Name: single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids
Uploaded: 2020-06-05T12:30:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids at JoVE.com

Princess Máxima Çocuk Onkoloji Merkezi'nden ve Hubrecht Enstitüsü ve Zeiss'e görüntüleme desteği ve işbirlikleri için teknik destek için minnettarız. Tüm görüntüleme Prenses Máxima görüntüleme merkezinde yapıldı. Bu çalışma Prenses Máxima Pediatrik Onkoloji Merkezi tarafından mali olarak desteklenmiştir. JFD, Marie Curie Global Fellowship ve Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü'nün (NWO) VENI bursu ile desteklenmiştir. ACR, avrupa konseyi (ERC) tarafından desteklendi.

Fare kaynaklı organoidlerin kullanımı mevzuat standartlarına uygun ve Walter ve Eliza Hall Enstitüsü (WEHI) Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı. Tüm insan organoid örnekleri Hubrecht Organoid Technology (HUB, www.hub4organoids.nl) aracılığıyla biyobankalardan alındı. UMC Utrecht Tıbbi Etik Komitesi (METC UMCU) tarafından, Hollanda İnsan Denekleri Yasası'na uygunluğu sağlamak amacıyla HUB'ın talebi üzerine yetki ler alınmış ve uygun olduğunda bağışçılardan bilgilendirilmiş onay almıştır.
1. Reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>%4 (w/v) paraformaldehit (PFA) hazırlamak için, 400 mL fosfat tamponlu salini (PBS) su banyosunda 60 °C'nin hemen altına ısıtın. PFA tozu 20 g ekleyin ve bir karıştırıcı kullanarak eritin.<ol>
<li>Sonra, 10 M NaOH birkaç damla ekleyin. Buz üzerinde soğumaya bırakın ve pH'ı 7,4'e ayarlamak için 10 M HCl'lik birkaç damla ekleyin. PBS ile 500 mL ve aliquot (2 aya kadar -20 °C'de saklayın). NOT: PfA'nın bozulmasını önlemek için 60 °C'nin üzerinde ısıtmayın. Hazırlama süresi = 4 saat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBS'yi Tween-20 (PBT) (%0,1 v/v) ile hazırlamak için 1 mL Ara-20 ila 1 L PBS ekleyin (4 °C'de 4 haftaya kadar saklayın). NOT: Hazırlama süresi = 10 dk.</li>
	<li>100 mL 0,5 M ethylenediamminetetraasetik asit (EDTA) hazırlamak için, 18,6 g EDTA ve 2,5 g NaOH ila80mL dH 2 O ekleyin.2</li>
	<li>1 M Tris'in 500 mL'sini hazırlamak için 60,55 g Tris'i 42 mL konsantre (%36−38) ile çözün 300 mL dH2O'ndaki HCl, pH'ı 8'e ayarlayın ve 500 mL doldurun.</li>
	<li>Organoid yıkama tamponu (OWB) hazırlamak için 1 mL Triton X-100, 2 mL %10 (w/v) SDS ve 2 g büyükbaş serum albumin (BSA) ila 1 L PBS (4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın). NOT: Hazırlama süresi = 10 dk.</li>
	<li>220 mL FUnGI yapmak için 110 mL gliserol ile 20 mL dH2O, 2,2 mL Tris tampon (1 M, pH 8,0) ve 440 μL EDTA (0,5 M) ile karıştırın. Fruktoz 50 g ekleyin ve çözünmüş kadar karanlıkta oda sıcaklığında (RT) karıştırın. Temizlendiğinde, 49 g fruktoz ekleyin ve eriyene kadar karıştırın. Daha sonra 33,1 g üre ekleyin ve eriyene kadar karıştırın (karanlıkta 4 °C'de saklayın). NOT: Yüksek sıcaklıklarda fruktoz karamelize olarak ısıtmayın. FUnGI %50 (v/v) gliserol, %9.4 (v/v) dH2O, 10.6 mM tris baz, 1.1 mM EDTA, 2.5 M fruktoz ve 2.5 M üreden oluşur. Hazırlama süresi = 1 gün.</li>
	<li>PBS-BSA (%1 w/v) hazırlamak için 1 g BSA'yı 100 mL PBS'de çözün (4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın). NOT: Hazırlama süresi = 10 dk.</li>
</ol>2. Organoid iyileşme
NOT: Aşağıdaki adımlar, 100−500 μm boyutunda 24 kuyu plakası ile yetiştirilen bodrum membran ekstresinde (BME) yetiştirilen organoidler için geçerlidir.
<ol><li>Kültür ortamını aspire edin ve 1x buz gibi PBS ile yıkayın. 3B matrisi bozmaktan kaçının.</li>
	<li>Plakayı buza koyun ve her kuyuya 1 mL buz gibi hücre kurtarma çözeltisi(Malzeme Tablosu)ekleyin. Yatay bir çalkalayıcı (40 rpm) üzerinde 4 °C'de 30−60 dk kuluçka. NOT: 3B matris damlacıkları tamamen çözülmelidir.</li>
	<li>%1 PBS-BSA daldırma ve 2x yukarı ve aşağı boru lama ile BSA ile 1 mL pipet ucu kat. Bu kaplama organoidlerin uca yapışmasını önleyecektir. 15 mL konik bir tüpün iç tarafını kaplamak için %1 PBS-BSA'nın 5 mL'si ile doldurun, 2−3x ters çevirin ve PBS-BSA'yı atın. NOT: Bu kaplama fiksasyona kadar tüm plastik sarf malzemeleri için gereklidir (adım 3.3).</li>
	<li>Kaplamalı bir uç kullanarak kuyunun içeriğini 5−10x'i nazikçe askıya alın ve organoidleri kaplanmış 15 mL'lik tüplere aktarın. Aynı kimliğe sahip farklı kuyulardan gelen organoidler aynı tüpte biraraya getirilebilir.</li>
	<li>Durulama ve tüm organoidler toplamak için iyi her kültüriçin buz gibi% 1 PBS-BSA 1 mL ekleyin.</li>
	<li>10 mL'ye soğuk PBS ekleyin ve 3B matrisin görünür bir katmanı olmadan sıkı bir pelet elde etmek için 70 x g ve 4 °C'de 3 dakika boyunca aşağı doğru döndürün. Dikkatle supernatant çıkarın.</li>
</ol>3. Fiksasyon ve engelleme
<ol><li>1 mL buz gibi PFA'da, kaplamalı 1 mL uçlu organoidleri dikkatlice yeniden askıya alın.</li>
	<li>4 °C'de 45 dk. Tüm organoidler arasında bile fiksasyon sağlamak için kaplamalı 1 mL ucu kullanarak fiksasyon süresiboyunca organoidleri yavaşça yeniden askıya alın.</li>
	<li>Tüpe 10 mL buz gibi PBT ekleyin, tüpü ters çevirerek hafifçe karıştırın, 10 dk kuluçkaya yatın ve her ikisi de 4 °C'de 70 x g'deaşağı doğru döndürün. NOT: Bu adımdan itibaren uçların kaplanması genellikle gerekli değildir, çünkü çoğu organoid tip fiksasyon dan sonra uca yapışmaz. Ancak, bazı organoidler fiksasyon sonra bile kaplamalı plastik gerektirebilir.</li>
	<li>Buz gibi OWB (kuyu başına en az 200 μL OWB) pelet yeniden askıya alarak organoidler blok ve 24 iyi süspansiyon plaka organoidler aktarın. NOT: Büyük bir peletten organoidler farklı boyamalar yapmak için birden fazla kuyuya bölünebilir.</li>
	<li>En az 15 dakika 4 °C'de kuluçka.</li>
</ol>4. İmmün etiketleme
<ol><li>Pipet 200 μL OWB boş bir kuyuda iyi bir referans olarak hizmet vermektedir. NOT: İmmün etiketleme, antikor kullanımını azaltmak için 48 veya 96 kuyulu plakalarda da yapılabilir. Ancak, kullanıcı hem boyama ve yıkama performansı daha küçük hacim nedeniyle azaltılabilir farkında olmalıdır.</li>
	<li>Organoidlerin tabağın dibine yerleşmesine izin verin. NOT: Bu bir stereomikroskop kullanılarak kontrol edilebilir ve koyu bir arka plan kullanılarak daha kolay yapılır.</li>
	<li>Plakayı 45° yatırın ve 200 μL OWB'de organoidleri bırakarak OWB'yi çıkarın (200 μL'yi tahmin etmek için referansı iyi kullanın).</li>
	<li>Şekil 1'dekisonuçlar için primer antikorlar 2kat konsantre (örneğin, E-kadherin [1:400] ve Ki67 [1:200] ile 200 μL OWB ekleyin; keratin 5 [1:500], keratin 8/18 [1:200], MRP2 [1:50], ve Ki67 [1:200] Şekil 2sonuçları için ) ve gece boyunca tüp 4 °C'de hafif sallayarak /sallayarak (yatay çalkalayıcıda 40 rpm).</li>
	<li>Ertesi gün, OWB 1 mL ekleyin.</li>
	<li>Organoidler 3 dakika için plakanın altına yerleşmek için izin verin. OwB'yi plakada 200 μL bırakarak çıkarın. OWB 1 mL ekleyin ve hafif sallanan / sallayarak 2 saat yıkayın.</li>
	<li>Adımı 4.6'yı iki kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Organoidler 3 dakika için plakanın altına yerleşmek için izin verin. OWB'yi kuyuda 200 μL bırakarak çıkarın.</li>
	<li>İkincilantikorlar, konjuge antikorlar ve boyalar 2kat konsantre (örneğin, DAPI [1:1000], sıçan-AF488 [1:500], fare-AF555 [1:500], phalloidin-AF647 [1:100] Şekil 1'deki sonuçlar için 200 μL OWB ekleyin; DAPI [1:1000], rat-AF488 [1:500], tavşan-AF555 [1:500], fare-AF555 [1:500], phalloidin-AF647 [1:100] Şekil 2sonuçları için ; DAPI [1:1000], phalloidin-AF647 [1:100] Şekil 3sonuçları için ) ve gece boyunca 4 °C'de inkübe ederken hafif sallayarak/sallayarak.</li>
	<li>Ertesi gün, 4.5−4.7 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Organoidleri 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 3 dk boyunca 70 x g'de aşağı doğru döndürün.</li>
</ol>5. Organoidlerin optik temizlenmesi
<ol><li>Organoidleri bozmadan boru lar atarak OWB'yi mümkün olduğunca çıkarın.</li>
	<li>FUnGI (en az 50 μL, RT) ucu kesilmiş 200 μL ucu kullanarak ekleyin ve kabarcık oluşumunu önlemek için yavaşça askıya alın. 20 dakika RT'de kuluçka. NOT: FUnGI ile optik takas küçük doku küçülme neden olabilir. Bu, tek katmanlı ve çok katmanlı organoidlerin genel morfolojisini etkilemez; ancak, büyük lümenile küresel şekilli monokatmanlı organoidler çökebilir. Protokol burada duraklatılabilir ve numuneler 4 °C 'de (en az 1 hafta) veya -20 °C'de (en az 6 ay) saklanabilir.</li>
</ol>6. Konfokal görüntüleme için slayt hazırlığı
<ol><li>Silikon dolgu maddesi ile 10 mL'lik bir şırınga hazırlayın(Malzeme Tablosu). 200 μL'lik bir uç takın ve şırıngaya bastıktan sonra viskoz silikonun yumuşak bir şekilde akmasını sağlamak için ucunu kesin. Bir slayt ortasında 1 cm x 2 cm bir dikdörtgen çizmek için şırınga kullanın.</li>
	<li>200 μL'lik bir ucun ucunu kesin ve FUnGI'deki organoidleri dikdörtgenin ortasına aktarın.</li>
	<li>Üstüne bir kapak fişi yerleştirin. Kapana kısılmış hava kabarcıklarını en aza indirmek için önce kapağın sol tarafını yerleştirin, sonra kapana kısılmış hava kalmayana kadar coverslip'i yavaşça soldan sağa indirin ve coverslip'i bırakın. NOT: Organoidler için boyut olarak simililer spacers zarar görmelerini önlemek için kullanılabilir.</li>
	<li>Silikon dolgu sıvısına sıkıca takmak için kapağın tüm kenarlarına hafifçe basınç uygulayın. Slayt görüntüleme için hazır. NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve numune 4 °C (en az 1 hafta) veya -20 °C (en az 6 ay) olarak saklanabilir.</li>
</ol>7. Görüntü edinme ve işleme
<ol><li>Konfokal lazer tarama mikroskobu(Malzeme Tablosu)kullanarak, kaydırağı konfokal görüntüleme için çok daldırma 25x veya yağ daldırma 40x hedefi ile görüntüleyin.<ol>
<li>25x hedefi için aşağıdaki kazanım ayarlarını kullanın: tarama modu çerçevesi, kare boyutu 1024 x 1024, voxel boyutu 332 nm x 332 nm x 1,2 μm, piksel çalışma süresi <2 μs, çift yönlü tarama, ortalama sayı 1, bit derinliği 8. Fotobeyaztmayı azaltmak için düşük lazer gücü kullanın (<genel olarak %5, zayıf boyama için %10).</li>
		<li>Alt ve üst sınırları tanımlamak ve Z-adım boyutunu en iyi şekilde ayarlamak için Z-stack modunu kullanın. Büyük organoid yapıları veya birden fazla organoidi birlikte görüntülerken, %10 örtüşme ile fayans modunu kullanın ve ilgi alanını belirtin. NOT: Bu ayarlarla, <300 μm çapında tipik bir organoidin veri boyutu <1 GB'dır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Karo taraması veri setleri için, mikroskop(Tablo Malzemeler)ile birlikte yazılımgörüntüleme dosyaları dikiş. İşlem bölümünde, yöntem olarak Dikiş'i seçin, parametreler altında Yeni Çıktı'yı seçin ve dikişi için dosyayı seçin. Dikiş elemek için Uygula tuşuna basın.</li>
	<li>Görüntüleme yazılımında(Malzeme Tablosu) 3B Görünüm sekmesi altında görüntülemenin 3B görüntülenmiş bir temsilini edinin ve daha sonra parlaklık, zıtlık ve 3B işleme özelliklerini optimize edin. Sonuçların RGB anlık görüntülerini TIFF dosyaları olarak dışa aktarın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snapshot:+Growing+Organoids+from+Stem+Cells.">Snapshot: Growing Organoids from Stem Cells.</a> Cell. 161 (7), 1700 (2015).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Bartfeld, S., Stem Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment.">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+responses+to+CFTR-modulating+drugs+using+rectal+organoids+derived+from+subjects+with+cystic+fibrosis.">Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis.</a> Science Translational Medicine. 8 (344), 84 (2016).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Multipotent+Luminal+Progenitor+Cells+in+Human+Prostate+Organoid+Cultures.">Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids.">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Nanki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+Routes+toward+Wnt+and+R-spondin+Niche+Independency+during+Human+Gastric+Carcinogenesis.">Divergent Routes toward Wnt and R-spondin Niche Independency during Human Gastric Carcinogenesis.</a> Cell. 174 (4), 856-869 (2018).</li><li>Jamieson, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+a+robust+mouse+mammary+organoid+system+for+studying+tissue+dynamics.">Derivation of a robust mouse mammary organoid system for studying tissue dynamics.</a> Development. 144 (6), 1065-1071 (2017).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity.">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Turco, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hormone-responsive+organoid+cultures+of+human+endometrium+in+a+chemically+defined+medium.">hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium.</a> Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).</li><li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+In+vitro+Expansion+of+Salivary+Gland+Stem+Cells+Driven+by+Wnt+Signals.">Long-Term In vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).</li><li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5-+or+Lgr6-expressing+taste+stem/progenitor+cells+generate+taste+bud+cells+ex+vivo.">Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Schutgens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubuloids+derived+from+human+adult+kidney+and+urine+for+personalized+disease+modeling.">Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling.</a> Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+Tissue+Clearing.">SnapShot: Tissue Clearing.</a> Cell. 171 (2), 496 (2017).</li><li>Rios, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+a+novel+population+of+binucleated+mammary+epithelial+cells+in+lactation.">Essential role for a novel population of binucleated mammary epithelial cells in lactation.</a> Nature Communications. 7, 11400 (2016).</li><li>Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+identification+of+bipotent+stem+cells+in+the+mammary+gland.">In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland.</a> Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).</li><li>Rios, A. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+organoids:+a+bright+future+ahead.">Imaging organoids: a bright future ahead.</a> Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDISCO:+A+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Body+Profiling+of+Cancer+Metastasis+with+Single-Cell+Resolution.">Whole-Body Profiling of Cancer Metastasis with Single-Cell Resolution.</a> Cell Reports. 20, 236-250 (2017).</li><li>Murakami, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+single-cell-resolution+whole-brain+atlas+using+CUBIC-X+expansion+microscopy+and+tissue+clearing.">A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing.</a> Nature Neuroscience. 21 (4), 625-637 (2018).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).</li><li>Rios, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraclonal+Plasticity+in+Mammary+Tumors+Revealed+through+Large-Scale+Single-Cell+Resolution+3D+Imaging.">Intraclonal Plasticity in Mammary Tumors Revealed through Large-Scale Single-Cell Resolution 3D Imaging.</a> Cancer Cell. 35 (4), 618-632 (2019).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+three-dimensional+imaging+to+the+intestinal+crypt+organoids+and+biopsied+intestinal+tissues.">Application of three-dimensional imaging to the intestinal crypt organoids and biopsied intestinal tissues.</a> The Scientific World Journal. 2013, 624342 (2013).</li><li>Costa, E. C., Silva, D. N., Moreira, A. F., Correia, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+methods:+An+overview+of+the+techniques+used+for+the+imaging+of+3D+spheroids.">Optical clearing methods: An overview of the techniques used for the imaging of 3D spheroids.</a> Biotechnology and Bioengineering. 116 (10), 2742-2763 (2019).</li><li>Masselink, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+applicability+of+a+streamlined+ethyl+cinnamate-based+clearing+procedure.">Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure.</a> Development. 146, 166884 (2019).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada, tek hücreçözünürlüğü ile bozulmamış organoidlerin 3Boyutlu görüntülemeiçin ayrıntılı bir protokol ortaya koyduk. Bu protokolü başarıyla gerçekleştirmek için bazı kritik adımların atılması gerekir. Bu bölümde bu adımları vurgular ve sorun giderme sağlar.
İlk kritik adım 3B matrisin kaldırılmasıdır. Çoğu organoidler iyi polarize 3D yapıların oluşumunu artırmak için in vivo ekstrasellüler ortamı taklit matris kullanımı ile in vitro yayılır. 3D matris içinde sabitleme ve sonraki boyama mümkündür, ancak antikorların penetrasyonu için dezavantajlı olabilir veya yüksek arka plan sinyali üretebilir (veriler gösterilmez). Matrislerin verimli bir şekilde çıkarılması matrisin türünden, organoidlerin miktarı ve büyüklüğünden ve uzun süreli kültürden etkilenebilir. Bu nedenle, farklı kültür koşulları için optimizasyon gerekebilir. Matrigel veya BME'de yetiştirilen organoidler için, buz gibi hücre kurtarma çözeltisinde 30−60 dk'lık bir adım, matrisi organoidlere zarar vermeden eritmek için yeterlidir. Buna ek olarak, destekleyici 3D matris kaldırılması yerli yapıların kaybına ve organoid diğer hücre tipleri ile organoid temas bozulmasına neden olabilir, örneğin organoidler fibroblastlar veya bağışıklık hücreleri ile birlikte kültürlü olduğunda. Ayrıca, optimal organoid fiksasyon 3D doku mimarisi, protein antijenitesi ve otofloresanenen aza indirilmesi nde çok önemlidir. 4 °C'de %4 PFA ile 45 dakika sabitleme, çok çeşitli organoid ve antijenlerin etiketlenmesi için normalde yeterlidir. Ancak, daha uzun bir fiksasyon adım, kadar 4 saat, genellikle daha floresan muhabir proteinlerifade organoidler için uygundur, ancak farklı floroforlar için optimizasyon gerektirir. 20 dk'dan kısa fiksasyon süreleri phalloidin probları kullanılarak F-aktini düzgün bir şekilde etiketlemek için yeterli değildir. Bir diğer yaygın sorun da protokol sırasında organoidlerin kaybedilmesi. Bu nedenle (i) sabitlenmemiş organoidleri kullanırken tanımlandığı şekilde %1 BSA-PBS ile boru uçlarını ve tüpleri dikkatlice kaplamak, (ii) numunenin plakaya yapışmasını önlemek için düşük yapışma veya süspansiyon plakaları kullanmak ve (iii) tamponları dikkatlice çıkarmadan önce organoidlerin plakanın alt kısmında yerleşmelerine izin vermek önemlidir. Viskoz FUnGI pipetleme kabarcıklar tanıtmak olabilir. TEMIZlenmiş numunenin RT'de kullanılması viskoziteyi azaltır ve kullanım kolaylığını artırır ve bu da organoid kaybını en aza indirir. Çoğu organoidin kullanımı kolay olmakla birlikte, genişlemiş lümenli kistik organoidler %4 PFA ile sabitlenirken veya FUnGI ile temizlendiğinde çökme eğilimi yüksektir. Bu etki, farklı bir fiksatif (örneğin, formalin veya PFA-glutaraldehit) kullanılarak azaltılabilir, ancak tamamen engellenemez. Ancak, bu potansiyel otofloresan etkisi olabilir, antikor penetrasyonu ve epitop kullanılabilirliği. Kistik organoidler açıklığa uğradıktan sonra katlanmış göründüğünde, ışık saçılımı ile daha az engellenen multi-foton mikroskopi ile temizleme adımını ve görüntüsünü atlamaları tavsiye edilir. Son olarak, organoidlerin tüm 3D yapısı elde zor olabilir ve coverslip ve organoid arasında en az mesafe gerektirir. Buna ek olarak, organoidler montaj ajanı taşımak için oda var, Bu Z derinliğinde veri kaydederken X neden olabilir- ve Y-shifts. Slayt hazırlama sırasında daha az silikon dolgu madde kullanmak, kapak kayması ve mikroskop kaydırağı arasındaki suboptimal montajı çözebilir. Ancak, çok az silikon organoid sıkıştırma ve doğal 3D yapısıkaybına yol açabilir. FUnGI, daha yüksek viskozitesi nedeniyle, görüntüleme sırasında slayt montajı ve organoidlerin stabilitesi için kullanım işlemlerini geliştirir.
Bu protokol derinlemesine hücresel içerik ve bozulmamış organoidlerin 3D mimarisi nde çalışmak için geniş bir uygulama yelpazesi için kullanılabilir iken, bazı sınırlamalar göz önünde bulundurulmalıdır. Bu metodoloji oldukça düşük iş ve zaman alıcıdır. Gerçekten de, kullanıcılar 3D büyük bozulmamış organoidler görüntüleme z hem fayans ve örnek edinimi gerektirir akılda tutmak gerekir, uzun edinim süreleri yol. Daha hızlı görüntüleme, rezonans veya dönen disk tarayıcı sı dahil olmak üzere mikroskop varlıkları kullanılarak veya ışık sayfası mikroskop teknolojisi26ile elde edilebilir. Başka bir husus, belirteçlerin aynı örnekten farklı organoidler arasında heterojen olarak ifade edilebildiğidir. Bu nedenle, kültürde bu organoid heterojenliği daha iyi yakalamak için birden fazla organoid edinilmelidir. Son olarak, tam ıslak laboratuvar prosedürü basit olmakla birlikte, verilerin postprocessing 3D görselleştirme ve niceliklendirme için görüntü analizi yazılımı becerileri yanı sıra veri kümesinde mevcut tüm bilgileri madencilik istatistikleri gerektirir.
Son on yılda, hacim görüntüleme alanında büyük ölçüde gelişmiş, optik takas ajanları geniş bir yelpazede gelişimi ve mikroskopi ve hesaplamalıteknolojilerdegelişmeler hem de nedeniyle 27,30,31. Geçmişte çoğu çalışma organların veya ilişkili tümörlerin büyük hacimli görüntüleme odaklanmış iken, daha yakın zamanda organoid yapılar da dahil olmak üzere daha küçük ve daha kırılgan dokular için yöntemler, geliştirilmiştir36,37,38. Biz son zamanlarda sonraki 3D render ve görüntü analizi 26 için tek hücre düzeyinde çeşitli köken, boyut ve şekil tüm-montaj organoidler görüntüleme için basit ve hızlı bir yöntem yayınladı26, biz burada bazı iyileştirmeler ile sunulan (örneğin, FUnGI, silikon montaj) ve bir video protokolü eşliğinde. Bu yöntem, karmaşık hücre morfolojisi ve doku mimarisinin deşifre edilmesinde konvansiyonel 2D kesit tabanlı görüntülemeden daha üstündür(Şekil 2) ve konfokal mikroskoplu laboratuvarlarda uygulanması kolaydır. Protokole hafif adaptasyonlar ile, örnekler ile uyumlu yapılabilir, süper çözünürlüklü konfokal, multi-foton yanı sıra ışık sayfası görüntüleme, hangi bu protokolü yaygın olarak uygulanabilir hale getirir ve daha iyi organoidler ile modellenebilir çok boyutlu karmaşıklığı anlamak için güçlü bir araç ile kullanıcılara sağlar.

Organoid teknoloji gibi yeni kültür yöntemlerinin ilerlemesi, bir çanak1organ kültürünü sağlamıştır. Organoidler, phenotibik ve fonksiyonel özellikleri korurken menşe dokularını süsleyen üç boyutlu (3D) yapılara dönüşürler. Organoidler şimdi temel biyolojik sorular ele almak için araçsal vardır2, kanser de dahil olmak üzere hastalıkların modelleme3, ve kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri geliştirmek4,5,6,7. Bağırsak erişkin kök hücrelerinden türetilen organoidler üretmek için ilk protokol beri8, organoid teknolojisi prostat9dahil olmak üzere organlardan türetilen sağlıklı ve kanserli dokuların geniş bir yelpazede içerecek şekilde genişletilmiştir 9 , beyin10, karaciğer11,12, mide13, meme14,15, endometrium16, tükürük bezi17, tat tomurcuk18, pankreas19, ve böbrek20.
Organoidlerin gelişimi 3D21, 22,,23,22,24tüm montaj dokusunun mimarisigörselleştirmek yeni volumetrik mikroskobik teknikleriyükselişi ile eşleşmiştir. 3D görüntüleme, biyolojik örneklerin karmaşık organizasyonunu görselleştirmede geleneksel 2D doku kesiti görüntülemeden daha üstündür. 3D bilgi bozulmamış biyolojik örneklerin hücresel bileşimi, hücre şekli, hücre kaderi kararları ve hücre-hücre etkileşimleri anlamak için gerekli olduğunu kanıtlıyor. Konfokal veya multifoton lazer tarama mikroskobu (CLSM ve MLSM) ve hafif sac floresan mikroskobu (LSFM) gibi tahribatsız optik kesit teknikleri artık hem ince ayrıntıların hem de genel doku mimarisinin tek bir biyolojik örnek içinde birleştirilmesine olanak sağlamaktadır. Bu güçlü görüntüleme yaklaşımı, organoidler25 ile modellenebilir yapısal karmaşıklığı çalışma ve bu 3D yapıları oluşturan tüm bireysel hücrelerin mekansal dağılımı, henotypik kimlik ve hücresel durumu harita fırsatı sağlar.
Son zamanlarda sabit ve temizlenmiş organoidler yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme için ayrıntılı bir protokol yayınladı26. Disco27,28,CUBIC29,,30,31ve CLARITY32,33gibi büyük bozulmamış dokular için metodolojiler aksine bu protokol, hassas organoid yapıların işlenmesi için özel olarak tasarlanmış ve optimize edilebiyideğiştirmiştir. Bu nedenle, bu yöntem genellikle kökeni, büyüklüğü ve şekli ve hücresel içerik farklı organoidler geniş bir yelpazede için geçerlidir. Ayrıca, genellikle önemli zaman ve çaba gerektiren diğer hacimsel görüntüleme protokolleri ile karşılaştırıldığında, protokolümüz talep edilemez ve 3 gün içinde tamamlanabilir. Biz mimari ve yeni geliştirilen organoid sistemlerin çeşitli dokulardan türetilen hücresel bileşimi görselleştirmek için 3D görüntüleme protokolü uyguladık, insan hava yolları dahil34, böbrek20, karaciğer11, ve insan meme kanseri organoidler15. Çok renkli floresan soy takibi ile birlikte, bu yöntem aynı zamanda fare meme organoidler bazal hücrelerin biyopotens ortaya çıkarmak için kullanılmıştır14.
Burada, toksik olmayan takas ajanı FUnGI35tanıtarak protokolü rafine. FUnGI temizleme tek bir kuluçka adımında elde edilir, viskozitesi nedeniyle montajı daha kolaydır ve depolama sırasında floresan iyi korur. Buna ek olarak, nükleer lekeleri geliştirmek için yıkama tamponuna sodyum dodecyl sülfat (SDS) ve mikroskopi öncesinde kolay slayt hazırlama için silikon bazlı montaj yöntemini sokuyoruz. Şekil 1 protokolün(Şekil 1A)grafiksel genel görünümünü ve 3Boyutlu görüntülenmiş organoidörnekleri(Şekil 1B−D)sağlar. Kısacası, organoidler 3D matris, sabit ve immünetiketli, optik temizlenmiş, konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenen ve daha sonra 3D görselleştirme yazılımı ile işlenen kurtarılır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:773px;" width="772">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">1.5 ml safe-lock centrifuge tubes</td>
			<td style="width:101px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">EP0030 120.094</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">2 ml safe-lock centrifuge tubes</td>
			<td style="width:101px;">Eppendorf</td>
			<td>EP0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Cell recovery solution</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:101px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">LSM880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Confocal microscope software ZEN</td>
			<td style="width:101px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">ZEN black/blue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Conical tubes 15 ml</td>
			<td style="width:101px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Coverglass #1.5 24x60mm</td>
			<td style="width:101px;">Menzel-Glazer</td>
			<td style="width:119px;">G418-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Coverglass #1.5 48x60mm</td>
			<td style="width:101px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:119px;">G425-4860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">DAPI</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">D3571</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Dissection Stereomicroscope</td>
			<td style="width:101px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M205 FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Double sided sticky tape 12,7 mm 6,35 m</td>
			<td style="width:101px;">Scotch 3M</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-bufferd Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14190144</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">EDTA</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td>15576-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Focus Clear</td>
			<td style="width:101px;">CelExplorer</td>
			<td style="width:119px;">FC-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Fructose</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Glycerol</td>
			<td style="width:101px;">Boom</td>
			<td style="width:119px;">76050771.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Graduated Transfer Pipets</td>
			<td style="width:101px;">Samco</td>
			<td style="width:119px;">222-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Horizontal shaker</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">444-2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td style="width:101px;">Ajax Firechem.</td>
			<td style="width:119px;">265.2.5L-PL</td>
			<td>10M stock solution, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Imaris software</td>
			<td style="width:101px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Microscope slides Superfrost</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">10143352</td>
			<td>ground edge, 90 degrees 26 mm~76 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148-500g</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Phalloidin Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A22287</td>
			<td>dilution 1:100-200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">E-cadherin</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">13-1900</td>
			<td>dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Ki-67</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">B56</td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Keratin 5</td>
			<td style="width:101px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">905501</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:303px;">Keratin 8/18</td>
			<td style="width:101px;">DSHB (University of Iowa)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">MRP2</td>
			<td style="width:101px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab3373</td>
			<td>dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Secondary Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-21208</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Secondary Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 555</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-31570</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Secondary Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 555</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-31572</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Silicone Sealant</td>
			<td style="width:101px;">Griffon</td>
			<td style="width:119px;">S-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right">28312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Sodium Hydroxide (NaOH) pellets</td>
			<td style="width:101px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">567530</td>
			<td>10 M stock solution, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Suspension cell culture plates</td>
			<td style="width:101px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">662102</td>
			<td>24-well</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Tris</td>
			<td style="width:101px;">Fisher Scientific</td>
			<td>11486631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T8532</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Tween-20</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">UltraPure Low Melting Point (LMP) Agarose</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Urea</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Workstation</td>
			<td style="width:101px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids

Organoid teknoloji, minyatür doku in vitro 3D kültür, organ gelişimi ve fonksiyonu yanı sıra hastalık yöneten hücresel süreçler için yeni bir deneysel pencereaçtı. Floresan mikroskopi, hücresel bileşimlerini ayrıntılı olarak karakterize etmede ve ortaya çıktıkları dokuya benzerliklerini göstermede önemli bir rol oynamıştır. Bu makalede, immünofloresan etiketleme üzerine tüm organoidlerin yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme için kapsamlı bir protokol sayılmiyoruz. Bu yöntem, kökeni, büyüklüğü ve şekli farklı organoidlerin görüntülenmesi için yaygın olarak uygulanabilir. Şimdiye kadar biz hava yolu, kolon, böbrek ve karaciğer organoidler sağlıklı insan dokusu, yanı sıra insan meme tümörü organoidler ve fare meme bezi organoidler elde edilen yöntem uyguladık. Biz işaretleri tek hücreli sayısallaştırma için fırsat ile tüm 3D organoidlerin edinimi sağlayan bir optik takas ajanı, FUnGI kullanın. Organoid hasattan görüntü analizine kadar bu üç günlük protokol konfokal mikroskopi kullanılarak 3 Boyutlu görüntüleme için optimize edilebistir.

3Boyutlu görüntüleme organoidleri mimarinin, hücresel bileşimin ve hücre içi süreçlerin detaylı olarak görselleştirilmesini sağlar. Sunulan teknik talep edilemez ve muhtemelen çeşitli organ veya ev sahibi türlerden elde edilen organoid sistemlerin geniş bir yelpazede uygulanabilir.
2D görüntüleme ile karşılaştırıldığında 3D görüntüleme gücü son zamanlarda yayınlanan yöntemler kullanılarak oluşturulan fare meme bezi organoidlerin görüntüleri ile gösterilmiştir14. Bu organoidlerin merkezi tabakası columnar şekilli K8/K18-pozitif luminal hücrelerden oluşur ve dış tabaka, meme bezinin morfolojisini vivo olarak özetleyen uzamış K5-postive bazal hücreler(Şekil 2A)içerir. Bu polarize organizasyon aynı organoid(Şekil 2B, orta panel) bir 2D optik bölümünden takdir etmek zordur. 3D bilgi olmadan yorumlanması imkansız karmaşık bir yapının bir başka örneği insan karaciğer organoidlerinin safra sıvısı toplama kolaylaştırmak MRP2-pozitif kaniculiağı11 (Şekil 2B). Bu, yöntemimizin organoidlerin temel yapısal özelliklerinin görselleştirilmesine nasıl olanak sağladığını örneklemektedir. Ayrıca elde edilen kalite ve çözünürlük yarı otomatik segmentasyon ve görüntü analizine olanak sağlar. Böylece, toplam hücre sayıları ve belirteçlerin varlığı tüm organoidlerde belirli hücresel alt tiplerde ölçülebilir. Bunu, ki67 hücre döngüsü belirteci için yüksek pozitiflik gösteren 140 hücreiçeren tüm bir organoidin çekirdeklerini bölerek gösteriyoruz(Şekil 2C). DAPI kanalı kaynak kanal olarak seçilir ve segmentler yoğunluk eşik adımı ve 10 μm'lik küre çapına göre oluşturulur. Dokunma nesneleri tohum noktalarından büyüyen bölgeye göre bölünür. Son olarak, küçük gürültükaynaklı segmentleri kaldırmak için 10 voxels bir boyut filtresi uygulanır. Bir çekirdeği temsil eden her segment için, Ki67 kanalının ortalama yoğunluğu daha sonra çizim için dışa aktarılır.
Yakın zamanda, organoidlerin saydamlıklarını iyileştirmek için bu protokole entegre ettiğimiz optik takas ajanı FUnGI35'igeliştirdik. FUnGI kullanımı kolaydır, çünkü bağışıklık sistemisel boyamadan sonra tek bir kuluçka adımı ile takas kolayca sağlanır. Aracının ek bir avantajı da viskozitesidir, bu da slayt montajı sırasında numune işlemeyi kolaylaştırır. FUnGI'deki floresan numuneler -20 °C'de birden fazla ay saklansalar bile floresanlarını korurlar. Biz FUnGI organoid derin floresan sinyal kalitesi belirsiz ve fruktoz-gliserol daha iyi performans göstermektedir(Şekil 3A,B), ve Mantar temizlenmiş organoidler genel olarak gelişmiş floresan yoğunluğu belirsiz organoidler ile karşılaştırıldığında(Şekil 3C).
Özetle, immünetiketli organoidlerin hacimsel verilerini elde etmek için talep edilemez, tekrarlanabilir 3D görüntüleme tekniğini tanımlıyoruz. Bu protokol, hem fare hem de insan kökenli olanlar da dahil olmak üzere çeşitli organoidleri sağlıklı ve hastalıklı modellerden elde etmek için kolayca kullanılabilir. Basit numune hazırlama konfokal kolaylaştırmak için uyarlanabilir, multi-foton ve hafif levha floresan mikroskoplar tüm organoidlerin hücre içi hücresel çözünürlüğü elde etmek için.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60709/60709fig1.jpg"> Şekil 1: Yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme protokolünün şematik genel bakışı. Organoidler 3Boyutlu matrislerinden çıkarLar. Fiksasyon ve blokaj antikor lar ve boyalar ile immünetiketleme öncesinde yapılır. FUnGI takas aracısı kullanılarak optik takas tek bir adımda elde edilir. Görüntülerin 3D render görüntüleme yazılımı kullanılarak yapılabilir. (A) Prosedürün şematik genel bakışı. (B) F-actin ve E-kadherin (E-cad) (25x yağ hedefi) için etiketlenmiş bir insan kolon organoid immünotam 3D konfokal görüntü temizlendi. Ölçek çubuğu = 40 μm. (C) Temizlenmiş tam montaj 3D konfokal görüntü. Ölçek çubuğu = 20 μm. (D) F-actin, E-kadherin (E-cad) ve Ki67 (25x yağ hedefi) için immünoetiketli bir insan kolonik organoid genişletilmiş optik bölümü. Ölçek çubuğu = 5 μm. Bu rakam Dekkers ve ark.26'dandeğiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60709/60709fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60709/60709fig2.jpg"> Şekil 2: Hacimsel görüntüleme karmaşık 3B mimarisini görselleştirir. Tam montajlı 3D veri kümelerini (sol panel), 2B optik bölümleri (orta panel) ve genişlemiş bir bölgenin (sağ panel) 3B alanlarını temsil eden konfokal görüntüler. (A) Bir organoid fare meme bezinin tek bir bazal hücreden elde edilen luminal hücreleri çevreleyen veya K8/18, K5 ve F-actin (fruktoz-gliserol takas; 25x yağ hedefi) çevreleyen uzamış meme bazal hücrelerin 3D organizasyon gösteren. Ölçek çubukları 55 μm (sol panel) ve 40 μm (orta ve sağ paneller) temsil eder. (B) DAPI, MRP2 ve F-actin (fruktoz-gliserol temizleme; 40x yağ hedefi) etiketli MRP2-pozitif kanaliculi karmaşık bir 3D ağ ile bir insan fetal karaciğer organoid. Ölçek çubukları 25 μm (sol panel) ve 8 μm (orta ve sağ paneller) temsil eder. (C) Dapi ve Ki67 (sol panel) ile etiketlenmiş bir insan fetal karaciğer organoidinin confocal 3D tam montaj görüntüsü ve görüntüleme yazılımı (orta panel) kullanılarak DAPI kanalında segmentli bir görüntü. Ölçek çubuğu = 15 μm. Graf, tüm organoidin (140 hücre) (sağ panel) tüm hücrelerinde (DAPI-segmentli) Ki67 ortalama yoğunluğunu temsil eden çizilmiştir. Bu rakam Dekkers ve ark.26'dandeğiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60709/60709fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60709/60709fig3.jpg"> Şekil 3: FUnGI ile organoidlerin optik temizlenmesi. (A) F-actin (yeşil) ve DAPI (gri) ile etiketlenmiş ve hiçbir açıklık ile görüntülenen insan kolon organoidlerin temsili görüntüleri, fruktoz-gliserol ile temizlenir veya FUnGI ile temizlenir (25x yağ hedefi). Sol panel: organoid 3D render. Sağ panel: 150 μm derinlikte organoid optik bölümü. "Hiçbir temizleme" durumu için görüntünün parlaklığı organoid görselleştirmek için "fruktoz-gliserol" ve "FUnGI" koşulları ile karşılaştırıldığında artırılmalıdır. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) Farklı optik temizleme yöntemleri için Artan Z derinliği ile DAPI yoğunluğunun azaldığını gösteren doğrusal olmayan regresyon uyumu. Değerler DAPI segmentasyonu tarafından saptanan tek tek hücrelerin yoğunluklarını temsil eder ve organoidin ilk 50 μm'lik ortalama DAPI yoğunluğuna normalleşir. Derin kenarlarda ve tomurcuklanan yapılarda daha parlak hücrelerin neden olduğu zayıflamanın hafife alınmaması için sadece organoidlerin merkezi bölgeleri analiz edildi. (C) Kapak kaymadoğru benzer boyut ve derinlikte durum başına üç organoidler aynı mikroskop ayarları kullanılarak görüntülendi. Tam 3B veri kümeleri karşılaştırma için DAPI sinyalinde tek hücreli olarak bölümlenmiştir. Tam parçalı veri kümelerinde farklı temizleme yöntemleriyle ortalama DAPI yoğunluğunu gösteren çubuk grafiği. Veriler ortalama ± SD. Değerleri DAPI segmentasyonu tarafından algılanan >3800 tek tek hücrelerin yoğunlukları olarak gösterilmiştir. = p < 0.0001, Kruskal-Wallis testi iki taraflı Dunn'ın çoklu karşılaştırma post-hoc testi ile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60709/60709fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids at JoVE.com

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoidlerin tüm 3Boyutlu yapısı ve hücresel içeriği nin yanı sıra orijinal dokuya olan henotipik benzerlikleri burada açıklanan tek hücreli çözünürlükte 3D görüntüleme protokolü kullanılarak yakalanabilir. Bu protokol, kökeni, büyüklüğü ve şekli değişen çok çeşitli organoidlere uygulanabilir.

Bozulmamış Organoidlerin Tek Hücreli Çözünürlükte Üç Boyutlu Görüntülemesi

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Protokolümüz organoidlerin yapısal karmaşıklığını görselleştirmek için kullanılabilir, tek hücreli çözünürlükte bu 3B yapılarda kimlik, sülfat ve dağılım haritalanmasına izin verir. Hızlı üç günlük protokolümüz tamamen çeşitli kökenli organoidler için optimize edilmiş ve toksik olmayan optik temizleme adımı ve silikon bazlı montaj yöntemi içeren basit bir numune hazırlama kullanır. Protokolümüz basit olmasına rağmen, bazıları organize işleme veya slayt hazırlama gibi kritik adımlardır, görsel gösterim yoluyla metin yoluyla daha iyi açıklanabilir.24 kuyu plakalı bodrum zarek ekstresinde yetiştirilen 100 ila 500 mikrometre çapında organoidleri kurtarmak için, 3D matrisleri bozmadan PBS ile hasat edilecek her kaynağı yıkayın ve plakayı buzüzerine yerleştirin. Her kuyuya bir mililitre buz gibi geri kazanım çözeltisi ekleyin ve plakayı 30 ila 60 dakika boyunca dört derece lik yatay bir çalkalayıcıya yerleştirin. Bir mililitrelik pipet ipuçlarını PBS çözümünde %1 BSA'ya batırın ve pipetleri iki kez yukarı ve aşağı iki kez BSA ile kaplayın.Daha sonra, her koşul da 15 mililitrelik bir tüpe %1 PBS BSA beş mililitre ekleyin ve tüpün içini kaplamak için çözeltiyi atmadan önce tüpü 2-3 kez ters çevirin. Organoidleri toplamak için, kuyu içeriğini beş ila 10 kez hafifçe askıya almak için kaplanmış bir uç kullanın ve her durumdan tüm organoidleri tek bir kaplamalı 15 mililitrelik tüple çekin. Tüm organoidlerin toplanmasını sağlamak için her kuyuyu bir mililitre buz gibi %1 PBS BSA ile durulayın ve yıkamaları uygun tüplere aktarın.Soğuk PBS ile 10 mililitreye kadar her tüpteki son hacmi getirin ve 3B matrisin görünür bir katmanı olmadan sıkı bir palet elde etmek için organoidleri santrifüj ile tortulayın. Organoidleri onarmak için, bir mililitrelik pipet ucunu kullanarak her bir peleti bir mililitrelik buz gibi para formaldehitte dikkatlice yeniden askıya alın ve 45 dakika boyunca dört derece santigrat derecede düzeltin. Fiksasyon süresinin yarısında organoidleri yavaşça askıya alın.45 dakika sonra, 10 dakika boyunca dört santigrat derece tüpler yerleştirmeden önce, her tüp için buz gibi PBS artı ara 20 mililitre ekleyin ve yavaşça inversion tarafından karıştırın. Organoidleri engellemek için, kuluçka sonunda, örnekleri aşağı spin ve iyi kaplanacak başına buz gibi organoid yıkama tampon en az 200 mikrolitre pelet yeniden askıya. Daha sonra organoidleri 24 kuyuluk süspansiyon plakasının tek tek kuyularına aktarın ve 4 derecelik bir kuluçka için 15 dakika kuluçkaya yatın.Immunolabeling için boş bir referans kuyusu içine organoid yıkama tampon 200 mikrolitre ekleyin ve organoidler plaka nın altına yerleşmek için izin. Organoidler yerleştiğinde, son 200 mikrolitre yıkama tamponunun kaldırılması na izin vermek için plakayı 45 derecelik bir açıyla yatırın. Daha sonra, ilgi birincil antikorları içeren organoid yıkama tampon 200 mikrolitre ekleyin ve hafif sallanan ve dakikada 40 devrimleri sallayarak plaka dört derece santigrat gecede yerleştirin.Ertesi sabah, her kuyuya bir mililitre organoid yıkama tamponu ekleyin ve organoidlerin üç dakika boyunca tabağın dibine yerleşmelerine izin verin. Organoidler yerleştiğinde, her kuyudan son 200 mikrolitre hariç hepsini çıkarın ve organoidleri bir mililitre taze organoid yıkama tamponu ve yıkama başına hafif sallanan ve titreyen üç adet iki saatlik yıkama ile yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, organoidlerin her kuyudan son 200 mikrolitre organoid yıkama tamponu hariç hepsini çıkarmadan önce üç dakika boyunca plakanın dibine yerleşmelerine izin verin.Hafif sallanan ve sallayarak dört derece santigrat bir gecede kuluçka için her kuyuya uygun ikincil antikorlar içeren organoid yıkama tampon 200 mikrolitre ekleyin. Ertesi sabah, organoidleri bir mililitre taze organoid yıkama tamponunda üç adet iki saatlik yıkama ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, iyi başına bir 1.5 mililitre tüp içine organoidler aktarın ve santrifüj ile organoidler toplamak.Organoidlerin optik temizlenmesi için, organoidleri bozmadan her tüpten mümkün olduğunca çok yıkama tamponu çıkarın ve her pelete en az 50 mikrolitre FUnGI eklemek için değiştirilmiş 200 mikrolitrelik pipet ucu kullanın. Oda sıcaklığında 20 dakikalık bir kuluçkadan sonra organoidler bir haftaya kadar dört santigrat derecede veya eksi 20 santigrat derecede altı aya kadar saklanabilir. Konfokal mikroskopi ile organoid görüntüleme için slaytlar hazırlamak için, 10 mililitrelik bir şırıngayı silikon dolgu ile doldurun ve şırıngaya modifiye edilmiş 200 mikrolitrelik pipet ucu takın.Bir slayt ortasında bir iki santimetre bir dikdörtgen çizmek için şırınga kullanın ve dikdörtgenin ortasına temizlenmiş organoidler yerleştirmek için ikinci bir değiştirilmiş 200 mikrolitre pipet ucu kullanın. Organoidlerin üzerine bir kapak kayma yerleştirmek için, kapak kayma sol tarafı ilk aşağı yerleştirin, yavaş yavaş soldan sağa hiçbir sıkışmış hava kadar kapak kayma indirmeden önce. Daha sonra silikon dolgu sıvısına sıkıca takmak için kapağın tüm kenarlarına hafifçe basınç uygulayın.Organoidleri görüntülemek için, slaytı konfokal lazer tarama mikroskobunun aşamasına yerleştirin ve konfokal görüntüleme için çok daldırma 25 X hedefi seçin. Fotoğraf beyazlatma azaltmak için düşük bir lazer gücü seçerek, uygun edinme ayarları na mikroskop ayarlayın. Alt uç üst sınırları tanımlamak için Z yığın modunu kullanın ve Z adım boyutunu en iyi şekilde ayarlayın.Büyük organoid yapıları veya birden fazla organoidi birlikte görüntülerken, %10 örtüşme ile fayans modunu kullanın ve ilgi alanını gösterir. Tüm parametreler ayarlandığında, görüntüleme yazılımında görüntülemenin 3B görüntülenmiş bir temsilini edinin ve parlaklık, kontrast ve 3B işleme özelliklerini optimize edin. Ardından sonuçların RGB anlık görüntülerini TIFF dosyaları olarak dışa aktarın.2D görüntüleme ile karşılaştırıldığında 3D görüntüleme gücü gösterildiği gibi oluşturulan fare meme bezi organoidlerinin bu görüntüleri ile gösterilmiştir. Bu temsili organoidlerin merkezi tabakası sütun şeklindeki K8/K18 pozitif luminal hücrelerden oluşur ve dış tabaka, meme bezinin morfolojisini in vivo olarak özetlemek üzere uzamış K5 pozitif fesleğen hücreleri içerir. Bu polarize organizasyon aynı organoid bir 2D optik bölümünden takdir etmek zordur.3D bilgi olmadan yorumlanması imkansız karmaşık bir yapının başka bir örnek insan karaciğer organoidlerin safra sıvısı toplama kolaylaştırmak MRP2 pozitif kanaliculi ağıdır. Ayrıca elde edilen kalite ve çözünürlük yarı otomatik segmentasyon ve görüntü analizine olanak sağlar. Böylece, toplam hücre sayıları ve belirteçlerin varlığı tüm organoidlerde belirli hücresel alt tiplerde ölçülebilir.140 hücre içeren tüm bir organoidin çekirdeklerini bölerek, Ki67 hücre döngüsü belirteci için yüksek pozitiflik gösteren üç hücre tanımlanabilir. Optik temizleme ajanı, FUnGI, bir organoid içinde derin floresan sinyal kalitesinde belirsiz ve fruktoz-gliserol temizleme daha iyi performans gösterir. FUnGI ile temizlenmiş organoidler, belirsiz organoidlere kıyasla genel olarak gelişmiş floresan yoğunluğu nu gösterir.Numunede kalan herhangi bir BME'nin antikor penetrasyonunun azalmasına yol açabileceğini ve yüksek arka plan sinyaline yol açabileceğini unutmayın. Buna ek olarak, kistik organoidler çökmeleri halinde optik olarak temizlenmemelidir. Protokole hafif adaptasyonlar ile, örnekler süper çözünürlüklü konfokal, multi foton ve ışık sayfası mikroskopisi ile kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Üç boyutlu Hücre ekimi için Chip-ölçekli Yapı iskeleleri mikroimalat

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Tek Hücre Elektroporasyon bozulmamış Gelişmekte olan beyin içindeki in vivo

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Bitki damarları ve Üç Boyutlu Yapı ve Fonksiyon Visualize&#39;a Yüksek Çözünürlüklü Bilgisayarlı Tomografi Kullanımı

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Üç boyutlu Hidrojeller içinde Görüntüleme FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

KÜBİK Protokol Tüm Dağı Cilt Hazırlıkları Tek Hücre çözünürlükte Protein Anlatım Görseller

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Üç boyutlu Süper İnterferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi F-aktin Filament Çözünürlük Mikroskobu (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

Yüksek çözünürlüklü Solunum permeabilize ve bozulmamış Hücreleri Mitokondrial fonksiyonu değerlendirmek için

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...