunda elektroporasyon verimliliği azalacaktır, ancak uzun sindirim hayatta kalma yeteneğini azaltacaktır.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 5 dakika için 450 x g santrifüj, supernatant atın ve elektroporasyon tampon 4 mL ile iki kez yıkayın (Malzeme Tablosubakınız).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Elektroporasyon
NOT: Kare dalgalar ve ayrılmış poring ve transfer darbe dizileri yeteneğine sahip elektroporatörler için aşağıdaki protokol geliştirilmiştir (Bkz. Şekil 2). İsteğe bağlı olarak, empedans değerleri ve numuneye aktarılan gerilimler, akımlar ve enerjiler tekrarlanabilir deneyler için kontrol olarak ölçülebilir.
<ol><li>30 μg plazmid DNA içeren 100 μL elektroporasyon tamponunda (Bkz. Malzemeler Tablosu)organoid peleti yeniden askıya alın. NOT: Elektroporasyon işlemi sırasında optimum tuz konsantrasyonu için kullanılan plazmid DNA konsantrasyonu 5 μg/μL'yi aşmalıdır. Bu nedenle, vektörlerin hazırlanması için endofree plazmid maksi kitleri (Bkz. Malzeme Tablosu)tavsiye edilir. Toplam 45 μg'a kadar DNA miktarı sitotoksik etkiler olmadan kullanılabilir.</li>
	<li>Hava kabarcıkları üretmeden 2 mm boşluk genişliği ile bir elektroporasyon cuvette içine tam DNA-organoid karışımı dağıtın.</li>
	<li>Elektroporasyon parametrelerini Fujii ve ark.10'a göre ayarlayın (bkz. Tablo 2, Şekil 2).</li>
	<li>Bir parmak ile cuvette dokunarak köpük olmadan hücreleri hafifçe karıştırın. Cuvette'i cuvette odasına yerleştirin.</li>
	<li>Elektroporatörün Ω düğmesine basın ve empedans değerine dikkat edin. NOT: 30-40 Ω arasındaki empedans en iyi sonuçları gösterdi. Genel olarak, 30-55 Ω arasında olmalıdır. Bu durumda, lütfen aşağıdaki hususları kontrol edin: kullanılan cuvette'nin boşluk genişliği, elektroporatörün kablo bağlantıları, olası hava kabarcıkları, elektroporasyon karışımının doğru hacmi ve tuz konsantrasyonu.</li>
	<li>Elektroporasyon programını çalıştırmak ve görüntülenen akımların, gerilimlerin ve enerjilerin değerlerini kontrol etmek için Başlat düğmesine basın. NOT: Ölçülen gerilimlerin, akımların ve enerjilerin değerleri ayarlanan elektroporasyon parametrelerine karşılık gelir. Yinelenen denemelerin karşılaştırılması için bu verileri dikkate almak yararlı olabilir.</li>
	<li>Elektroporasyondan sonra, hemen 500 μL kültür orta w / o antibiyotik ekleyin (CHIR99021 ve Y-27632 ile; adım 1.3 bakınız). Beyaz köpük ayırmak için yukarı ve aşağı pipetleme tarafından karıştırın. NOT: Beyaz köpük elektroporasyon işleminden sonra ortaya çıkar ve ona çok sayıda hücre bağlanır. Bu yüzden, bunun dissosiyasyonu hücreleri kaybetmemek için çok önemlidir.</li>
	<li>Numuneyi tamamen cuvette'den elektroporasyon cuvettes'e ait pipetkullanarak yeni bir 15 mL boruya aktarın (bkz. Malzeme Tablosu). Kalan hücrelerin elde edilmesi için cuvette'nin tekrar bazal ortamla durulanması önerilir.</li>
	<li>Hücrelerin yenilenmesi için, oda sıcaklığında 40 dakika kuluçka.</li>
</ol>3. Hücrelerin Tohumlanması
<ol><li>Hücreleri 450 x g'de oda sıcaklığında 5 dk santrifüj edin ve süpernatantatın.</li>
	<li>100 μL'lik bodrum matrisinde peleti yeniden askıya alın ve önceden ısıtılmış 48 kuyulu bir plakada 20°L damla (bkz. adım 1.2). Polimerizasyon için 37 °C'de 10 dakika kuluçka ya da yetiştirilen organoidlerin bir sonraki bölünmesine kadar Y-27632 ve CHIR99021 ile desteklenen 250 μL kültür ortamı ekleyin (yaklaşık 5-7 gün).</li>
</ol>4. Transfeksiyon Etkinliğinin Belirlenmesi
NOT: Genel olarak, ek transfeksiyon kontrolü olarak floresan belirteci taşıyan bir vektörün elektroporate edilmesi önerilir. Seçilen marker ve kromofor olgunlaşmabağlı floresan yaklaşık içinde görünür olacak 24-48 h sonrası transfeksiyon18.
<ol><li>Transfeksiyon kontrolünde 24-48 h'den sonra floresan'ı mikroskobik olarak kontrol edin (Bkz. Şekil 4B).</li>
	<li>
Floresan aktif hücre taraması (FACS)
	<ol>
<li>Hasat hücreleri benzer adım 1.4.2-1.4.4 ve tek hücreler olana kadar 10-20 dakika civarında sindirmek. 10 mL'ye kadar fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 5 dakika 450 x g santrifüj ve supernatant atın.</li>
		<li>İsteğe bağlı olarak canlı hücrelerin ayrımcılığı için: Pelleti 1 mL'lik fosfat tamponlu salin (PBS) olarak yeniden askıya alın ve uygun bir antikor ekleyin (Bkz. Malzeme Tablosu)veya propidium iyodür (PI). Çok dikkatli bir şekilde sadece dokunarak ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka. 10 mL PBS ile yıkayın, santrifüj edin ve süpernatantatın.</li>
		<li>Hücre peletini 200 μL PBS'de yeniden askıya alın ve isteğe bağlı olarak süspansiyonu 100 μm'lik hücresüzden FACS tüpüne filtreleyin.</li>
		<li>Hücreleri uygun bir gating stratejisi kullanarak bir FACS makinesi ile analiz edin (Bkz. Şekil 3; Şekil 4A) ve transfeksiyon verimliliğini belirler.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Werner, K., Weitz, J., Stange, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+Model+Systems+for+Gastrointestinal+Diseases:+Tissue+Engineering+Meets+Genetic+Engineering.">Organoids as Model Systems for Gastrointestinal Diseases: Tissue Engineering Meets Genetic Engineering.</a> Current Pathobiology Reports. 4 (1), 1-9 (2016).</li><li>Olayanju, A., Jones, L., Greco, K., Goldring, C. E., Ansari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+porcine+gastrointestinal+organoid+units+as+a+potential+in+vitro+tool+for+drug+discovery+and+development.">Application of porcine gastrointestinal organoid units as a potential in vitro tool for drug discovery and development.</a> Journal of applied toxicology. 39 (1), 4-15 (2019).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+cancer+mutations+in+cultured+human+intestinal+stem+cells.">Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells.</a> Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).</li><li>Matano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+colorectal+cancer+using+CRISPR-Cas9-mediated+engineering+of+human+intestinal+organoids.">Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 21 (3), 256-262 (2015).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+CRISPR-modified+human+stem+cell+organoids+to+study+the+origin+of+mutational+signatures+in+cancer.">Use of CRISPR-modified human stem cell organoids to study the origin of mutational signatures in cancer.</a> Science. 358 (6360), 234-238 (2017).</li><li>Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+Effects+in+CRISPR/Cas9-mediated+Genome+Engineering.">Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering.</a> Molecular Therapy Nucleic Acids. 4, e264 (2015).</li><li>Tsong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cell+membranes.">Electroporation of cell membranes.</a> Biophysical journal. 60 (2), 297-306 (1991).</li><li>Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genetic+engineering+of+human+intestinal+organoids+using+electroporation.">Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection.">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Hennig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+Expression+Analysis+for+Subtyping+of+Human+Pancreatic+Cancer+Organoids.">CFTR Expression Analysis for Subtyping of Human Pancreatic Cancer Organoids.</a> Stem Cells Int. 2019, 1024614 (2019).</li><li>Seidlitz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gastric+cancer+modelling+using+organoids.">Human gastric cancer modelling using organoids.</a> Gut. 68 (2), 207-217 (2019).</li><li>Stepanenko, O. V., Verkhusha, V. V., Kuznetsova, I. M., Uversky, V. N., Turoverov, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+as+biomarkers+and+biosensors:+throwing+color+lights+on+molecular+and+cellular+processes.">Fluorescent proteins as biomarkers and biosensors: throwing color lights on molecular and cellular processes.</a> Current protein &amp; peptide science. 9 (4), 338-369 (2008).</li><li>Andersson-Rolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+paralogue+knockout+using+a+CRISPR-concatemer+in+mouse+small+intestinal+organoids.">Simultaneous paralogue knockout using a CRISPR-concatemer in mouse small intestinal organoids.</a> Dev Biol. 420 (2), 271-277 (2016).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8, 2281 (2013).</li><li>Merenda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Protocol+for+Multiple+Gene+Knockout+in+Mouse+Small+Intestinal+Organoids+Using+a+CRISPR-concatemer.">A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Lesueur, L. L., Mir, L. M., Andre, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+Specific+Toxicity+of+Large+Plasmids+Electrotransfer+in+Primary+Cells+In+Vitro.">Overcoming the Specific Toxicity of Large Plasmids Electrotransfer in Primary Cells In Vitro.</a> Molecular Therapy Nucleic Acids. 5, e291 (2016).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Darquet, A. M., Cameron, B., Wils, P., Scherman, D., Crouzet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+DNA+vehicle+for+nonviral+gene+delivery:+supercoiled+minicircle.">A new DNA vehicle for nonviral gene delivery: supercoiled minicircle.</a> Gene Therapy. 4 (12), 1341-1349 (1997).</li><li>Jacobi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+CRISPR+tools+for+efficient+genome+editing+and+streamlined+protocols+for+their+delivery+into+mammalian+cells+and+mouse+zygotes.">Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes.</a> Methods. 121-122, 16-28 (2017).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokol, farklı organoid varlıkların etkin, hızlı ve kolay elektroporasyon gerçekleştirmek için ayrıntılı talimatlar verir. PDAC, CRC, CCC ve GC'den sunulan tümör organoidlerine ek olarak, sağlıklı dokudan elde edilen organoidler için de başarılı bir şekilde çalışır. Protokol bir gün içinde gerçekleştirilebilir. Yayınlanan organoid transfeksiyon protokollerinde tüm prosedür dört gün boyunca iki gün boyunca farklı türde yetiştirme ortamı ile hazırlıklar10,21. Protokolümüzde özel bir ön tedavi gerekmez. Elektroporasyon öncesi elektroporasyon tamponu ile yıkanarak ortamın antibiyotik bileşenleri yıkanmış ve optimal empedans değerleri için tuzlu konsantrasyonlarda ayarlama sağlanmıştır. Yine de, bazı kritik yönleri başarılı bir elektroporasyon için düşünülmelidir:
Hücre Fujii ve ark.10 tarafından yapılan elektroporasyon protokolünde organoidleri tek hücrelere ayırmak ve 20 μm'lik hücre süzgecinden geçirmek önerilir. Elimizde tek hücrelere sindirim güçlü hücrelerin hayatta kalma azaltır. Merenda ve ark.21'deönerildiği gibi, organoidleri 10-15 hücrekümelerine ayırdık ve tek hücreli ayrışmaya göre verimin azaldığını belirleyemedik. Elektroporasyondan sonra, beyaz köpük ayrıştırmak için çok önemli bir adımdır, böylece hiçbir bağlı hücreler kayboluyor.
2B hücre kültürü için, 10 dakikadan 40 dakikaya kadar elektroporasyondan sonra bir rejenerasyon süresinin özellikle büyük plazmidlerin hayatta kalma ve transfeksiyon verimliliğini artırdığı gösterilmiştir22. Test deneylerinde, aynı organoidler için belgelenebilir, bu protokolde elektroporasyon dan sonra 40 dk kuluçka adım yol açan. Elektroporasyondan iyileşmeyi artırmak için, rho-ilişkili protein kigaz (ROCK) inhibitörü Y-27632 ile beş ila yedi gün23kültürlü. Benzer şekilde, glikojen synthase kiaz 3 ek takviyesi (GSK3) inhibitörü CHIR9902110kurtarmak için tek hücrelere yardımcı olmak içindir.
Ayarlar Kullanılan elektroporatörün avantajlarından biri, empedansın en uygun koşullarda elektroporasyondan önce ölçülebiliyor olmasıdır. Üreticiye göre empedans değerleri 30-55 Ω olmalıdır. Elimizde 30-40 Ω empedans değerleri optimum verimlilik göstermiştir. Bir ön deneyde, poring pulse'un farklı gerilimleri ve darbe uzunluk değerleri, hayatta kalmanın en uygun verim oranını bulmak için çeşitlidir. Özetle, burada açıklanan farklı varlıklarda Fujii ve ark.10'un açıklanan değerlerini doğrulayabiliriz.
Dna Farklı DNA miktarlarının etkisi, numune başına 45 μg'a kadar olan ön deneylerde test edildi. Sitotoksik etki saptayamadı. Doygunluk > 30 μg ile doza bağımlı bir şekilde transfeksiyon verimi artırıldı. Bu yüzden, son protokolde numune başına 30 μg kullandık, ama tabii ki artırılabilir (örn. paralel olarak daha fazla plazmidin elektroporasyonu için). Ayrıca, DNA'nın saflığı ve konsantrasyonu çok önemli görünüyor. 5 μg/μL'yi aşan bir konsantrasyon optimal transfeksiyon verimi göstermiştir.
Beklendiği gibi, 9.3 kB plazmid daha küçük 4.2 kB plazmid daha düşük bir verimlilik ile transfected olabilir (Şekil 4bakınız). 10 kB'den daha büyük plazmidlerin kullanımının verimliliği daha da azaltması bekleniyor. Gelecekteki uygulamalar için, bu gen taşıyıcıları onları daha küçük24kılan bir plazmid bakteriyel omurga sıyrık eksikliği beri, bir vektör olarak minicircle DNA test etmek ilginç olabilir. Bu gelişmiş bir transfeksiyon verimliliği neden olmalıdır. Ayrıca, organoidlerin CRISPR tabanlı manipülasyonlar için bir ribonükleoprotein olarak Cas9 bağlı sgRNA doğrudan elektroporasyon (RNP) kompleksi alternatif veya ek25olabilir.

Son yıllarda, yeni bir 3D hücre kültür sistemi, organoidler olarak adlandırdığı, çeşitli normal ve kanserli dokular için geliştirilmiştir. Organoidler fonksiyonel ve morfolojik olarak menşe dokularına çok yakındırlar. Onlar farklı türlerden oluşturulabilir, kolayca genişletilebilir, genomik kararlı ve genetik olarak değiştirilebilir, hangi onları genetik araştırmalar için ideal bir model sistemi yapar1,2,3. CRISPR (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar)/Cas9 sistemi gibi genetik mühendislik teknikleri çeşitli manipülasyonlara olanak sağlar. Klonların seçimi tanımlanmış medya koşulları ile gerçekleştirilebilir, örneğin, APC için WNT ligand çekilmesi (Adenomatozis Polypozis Coli) nakavt klonları4,5. Alternatif olarak, seçim işaretleri bir hedeflemevektörü homologyönettiği onarım tarafından tanıtılması gerekir 6,7. Genellikle birden fazla plazmid intülisi getirilmesi gerektiğinden, verimli bir transfeksiyon çok önemli bir parametre haline gelir. Ayrıca, belirsiz off-hedef etkilerini azaltmak için, Cas9 enonukleaz geçici bir ifade8arzu edilir .
Elektroporasyon DNA, RNA, proteinler veya diğer makromoleküller ile transfect hücreleri için nispeten basit bir yöntemdir. Elektrik darbeleri sayesinde, hücre zarı daha geçirilebilir hale gelir ve artan bir alım nedenolur 9. Kolon organoidlerinin daha önce yayınlanmış bir elektroporasyon protokolünde, dört günlük bir işlemle piggy-bac GFP (yeşil floresan protein) ile%30verimlilik (yeşil floresan protein) ekspresyonu (7.4 kB) sağlandı. Aşağıdaki protokol, tek kılavuz RNA (sgRNA) ve Cas9 ensonükleaz dizisi (örneğin 9.3 kb ile vektör olarak px458) için kodlayan büyük plazmidler ile kanserli veya sağlıklı organoidlerin verimli bir şekilde transfeksiyonunu kolaylaştırmak için geliştirilmiştir. Tüm elektroporasyon süreci bir gün içinde yapılabilir, özel elektroporasyon tamponlar olmadan, ve farklı gastrointestinal organoidler arasında en azından karşılaştırılabilir verimlilikile, yani pankreas duktal adenokarsinom (PDAC), kolorektal kanser (CRC), kolanjiokarsinom (CCC) ve mide kanseri (GC) organoidler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>For establishment and culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15] Gastrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9407-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6213.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1859330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hFGF-10</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>basement matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K300.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-Cystein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Conditioned medium produced from HEK293 cells (Hek293-mNoggin-Fc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human HGF</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>100-39H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Conditioned medium produced from HEK293 cells (HA-Rspo1-Fc-293T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27,480,294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604021</td>
			<td>Dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3A</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Conditioned medium produced from L-Wnt3a cells (from Sylvia Boj)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nepa Electroporation Cuvettes 2mm gap w/pipettes</td>
			<td>Nepa Gene Co., Ltd.</td>
			<td>EC-002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 15 ml</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 15 ml low binding</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30122208</td>
			<td>Tubes for FACS preparing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator Nepa21</td>
			<td>Nepa Gene Co., Ltd.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMAFD1000</td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>647800E6</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents and plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead fixable blue dead cell stain kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34962</td>
			<td>Includes antibody for live/dead staining for FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutlin-3</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1061/07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985047</td>
			<td>Electroporation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 gRNA concatemer vector</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>84879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-EGFP</td>
			<td>Nepa Gene Co., Ltd.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>px458 plasmid</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>48138</td>
			<td>coding for sgRNA and Cas9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>px458_Conc2 plasmid</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>134449</td>
			<td>px458 plasmid containing 2x U6 promotors for two different sgRNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA_hTP53_1a</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td><img src="/files/ftp_upload/60704/60704tomeq1.jpg" /></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA_hTP53_1b</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td><img src="/files/ftp_upload/60704/60704tomeq2.jpg" /></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA_hTP53_2a</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td><img src="/files/ftp_upload/60704/60704tomeq3.jpg" /></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA_hTP53_2b</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td><img src="/files/ftp_upload/60704/60704tomeq4.jpg" /></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

universal and efficient electroporation protocol for genetic engineering of gastrointestinal organoids

Elektroporasyon plazma zarının elektriksel permeabilizasyonu ile farklı moleküllerle transfeksiyon için yaygın bir yöntemdir. Son yıllarda birincil hasta materyali için bir kültür yöntemi olarak organoidlerin giderek artan kullanımı ile, bu 3D kültür sisteminde genetik mühendisliği için bileşenlerin verimli transfer yöntemleri ne zaman ihtiyaç vardır. Özellikle organoidler için, genetik manipülasyonların etkinliği başarılı bir transfeksiyona bağlıdır. Böylece bu protokol, organoidlerin elektroporasyonunu kolaylaştırmak ve farklı varlıklardaki evrensel işlevselliğini kanıtlamak için geliştirilmiştir. İnsan kolorektal, pankreas, hepatik ve mide kanseri organoidleri küçük ve büyük plazmidlerle başarılı bir şekilde elektroporated edildi. GFP kodlama vektörlerine dayanarak transfeksiyon verimliliği FACS tarafından belirlendi. Hücrelerin kapsamlı bir şekilde hazırlanması veya özel, maliyet yoğun elektroporasyon tamponları gerekli değildir ve protokol bir gün içinde gerçekleştirilebilir.

Dört farklı kanser varlığına ait organoidler (CRC, CCC, PDAC, GC) küçük bir plazmid (pCMV-EGFP, 4.2 kb) veya büyük bir plazmid (px458, 9.3 kb) kullanılarak en az 3 kez elektroporated edildi. Her iki vektör de akış sitometrisi ile elektroporasyondan sonra transfeksiyon veriminin 48 saat belirlenmesini sağlayan bir GFP kaseti taşır. Sadece canlı hücreleri analiz etmek için tarama yapıldı önce bir yaşam-ölüm antikor ile boyama. Gating stratejisi Şekil 3'tegösterilmiştir.
Dört organoid varlığın tümlerinde 4.2 kB büyüklüğünde plazmid, büyük olana göre daha yüksek verimlilikle transfekslendi (Bkz. Şekil 4). PDAC organoidlerinde küçük plazmidin en verimli transfeksiyonuna 92.1 ± 5.2 % GFP pozitif hücre li erişirken, büyük plazmid % 46.7 ± 3.7 verimlilikle transfeced edildi (ortalama ± standart sapma, n = 3). Pankreas kanseri organoidleri ile karşılaştırıldığında, daha büyük plazmid daha verimli 53.4 ± 11.7% ortalama verimlilik ile CRC organoidler içine transfekte edildi, küçük plazmid ise ortalama verimlilik ile transfected oldu 84.3 ± 5.8%. Transfect için en zor varlık gastrik kanser organoidleri vardı: hem büyük hem de küçük plazmid için, en düşük transfeksiyon verimliliği bu varlık (32.3 ± 12.7 % ve 74.1 ± 5.5% sırasıyla) ulaşıldı. CCC organoidleri küçük plazmid için ortalama transfeksiyon verimi % 83.0 ± 13.1, büyük plazmid için ise % 39.5 ± 10.4 olarak saptandı.
Kavram kanıtı olarak, insan normal mide organoidleri Cas9, GFP ve TP53hedefleyen iki sgRAs için px458_Conc2 plazmid kodlama ile elektroporated edildi. Ekson 8'deki Cas9 indüklenen çift ipliksi kırıkları homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) ile onarıldı, bu da çerçeve kayması ve dolayısıyla genin nakavtedilmesiyle sonuçlandı (bkz. Ek Şekil 1).
Tablo 1: Bazal ortam, sindirim karışımları ve yetiştirme ortamının bileşimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704_table1.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/60704/60704table2.jpg"> Tablo 2: Fujii ve ark.10'agöre elektroporasyon ayarları.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60704/60704fig1.jpg"> Şekil 1: Elektroporasyon hazırlama iş akışı. İlk olarak, organoidler 10-15 hücre kümeleri ayrıştırılmalı ve antibiyotikler yıkanmış olmalıdır. Elektroporasyondan sonra beyaz köpüğün ayrıştırılması gerekir. Hücreler oda sıcaklığında 40 dakika rejeneratif sonra tohumlu olabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60704/60704fig2b.jpg"> Şekil 2: İki aşamalı elektroporasyon. Yüksek gerilim li iki gözetleme darbesi kısa süreli (175 V ve 157,5 V, her biri 5 ms, 50 ms için duraklama, gerilim bozunumu%10) hücre zarlarında gözenekleri oluşumuna yol açar. Aşağıdaki transfer darbeleri DNA'yı hücrelere verir: beş pozitif transfer darbesi (20 V ile, 12 V, 7.2 V, 4.32 V ve 2.592 V, her biri 50 ms için, 50 ms için duraklatma, gerilim bozunumu %40), ardından beş polarite değişimli transfer darbeleri (20 V, 12 V, 7.2 V, 4.32 V ve 2.592 V, 50 ms için duraklama, gerilim bozunumu %40) takip eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704fig2blarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60704/60704fig3b.jpg"> Şekil 3: CCC organoidleri tarafından gösterilen temsili gating stratejisi. Tüm elektroporated organoidler elektroporasyon dan sonra akış sitometri 48 h ile analiz edildi. Plazmid DNA'sı olmadan elektroporated hücreler negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Kapılar şu şekilde belirlenmiştir: (A) hücre şekli için gating, (B,C) tek hücreler için gating (doublet ayrımcılık), (D) canlı hücreler için gating (apoptotik hücreler için bir antikor ile lekeli) ve (E,F) nihayet eGFP ifade hücreleri için gating (FITC kanalı). FSC = ileri dağılım; SSC = yan dağılım. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704fig3blarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60704/60704fig4.jpg"> Şekil 4: Dört organoid varlığın elektroporasyon verimliliği. (A) FACS analizi (n = 34, ortalama standart sapma ve her bir değer gösterilir) ve (B) floresan mikroskobu ile görsel karşılaştırma. Ölçek çubuğu = 1.000 μm. BF = parlak alan; CCC = kolanjiokarsinom; CRC = kolorektal kanser; GC = mide kanseri; PDAC = pankreas duktal adenokarsinom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/60704/60704suppfig1a.jpg"> Ek Şekil 1: Normal insan mide organoidlerinde TP53'ün örnek CRISPR/Cas9 tabanlı nakavtı. px458_Conc2 vektörü (bkz. Malzemeler Tablosu)2 gRNA concatemer vektörü, Bon-Kyoung Koo19'dancömert bir hediye olan px45820ile birleştirilerek klonlandı ve 2 sgRNA, Cas9 ve GFP için plazmid kodlaması yapıldı. TP53'ü hedefleyen iki sgRNA, altın kapı klonlama ile px458_Conc2 vektörde kullanılmaya başlandı (benzer şekilde Andersson-Rolf ve ark.19). 10 μg plazmid DNA'sı insan normal mide organoidlerinde elektroporated edildi(A). Klonlar Nutlin3 yönetimi tarafından seçildi (B) ve TP53 nakavt TOPO TA klonlama ve alellerin sıralama tarafından doğrulandı, burada örnek bir klon için gösterilen(C). SGRNA'lar referansta altı çizilidir. Ölçek çubuğu = 200 μm. BF = parlak alan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60704/60704suppfig1alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Universal and Efficient Electroporation Protocol for Genetic Engineering of Gastrointestinal Organoids at JoVE.com

Universal and Efficient Electroporation Protocol for Genetic Engineering of Gastrointestinal Organoids

Bu protokol, daha büyük plazmidlere sahip dört farklı gastrointestinal organoid varlığın transfeksiyonu için etkili bir elektroporasyon yöntemini açıklar (10 kB ölçüde). Bir gün içinde yapılabilir ve kapsamlı hazırlık veya özel, maliyet yoğun elektroporasyon tamponlar gerektirmez.

Gastrointestinal Organoidlerin Genetik Mühendisliği için Evrensel ve Etkili Elektroporasyon Protokolü

Electroporation is a common method for transfection with different kinds of molecules by electrical permeabilization of the plasma membrane. With the ...

Bu yöntem organoidler gibi 3D hücre kültürlerinin verimli transfeksiyon sağlar. Genetik mühendisliğinin çeşitli uygulamaları kolaylaşabilir. Protokol evrenseldir ve bir gün içinde gerçekleştirilebilir.Kapsamlı bir hazırlık veya özel, maliyet yoğun elektroporasyon tamponlar gerekmez. Bu transfeksiyon yöntemi tümör ve sağlıklı organoidlerde gösterilmiştir, ancak spheroidlere ve 2D hücre kültürüne de ayarlanabilir. Bu protokolü ilk kez gerçekleştiriyorsanız, organoidlerin bireysel çoğalması ve ayrışmaya tepkileri nedeniyle dikkatli bir şekilde ele alabilmesi önemlidir.Tüm işlem sırasında mikroskobik olarak izleyin. Elektroporasyon sonrası tohumlama için 37 derecede 48 kuyulu plakaları önceden ısıtarak başlayın, sonra el yazması yönlere göre bazal ve organoid kültüre özgü ortamlar hazırlayın. 48 kuyuluk bir plaka içinde elektroporasyon numunesi başına beş kuyu organoid yetiştirin, kuyu başına 10 mikromolar Y-27632 ile 230 mikrolitre dissosilasyon reaktifi hazırlayın.Organoidleri mikroskop altında izleyin. Kültür ortamını kuyulardan çıkarın ve organoidleri hazırlanan ayrışma karışımında mekanik olarak ayrıştırın. Bir 15 mililitrelik tüp içine elektroporasyon örnek başına havuz beş kuyu.10 ila 15 hücrekümeleri meydana gelene kadar, girdap ve 5 ila 15 dakika boyunca tüp içeriğini karıştırın mikroskop ile ayrışma kontrol. Antibiyotik olmadan bazal orta 10 mililitre kadar ekleyerek sindirim durdurun. Tüpü 450 kez g'de beş dakika santrifüj edin, süpernatant'ı atın ve hücreleri dört mililitre elektroporasyon tamponuyla iki kez yıkayın.Santrifüj ve her yıkamadan sonra supernatant atın. Yıkarsonra, 30 mikrogram plazmid DNA ile 100 mikrolitre elektroporasyon tamponunda organoid peleti yeniden askıya alın. Bir elektroporasyon cuvette içine tam DNA-organoid karışımı dağıtın.Hava kabarcıkları önlemek için emin olun. Metin el yazmasında açıklandığı gibi elektroporasyon parametrelerini ayarlayın ve hücreleri yavaşça karıştırmak için bir parmakla cuvette dokunun. Cuvette'i cuvette odasına yerleştirin ve empedans değerini not etmek için elektroporatörüzerindeki empedans düğmesine basın.Elektroporasyon programını başlatmak ve görüntülenen akımların, gerilimlerin ve enerjilerin değerlerini kontrol etmek için Başlat düğmesine basın. Elektroporasyondan sonra, hemen hücrelere antibiyotik olmadan kültür ortamı 500 mikrolitre ekleyin ve yukarı ve aşağı borulama tarafından karıştırın. Yeni bir 15 mililitrelik tüp içine örnek aktarın ve kalan hücreleri toplamak için bazal orta ile cuvette durulayın, sonra 40 dakika oda sıcaklığında hücreleri kuluçka.Hücreleri 450 kez g'de beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. 100 mikrolitre bodrum matrisinde peleti yeniden askıya alın ve önceden ısıtılmış 48 kuyuluk bir plakada 20 mikrolitrelik tohum damlası. Polimerizasyon için 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca plaka kuluçka ve iyi başına Y-27632 ve CHIR99021 ile takviye kültür orta 250 mikrolitre ekleyin.Transfeksiyon verimliliğini belirlemek için, 24 ila 48 saat sonra mikroskop altında transfeksiyon kontrolündefloresans kontrol edin. FACS analizi için, daha önce açıklandığı gibi hücreleri hasat ve tek hücreler mevcut olana kadar 10 ila 20 dakika sindirmek. 10 mililitreps PBS ekleyin ve beş dakika boyunca 450 kez g hücreleri santrifüj, sonra aspire ve supernatant atın.Canlı hücreler için ayrımcılık yapmak için, PBS bir mililitre pelet resuspend ve uygun bir antikor veya propidium iyodür ekleyin. Hücreleri dokunarak hafifçe karıştırın ve karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra hücreleri 10 mililitre PBS ile yıkayın, sonra santrifüj edin ve süpernatantı atın.Hücre peletini 200 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın ve süspansiyonu 100 mikrometrelik bir süzgeçten FACS tüpüne süzün. Hücreleri uygun gating stratejisini kullanarak bir FACS makinesi yle analiz edin ve transfeksiyon verimliliğini belirleyin. Dört farklı kanser varlığına ait organoidler, 30 mikrogram küçük plazmid veya büyük plazmid kullanılarak en az üç kez elektroporated edildi.Elektroporasyondan 48 saat sonra akış sitometrisi ile analiz edildiler ve hücre şekli, tek hücreler, canlı hücreler ve eGFP ekspresyonu için geçitli olarak ele geçirildiler. Dört organoid varlıkta da küçük plazmid büyük olandan daha yüksek verimlilikle transfekte direnilmiştir. PDAC organoidlerinde %92.1 GFP pozitif hücrelerile küçük plazmidin en verimli transfeksiyonuna ulaşıldı, büyük plazmid %46.7 verimlilikle transpereste iken büyük plazmid ortalama verim %53.4 ile CRC organoidlerine daha verimli bir şekilde aktarıldı, küçük plazmid ortalama verimlilik le transfeced edildi 84.3%Transfect için en zor varlık mide kanseri organoidleri vardı , her iki plazmid için en düşük transfeksiyon verimliliği gösterdi.Konseptin kanıtı olarak, insan normal mide organoidleri Cas9, GFP ve TP53'ü hedefleyen 2sgRAs için plazmid kodlaması ile elektroporated edildi. Klonlar Nutlin3 yönetimi tarafından seçildi ve TP53 nakavt alel lerinin sıralanması ile doğrulandı. İnsan mide organoidlerinde de gösterdiğimiz gibi, etkili elektroporasyon, farklı hastalıkların modellenebilmesi için organoid kültürlerin nakavt veya knockin gibi çeşitli CRISPR Cas9 baz manipülasyonlarına olanak sağlar.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Yenilenebilir Biyoyakıt ve Biyokimyasal Üretim için bir Sıradışı Maya Genetik Mühendisliği

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Yapay Faktörler Mühendislik Özellikle İnsan Hücreleri alternatif bağlantı işleyin için

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Büyük ölçekli gRNA Kütüphane üretim herhangi bir DNA kaynaktan için evrensel bir iletişim kuralı

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

Bir hızlı gümüş boyama Protokolü etkinleştirme basit ve SSR bir sigara denaturing Polyacrylamide jel kullanarak işaretleri, verimli algılama

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Hedef yeni nesil sıralama ve Biyoinformatik boru hattı anayasal hastalığı genetik belirleyicileri değerlendirmek için

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Yalıtım, karakterizasyonu ve insan diş kökü kök hücrelerin genetik değişiklik mikroRNA tabanlı

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetik Mühendisliği hücreleri Dictyostelium discoideum alan seçimi ve bakteri büyüme

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Aneuploidi için Preimplantasyon Genetik Test için Yarı iletken Sıralama

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Lyssaviruses tespiti için evrensel Iç Içe Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu değerlendirilmesi

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-boru Elektroporasyon tarafından aracılı hassas gen düzenleme

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...