Name: single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids
Uploaded: 2020-06-05T12:30:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids at JoVE.com

我们非常感谢墨西哥公主儿科肿瘤中心的技术支持，以及哈布雷希特研究所和蔡司的成像支持和合作。所有成像工作都在莫西玛公主成像中心进行。这项工作得到了莫西玛公主儿科肿瘤中心的财政支持。JFD得到了玛丽居里全球研究金和荷兰科学研究组织（NWO）的一笔维尼赠款的支持。ACR得到了欧洲理事会（ERC）启动赠款的支持。

使用小鼠衍生的有机体符合监管标准，并经沃尔特和伊丽莎·霍尔研究所（WEHI）动物伦理委员会批准。所有人体器官样本都是通过Hubrecht有机物技术（HUB，www.hub4organoids.nl）从生物库中采集的。UMC Utrecht （METC UMCU） 医学伦理委员会应 HUB 的请求获得授权，以确保遵守《荷兰涉及人类主体的医学研究法》，并在适当时获得捐赠者的知情同意。
1. 试剂制备
<ol><li>为了在水浴中将4%（w/v）的甲状甲醛（PFA）加热400 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）至60°C以下。加入20克PFA粉末，使用搅拌器溶解。<ol>
<li>接下来，添加几滴 10 M NaOH。让冰上冷却，并添加几滴 10 M HCl，将 pH 调整到 7.4。用 PBS 至 500 mL 和等分（在 -20°C 下储存长达 2 个月）。 注：请勿加热至60°C以上，以免PFA降解。准备时间 = 4 小时。</li>
	</ol>
</li>
	<li>要使用 Tween-20 （PBT） （0.1% v/v） 准备 PBS，请添加 1 mL 的 Tween-20 至 1 L 的 PBS（在 4 °C 下储存长达 4 周）。 注：准备时间 = 10 分钟。</li>
	<li>要准备 100 mL 的 0.5 M 乙酰乙酸 （EDTA），添加 18.6 g 的 EDTA 和 2.5 g 的 NaOH 至 80 mL 的 dH2O. 调整 pH 到 8 与 1 M NaOH，并填充到 100 mL 与 dH2O.</li>
	<li>要准备 500 mL 的 1 M Tris，将 60.55 g Tris 溶解，浓度为 42 mL（36~38%）HCl 在 300 mL 的 dH2O. 调整 pH 到 8 和填充到 500 mL.</li>
	<li>为了准备有机体洗涤缓冲液（OWB），加入1 mL的Triton X-100，2mL的10%（w/v）SDS和2克牛血清白蛋白（BSA）至1L的PBS（储存在4°C至2周）。 注：准备时间 = 10 分钟。</li>
	<li>要使 220 mL 的 FUNGI，混合 110 mL 的甘油与 20 mL 的 dH2O、2.2 mL 的 Tris 缓冲液 （1 M， pH 8.0） 和 440 μL 的 EDTA （0.5 M）。加入50克果糖，在黑暗中室温（RT）混合，直到溶解。当清除时，加入49克果糖并混合至溶解。然后加入33.1克尿素并混合至溶解（在黑暗中储存在4°C）。 注：不要加热果糖焦糖在更高的温度下。FUNGI 由 50% （v/v） 甘油、9.4% （v/v） dH2O、10.6 mM 三叶基、1.1 mM EDTA、2.5 M 果糖和 2.5 M 尿素组成。准备时间 = 1 天。</li>
	<li>为了准备PBS-BSA（1%w/v），在100 mL的PBS中溶解1克BSA（储存在4°C至2周）。 注：准备时间 = 10 分钟。</li>
</ol>2. 有机体恢复
注：以下步骤适用于在24孔板中培养的在24孔板中培养的在地下膜提取物（BME）中生长的器官，其尺寸为100~500μm。
<ol><li>吸培养培养，用冰冷的PBS洗1倍。避免破坏 3D 矩阵。</li>
	<li>将板放在冰上，在每井中加入1 mL的冰冷细胞回收溶液（材料表）。在水平摇床（40 rpm）上，在4°C下孵育30~60分钟。 注：3D 矩阵液滴应完全溶解。</li>
	<li>在 1% PBS-BSA 中浸渍，上下移液 2 倍，将 1 mL 移液器尖端涂覆在 BSA 上。这种涂层将防止器官粘在尖端。要涂覆 15 mL 圆锥管的内侧，请填充 5 mL 的 1% PBS-BSA，反转 2~3 倍并丢弃 PBS-BSA。 注：在固定之前，所有塑料耗材都有必要涂装（步骤 3.3）。</li>
	<li>使用涂层尖端，轻轻重新暂停井的含量 5~10 倍，然后将管状物转移到涂层的 15 mL 管上。不同具有相同标识的井中的有机体可以汇集到同一管中。</li>
	<li>在每个培养中加入1 mL的冰冷1%PBS-BSA，以冲洗和收集所有器官。</li>
	<li>将冷 PBS 添加到 10 mL，在 70 x g 和 4 °C 下旋转 3 分钟 ，获得没有可见层 3D 矩阵的紧密颗粒。小心地取出上一液。</li>
</ol>3. 固定和阻塞
<ol><li>使用涂层的 1 mL 尖端小心地将有机体重新在 1 mL 的冷 PFA 中。</li>
	<li>在 4 °C 下固定 45 分钟。使用涂布的 1 mL 尖端在固定时间进行到固定时间的中途轻轻重新暂停器官，以确保所有器官之间的均匀固定。</li>
	<li>将10 mL的冰冷PBT加入管子，轻轻混合，通过倒置管，孵育10分钟，在 70xg下旋转，均在4°C。 注：从这一步开始，通常不需要涂覆尖端，因为大多数器官类型在固定后不粘在尖端上。然而，一些有机体可能需要涂层塑料，即使在固定后。</li>
	<li>通过将颗粒重新悬浮在冰冷的 OWB 中（每井至少 200 μL OWB）中，将器官转移到 24 井悬浮板中，阻断器官。 注：一个大颗粒中的有机体可以分裂到多个孔上，以进行不同的染色。</li>
	<li>在4°C下孵育至少15分钟。</li>
</ol>4. 免疫标记
<ol><li>流水器200μL的OWB在空井作为参考井。 注：免疫标记也可以在48或96孔板中进行，以减少抗体的使用。但是，用户应该知道，由于体积较小，染色和洗涤性能可能会降低。</li>
	<li>让器官在板的底部沉淀。 注：这可以使用立体显微镜检查，并且通过使用深色背景更容易。</li>
	<li>倾斜板 45°，并删除 OWB 离开有机体在 200 μL 的 OWB（使用参考井估计 200 μL）。</li>
	<li>加入200μL的OWB，原抗体2x浓缩（例如，E-卡德林[1：400]和Ki67[1：200]，结果 图1;角蛋白5[1：500]， 角蛋白 8/18 [1：200]，MRP2 [1：50]，和 Ki67 [1：200]，用于图 2中的结果，并在 4 °C 下孵育过夜，同时轻微摇晃/摇动（水平摇床上 40 rpm）。</li>
	<li>第二天，添加 1 mL 的 OWB。</li>
	<li>让器官在板底沉淀3分钟。拆下 OWB，将 200 μL 留在板中。加入 1 mL 的 OWB，用轻微的摇动/摇动洗涤 2 小时。</li>
	<li>再重复步骤 4.6 两次。</li>
	<li>让器官在板底沉淀3分钟。拆下 OWB，在井中留下 200 μL。</li>
	<li>加入200μL的OWB与二级抗体，结合抗体和染料2倍浓缩（例如，DAPI [1：1000]，大鼠AF488 [1：500]，小鼠-AF555 [1：500]，phaloidin-AF647 [1：100]， 用于图1的结果;DAPI [1：1000]，大鼠-AF488 [1：500]，兔子-AF555 [1：500]，鼠标-AF555 [1：500]，phaloidin-AF647 [1：100]， 图2的结果;DAPI [1：1000]，phoidin-AF647 [1：100]，用于图 3的结果，并在4°C下孵育过夜，同时轻微摇晃/摇晃。</li>
	<li>第二天，重复步骤 4.5=4.7。</li>
	<li>将器官转移到1.5 mL管中，以70 x g向下 旋转3分钟。</li>
</ol>5. 有机体光学清除
<ol><li>在不干扰器官的情况下，通过移液尽可能去除 OWB。</li>
	<li>使用端切口和轻轻重新暂停的 200 μL 尖端添加 FUnGI（至少 50 μL，RT）。在 RT 孵育 20 分钟。 注：FUnGI的光学清除可能导致轻微的组织收缩。这不会影响单层和多层器官的一般形态;然而，球形单层器官与大流明可能会崩溃。协议可以在这里暂停，样品可以储存在4°C（至少1周）或-20°C（至少6个月）。</li>
</ol>6. 共声成像的幻灯片准备
<ol><li>准备一个10毫升注射器与硅胶密封剂（材料表）。连接 200 μL 尖端并切断端，以便按下注射器后，粘性硅胶的温和流动。使用注射器在幻灯片中间绘制 1 厘米 x 2 厘米的矩形。</li>
	<li>切断 200 μL 尖端的端，将 FUNGI 中的器官转移到矩形的中间。</li>
	<li>将盖玻片放在顶部。为了最大限度地减少捕获的气泡，请先将盖玻片的左侧放置，然后从左到右缓慢降低盖玻片，直到没有被困空气，然后松开盖玻片。 注：与器官大小相当的分位器可用于防止其受损。</li>
	<li>轻轻对盖玻片的所有边缘施加压力，将其牢固地连接到硅胶密封剂上。幻灯片现已准备好进行映像。 注：协议可以在这里暂停，样品可以储存在4°C（至少1周）或-20°C（至少6个月）。</li>
</ol>7. 图像采集和处理
<ol><li>使用共声激光扫描显微镜（材料表），用多浸入式25倍或油浸40倍的镜面对幻灯片进行成像。<ol>
<li>对 25 倍目标使用以下采集设置：扫描模式帧、帧大小 1024 x 1024、体母体尺寸 332 nm x 332 nm x 1.2 μm、像素停留时间 <2 μs、双向扫描、平均数 1、位深度 8。要减少光漂白，请使用低激光功率（一般为<5%，弱染色为<10%）。</li>
		<li>使用 Z 堆栈模式定义下限和上限，并设置 Z 步进大小为最佳。当一起成像大型器官结构或多个器官时，使用10%重叠的平铺模式，并指示感兴趣的区域。 注：使用这些设置，直径为 <300 μm 的典型器官的数据大小为 <1 GB。</li>
	</ol>
</li>
	<li>对于切片扫描数据集，将图像文件与显微镜（材料表）一起拼接在软件中。在处理部分中， 选择拼接 作为方法，在参数 下选择 "新输出"，然后选择要缝合的文件。按 "应用 "开始缝合。</li>
	<li>在成像软件（材质表） 的3D视图选项卡下获取图像的3D 渲染表示，然后优化亮度、对比度和3D渲染属性。将结果的 RGB 快照导出为 TIFF 文件。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snapshot:+Growing+Organoids+from+Stem+Cells.">Snapshot: Growing Organoids from Stem Cells.</a> Cell. 161 (7), 1700 (2015).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Bartfeld, S., Stem Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment.">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Dekkers, J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+methods:+An+overview+of+the+techniques+used+for+the+imaging+of+3D+spheroids.">Optical clearing methods: An overview of the techniques used for the imaging of 3D spheroids.</a> Biotechnology and Bioengineering. 116 (10), 2742-2763 (2019).</li><li>Masselink, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+applicability+of+a+streamlined+ethyl+cinnamate-based+clearing+procedure.">Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure.</a> Development. 146, 166884 (2019).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

在这里，我们提出了一个详细的协议，为完整的器官的三：0成像与单细胞分辨率。要成功执行此协议，必须执行一些关键步骤。在本节中，我们将重点介绍这些步骤并提供故障排除。
第一个关键步骤是删除 3D 矩阵。大多数器官在体外传播，使用模仿体内细胞外环境的基质来增强极化三极化结构的形成。在 3D 矩阵内固定和后续染色是可能的，但不利于抗体的渗透，或可能生成高背景信号（未显示数据）。有效去除基质可受基质类型、器官数量和大小以及长期培养的影响。因此，对于不同的区域性条件可能需要优化。对于在Matrigel或BME培养的有机体，在冰冷的细胞恢复溶液中30-60分钟的步骤足以溶解基质而不损害器官。此外，去除支持性3D基质可能导致原生结构丧失，并破坏与其他细胞类型的器官接触，例如，当器官与成纤维细胞或免疫细胞共同培养时。此外，最佳的有机体固定对于保持三生组织结构、蛋白质抗原性和最小化自身荧光至关重要。在 4 °C 下用 4% PFA 固定 45 分钟通常足以标记各种有机体和抗原。然而，更长的固定步骤，高达4小时，通常更适用于表达荧光报告器蛋白的器官，但需要优化不同的荧光团。短于 20 分钟的固定时间不足以使用 phaloidin 探头正确标记 F-actin。另一个常见的问题是在协议期间器官的丧失。因此，在处理未固定器官时，必须（i） 小心地涂上 1% BSA-PBS 的移液管和管，以防止它们粘附在塑料上;（ii） 使用低粘附或悬浮板避免样品粘附在板材上;（iii） 留出足够的时间让有机体在板底沉淀，然后小心地取出缓冲液。移液粘性 FUnGI 可能会引入气泡。在RT下处理清除样品可降低粘度，提高易用性，从而最大限度地减少有机体损失。虽然大多数器官易于处理，但流明扩大的囊性器官在用 4% PFA 固定或使用 FUnGI 清除时有很高的折叠倾向。通过使用不同的固定（例如，甲醛或PFA-谷氨酰胺），可以减少，但不能完全防止这种效果。然而，这可能影响自荧光、抗体渗透和表位可用性。当囊性器官在清除后出现折叠时，建议通过多光子显微镜跳过清除步骤和图像，因为光散射较少。最后，获得整个3D结构的器官可能具有挑战性，并要求最小距离之间的盖玻片和器官。此外，当器官有空间移动其安装剂时，这可能会导致 X 和 Y 移位，同时在 Z 深度中记录数据。在滑动准备过程中使用较少的硅胶密封剂可以解决盖玻片和显微镜滑动之间的不理想安装问题。然而，硅胶太少可能会导致器官压缩和失去其固有的3D结构。FUnGI 由于其较高的粘度，提高了在成像过程中对滑动安装的处理和器官的稳定性。
虽然此协议可用于广泛的应用，以深入研究细胞内容和完整器官的 3D 架构，但应考虑某些限制。这种方法相当低吞吐量和耗时。事实上，用户应记住，在 3D 中成像大型完整器官需要 Z 中的平铺和样品采集，从而延长采集时间。通过使用显微镜资产（包括共振器或旋转磁盘扫描仪）或光片显微镜技术26，可以更快地成像。另一个考虑是，标记可以在同一样本的不同器官之间异构地表达。因此，应获取多种器官，以更好地捕捉培养中的这种器官异质性。最后，虽然完整的湿实验室程序非常简单，但数据后处理需要图像分析软件中的三维可视化和定量技能，以及挖掘数据集中所有信息的统计数据。
近十年来，由于光学结算剂的种类繁多，以及显微镜和计算技术的改进，卷,30,成像领域有了很大的进步。虽然在过去，大多数研究集中在器官或相关肿瘤的大体积成像，最近的方法更小，更脆弱的组织，包括器官结构，已经开发了36，37，38。,37,38我们最近发布了一种简单而快速的方法来成像各种来源、大小和形状的全安装器官，用于后续的3D渲染和图像分析26，我们在此介绍了一些改进（例如FUNGI，硅胶安装），并附带了视频协议。该方法优于传统的二维截面成像，用于破译复杂的细胞形态和组织结构（图2），并且易于在实验室中采用共和显微镜进行。通过稍微适应协议，样品可以兼容，超分辨率共声、多光子以及光片成像，使该协议广泛适用，为用户提供了一个强大的工具，以更好地理解可与器官建模的多维复杂性。

新文化方法的进步，如器官技术，使器官文化在一盘1。有机体生长成三维（3D）结构，在保留表型和功能特征时重新标记其原发组织。器官现在有助于解决基本生物学问题2，建模疾病，包括癌症3，并制定个性化的治疗策略4，5，6，7。5,6,74自第一个从肠道成人干细胞8中提取器官生成器官的协议以来，器官技术已扩展至包括从器官衍生的多种健康和癌,组织，包括前列腺9、脑10、肝脏11、12、,12胃13、乳房14、15、内膜16、唾14液腺17、味蕾18、胰腺19和肾脏20。15
器官的发展与新的体积显微镜技术的兴起一样，这种技术可以在3D21、22、23、24,22,23中可视化整个坐骑组织的建筑。3D成像优于传统的二D组织截面成像，使生物标本的复杂组织可视化。3D 信息对于理解细胞组成、细胞形状、细胞命运决定和完整生物样本的细胞-细胞相互作用至关重要。无损光学分段技术，如共声或多光子激光扫描显微镜（CLSM 和MLSM）和光片荧光显微镜（LSFM），现在能够在单个生物标本中实现精细细节和一般组织结构的组合可视化。这种强大的成像方法提供了研究结构复杂性的机会，这些结构可以使用有机体25进行建模，并绘制构成这些3D结构的所有单个细胞的空间分布、表型标识和细胞状态图。
最近，我们发布了一个详细的协议，高分辨率3D成像固定和清除器官26。该协议是专门设计和优化处理微妙的有机体结构，而不是方法的大型完整的组织，如迪斯科27，28，CUBIC29，30，31，29,30,和CU清27,2832，33。32,33因此，此方法通常适用于来源、大小、形状和细胞含量不同的各种器官。此外，与其他通常需要大量时间和精力的体积成像协议相比，我们的协议要求不高，可以在 3 天内完成。我们应用了3D成像方案，以可视化新开发的器官系统从各种组织，包括人类气道34，肾脏20，肝脏11，和人类乳腺癌器官15的架构和细胞组成。结合多色荧光系追踪，该方法还用于揭示小鼠乳腺器官14中基底细胞的生物能力。
在这里，我们通过引入无毒清算剂FUNGI35来完善协议。FUnGI 清除在单个孵化步骤中实现，由于其粘度而更易于安装，并在储存过程中更好地保持荧光。此外，我们引入硫酸钠 （SDS） 到洗涤缓冲液中，以增强核染色，以及硅胶基安装方法，便于在显微镜前进行滑动准备。 图 1 提供了协议的图形概述 （图 1A）和 3D 图像器官的示例 （图 1B+D）.简而言之，器官从其 3D 矩阵中恢复，固定和免疫标记，光学清除，使用共和显微镜进行成像，然后用可视化软件进行 3D 渲染。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:773px;" width="772">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">1.5 ml safe-lock centrifuge tubes</td>
			<td style="width:101px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">EP0030 120.094</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">2 ml safe-lock centrifuge tubes</td>
			<td style="width:101px;">Eppendorf</td>
			<td>EP0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Cell recovery solution</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:101px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">LSM880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Confocal microscope software ZEN</td>
			<td style="width:101px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">ZEN black/blue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Conical tubes 15 ml</td>
			<td style="width:101px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Coverglass #1.5 24x60mm</td>
			<td style="width:101px;">Menzel-Glazer</td>
			<td style="width:119px;">G418-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Coverglass #1.5 48x60mm</td>
			<td style="width:101px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:119px;">G425-4860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">DAPI</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">D3571</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Dissection Stereomicroscope</td>
			<td style="width:101px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M205 FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Double sided sticky tape 12,7 mm 6,35 m</td>
			<td style="width:101px;">Scotch 3M</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-bufferd Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14190144</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">EDTA</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td>15576-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Focus Clear</td>
			<td style="width:101px;">CelExplorer</td>
			<td style="width:119px;">FC-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Fructose</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Glycerol</td>
			<td style="width:101px;">Boom</td>
			<td style="width:119px;">76050771.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Graduated Transfer Pipets</td>
			<td style="width:101px;">Samco</td>
			<td style="width:119px;">222-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Horizontal shaker</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">444-2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td style="width:101px;">Ajax Firechem.</td>
			<td style="width:119px;">265.2.5L-PL</td>
			<td>10M stock solution, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Imaris software</td>
			<td style="width:101px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Microscope slides Superfrost</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">10143352</td>
			<td>ground edge, 90 degrees 26 mm~76 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148-500g</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Phalloidin Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A22287</td>
			<td>dilution 1:100-200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">E-cadherin</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">13-1900</td>
			<td>dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Ki-67</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">B56</td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Keratin 5</td>
			<td style="width:101px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">905501</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:303px;">Keratin 8/18</td>
			<td style="width:101px;">DSHB (University of Iowa)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">MRP2</td>
			<td style="width:101px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab3373</td>
			<td>dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Secondary Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-21208</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Secondary Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 555</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-31570</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Secondary Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 555</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-31572</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Silicone Sealant</td>
			<td style="width:101px;">Griffon</td>
			<td style="width:119px;">S-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right">28312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Sodium Hydroxide (NaOH) pellets</td>
			<td style="width:101px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">567530</td>
			<td>10 M stock solution, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Suspension cell culture plates</td>
			<td style="width:101px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">662102</td>
			<td>24-well</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Tris</td>
			<td style="width:101px;">Fisher Scientific</td>
			<td>11486631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T8532</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Tween-20</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">UltraPure Low Melting Point (LMP) Agarose</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Urea</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Workstation</td>
			<td style="width:101px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids

器官技术，在体外3D培养微型组织，开辟了一个新的实验窗口的细胞过程，控制器官的发展和功能以及疾病。 荧光显微镜在详细描述其细胞组成特征和证明其与来自的组织相似方面发挥了重要作用。本文提出了免疫荧光标记下全器官高分辨率三D成像的综合方案。该方法在来源、大小和形状上对器官的成像有广泛的应用。到目前为止，我们已将该方法应用于来自健康人体组织的气道、结肠、肾脏和肝脏器官，以及人类乳腺肿瘤器官和小鼠乳腺器官。我们使用光学清除剂FUnGI，它能够获取整个3D器官，并有机会对标记进行单细胞定量。从器官采集到图像分析的三天协议针对使用共和显微镜的 3D 成像进行了优化。

3D 成像器官能够非常详细地可视化架构、细胞组成以及细胞内过程。提出的技术要求不高，大概可以应用于各种器官或宿主物种衍生的器官系统。
3D成像与2D成像相比的强度，用最近出版的方法14生成的小鼠乳腺器官的图像来说明。这些器官的中心层由柱状K8/K18阳性发光细胞组成，外层包含拉长的K5柱状基底细胞（图2A），它重述了体内乳腺的形态。这个极化组织很难从同一器官的2D光学部分来欣赏（图2B，中间面板）。没有3D信息无法解释的复杂结构的另一个例子是 MRP2 阳性运河网络，它有助于收集人类肝脏器官的胆汁液11（图 2B）。这说明了我们的方法如何允许对器官的基本结构特征进行可视化。此外，获得的质量和分辨率允许半自动分段和图像分析。因此，在全器官的特定细胞亚型中，可以量化细胞总数的数量和标记的存在。我们通过分割包含140个细胞的整个器官的核来说明这一点，其中3个细胞对Ki67细胞周期标记表现出高的积极性（图2C）。DAPI 通道被选为源通道，并且根据强度阈值步和 10 μm 的球体直径生成段。接触对象按从种子点生长的区域进行分割。最后，应用 10 个体素的大小滤波器来去除小噪声诱导段。对于表示原子核的每个段，然后导出 Ki67 通道的均值强度以进行绘图。
我们最近开发了光学清除剂FUnGI35，现在我们集成到这个协议中，以改进器官的透明度。FUnGI 易于使用，因为免疫荧光染色后，通过单一孵化步骤很容易实现结算。该剂的另一个优点是粘度，这使得在滑动安装过程中更容易进行样品处理。FUnGI 中的荧光样品即使在 -20 °C 下储存数月时也保留其荧光。 我们证明，FUnGI在细胞体深处的荧光信号质量中优于未清除和果糖甘油（图3A，B），并且与未清除的器官相比，真菌清除的有机体具有整体增强的荧光强度（图3C）。
总之，我们描述了一种不需要要求、可重复的三D成像技术，用于获取免疫标记器官的体积数据。该协议可以很容易地用于从健康和疾病模型成像各种器官，包括小鼠和人类起源的器官。简单的样品制备可以适应，以方便共生、多光子和光片荧光显微镜，以获得整个器官的细胞到亚细胞分辨率。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60709/60709fig1.jpg"> 图1：高分辨率3D成像协议的示意图概述。 器官从3D矩阵中恢复。在使用抗体和染料进行免疫标记之前，进行固定和阻断。使用 FUnGI 清算代理在单个步骤中实现光学清除。可以使用成像软件执行图像的 3D 渲染。（A） 程序的示意图概述。（B） 清除为F-actin和E-cadherin（E-cad）（25倍油目标）标记的人类结肠器官免疫标签的整个安装3D共生图像。比例线 = 40 μm。（C） 清除全安装 3D 共体图像。比例线 = 20 μm。（D） 人类结肠器官免疫标记的扩大光学部分，用于F-actin、E-cadherin（E-cad）和Ki67（25x油目标）。比例线 = 5 μm。这个数字已经修改了从戴克斯等人26。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60709/60709fig1large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60709/60709fig2.jpg"> 图 2：体积成像可视化复杂的 3D 架构。 表示全安装 3D 数据集（左面板）、2D 光学截面（中间面板）和放大区域（右面板）的 3D 区域的共生图像。（A） 一种从小鼠乳腺的单基底细胞中提取的器官，说明围绕发光细胞的拉长乳腺基底细胞的3D组织，或标有K8/18、K5和F-actin（果糖-甘油清除;25倍油目标）。比例杆表示 55 μm（左面板）和 40 μm（中间和右侧面板）。（B） 具有复杂的 MRP2 阳性管状细胞的人类胎儿肝脏器官，标有 DAPI、MRP2 和 F-actin（果糖-甘油清除;40 倍油目标）。比例线表示 25 μm（左面板）和 8 μm（中间和右侧面板）。（C） 使用成像软件（中间面板）标记的人类胎儿肝脏器官的三维全安装图像和 DAPI 通道上的分段图像。比例线 = 15 μm。绘制的图形表示整个器官（140个细胞）（右面板）的所有细胞（DAPI分段）的Ki67平均强度。这个数字已经修改了从戴克斯等人26。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60709/60709fig2large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60709/60709fig3.jpg"> 图3：使用FUNGI对器官进行光学清除。（A） 标有F-actin（绿色）和DAPI（灰色）且图像无清除、果糖甘油清除或FUnGI（25倍油目标）清除的人类结肠器官的代表性图像。左面板：风琴的3D渲染。右面板：150 μm深度的器官光学部分。对于"无清除"条件，图像的亮度必须增加，而与"果糖-甘油"和"FUNGI"条件相比，图像的亮度必须增加，以可视化器官。比例线 = 50 μm。（B） 非线性回归拟合显示不同光学清除方法的Z深度增加，显示DAPI强度的降低。值表示DAPI分段检测到的单个细胞的强度，并正常化到器官前50μm的平均DAPI强度。为了避免低估较深边缘和更亮的细胞和萌芽结构造成的衰减，仅对器官的中心区域进行了分析。（C） 使用相同的显微镜设置，对盖玻片上每个大小和深度相似的情况进行三个器官的图像。完整的 3D 数据集是在 DAPI 信号上对单单元进行分段以进行比较。条形图显示全分段数据集上具有不同清除方法的平均 DAPI 强度。数据被描述为平均± SD. 值是 DAPI 分段检测到的 >3800 个单元的强度。\ p < 0.0001， Kruskal -Wallis 测试与双面邓恩的多重比较后临时测试。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60709/60709fig3large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>

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Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

使用此处描述的单细胞分辨率 3D 成像方案，可以捕获器官的整个 3D 结构和细胞含量，以及它们与原始组织的表型相似性。该协议可应用于各种器官，其来源、大小和形状各不相同。

单个细胞分辨率三维成像的有机体

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

我们的协议可用于可视化有机体的结构复杂性，允许以单细胞分辨率在这些 3D 结构中映射身份、硫酸盐和分布。我们的快速三天协议针对各种来源的有机体进行了全面优化，并使用简单的样品制备，包括无毒光学清除步骤和硅基安装方法。尽管我们的协议非常简单，但其中一些是关键步骤，如有组织的处理或幻灯片准备，可以通过可视化演示比通过文本进行更好的解释。要回收24个井板中生长在地下膜提取物中生长的100至500微米的有机体，用PBS清洗每个焊缝，而不破坏3D基质，然后将板放在冰上。在每个井中加入一毫升的冰冷恢复溶液，并将板在4摄氏度的水平摇床上放置30至60分钟。将一毫升移液器尖端浸入 PBS 溶液中的 1% BSA 中，上下两次移液器，用 BSA 覆盖每个尖端。接下来，将五毫升 1%PBS BSA 添加到每个条件中的 15 毫升管中，并在丢弃溶液之前将管反转两到三次，以覆盖管内。要收集器官，请使用涂层尖端轻轻重新悬浮井内 5 至 10 次，并在单个涂层 15 毫升管中从每种条件下拉出所有器官。用一毫升的冰冷 1%PBS BSA 冲洗每口井，以确保所有器官都收集好了，然后将洗涤液转移到适当的管中。将每个管中的最终体积与冷 PBS 一起带到 10 毫升，通过离心沉淀器官，以获得一个没有可见层 3D 矩阵的紧密调色板。要修复器官，请使用涂有一毫升移液器尖端，小心地将每个颗粒重新悬浮在一毫升冰冷的甲醛中，并在4摄氏度下固定45分钟。在固定时间进行到一半时轻轻重新悬挂器官。45分钟后，将10毫升的冰冷PBS加补间20加入每个管，然后通过反转轻轻混合，然后将管子在4摄氏度下放置10分钟。为了阻断器官，在孵化结束时，将样品旋转下来，并在每井要镀的至少200微升的冰冷有机体洗涤缓冲液中重新悬浮颗粒。然后将器官转移到24孔悬浮板的单个孔中，在4摄氏度下孵育15分钟。用于免疫标记的有机体洗涤缓冲液加入200微升的空参考井，使器官沉淀到板的底部。当器官稳定下来后，以 45 度角倾斜板，以便去除除最后 200 微升洗涤缓冲液外的所有。接下来，加入200微升含有原抗体的有机体洗涤缓冲液，将板在4摄氏度下过夜，每分钟40圈轻微摇晃。第二天早上，在每一个井里加入一毫升的有机洗涤缓冲液，让有机体在盘子底部沉淀三分钟。当器官稳定下来后，从每井中取出除最后200微升外的所有微升，用三个两小时洗涤，用一毫升新鲜有机体洗涤缓冲液清洗器官，每次洗涤时有轻微的摇晃和摇晃。第三次洗涤后，让有机体在盘子底部沉淀三分钟，然后从每井中取出除最后200微升的有机体洗涤缓冲液。在每个井中加入200微升的有机洗涤缓冲液，含有适当的二次抗体，在4摄氏度下进行夜间孵育，并轻微摇晃和摇晃。第二天早上，用三个两小时的洗涤在一毫升的新鲜有机体洗缓冲液每次洗涤，如证明。最后一次洗涤后，将器官转移到每井1.5毫升管中，通过离心收集器官。对于器官的光学清除，从每个管中去除尽可能多的洗涤缓冲液，而不破坏器官，并使用经过修改的200微升移液器尖端在每个颗粒中添加至少50微升的FUNGI。在室温下孵育20分钟后，器官可以在4摄氏度下储存长达一周，或在零下20摄氏度下储存长达6个月。要通过共体显微镜为器官成像准备幻灯片，请用硅胶密封剂填充 10 毫升注射器，并在注射器上安装经过修改的 200 微升移液器尖端。使用注射器在幻灯片中间绘制一个一比两厘米的矩形，并使用第二个经过修改的 200 微升移液器尖端将清除的器官放入矩形的中间。要将盖滑在风琴上，请先将盖板的左侧滑下，然后缓慢地将盖滑器从左至右降低，直到没有被困空气。然后轻轻地对盖滑的所有边缘施加压力，将其牢固地固定在硅胶密封剂上。要对器官进行成像，请将幻灯片放在共声激光扫描显微镜的舞台上，并选择多浸入式 25 X 目标进行共声成像。将显微镜设置为适当的采集设置，选择低激光功率以减少照片漂白。使用 Z 堆栈模式定义下端上限，并将 Z 步进大小设置为最佳。当成像大型器官结构或多个器官一起，使用10%重叠的平铺模式，并指示感兴趣的区域。设置所有参数后，在成像软件中获取图像的 3D 渲染表示，并优化亮度、对比度和 3D 渲染属性。然后将结果的 RGB 快照导出为 TIFF 文件。与 2D 成像相比，3D 成像的强度通过这些小鼠乳腺器官的图像得到说明，这些图像已如图所示生成。这些代表性器官的中心层由柱形K8/K18正发光细胞组成，外层包含拉长的K5正罗勒细胞，概括了体内乳腺的形态。这种极化组织很难从同一器官的二D光学部分来欣赏。没有3D信息无法解释的复杂结构的另一个例子是 MRP2 正管汁网络，它有助于收集人类肝脏器官的胆汁液。此外，获得的质量和分辨率允许半自动分段和图像分析。因此，在全器官的特定细胞亚型中，可以量化细胞总数和标记的存在。通过分割包含140个细胞的整个器官的核，可以识别三个显示Ki67细胞周期标记高正性的细胞。光学清除剂FUnGI在细胞深处的荧光信号质量中优于未清除和果糖甘油清除。与清除的器官相比，FUNGI清除的器官显示出整体增强的荧光强度。请注意，样品中任何残留的 BME 都可能导致抗体渗透率降低，并可能导致高背景信号。此外，囊性有机体在崩溃时不应进行光学清除。通过稍作调整，样品可用于超分辨率共和、多光子和光片显微镜。

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

芯片尺寸支架的三维细胞培养的微细

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

科研

生物学

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

在体内的单细胞电穿孔内完整的大脑发育

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

在完整的果蝇幼虫体内的亚细胞分辨率成像

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

二维和三维活细胞成像的DNA损伤反应蛋白

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

使用高解析度电脑断层可视化的三维结构和功能的植物血管

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET成像的三维水凝胶

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

CUBIC协议可视化在全山皮肤配方单细胞分辨率蛋白表达

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

三维超F-微丝高分辨率显微镜通过干涉光敏定位显微镜（iPALM）

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

高分辨率呼​​吸测量，以评估线粒体功能的通透和完整细胞

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...