Name: 3d multicolor dna fish tool to study nuclear architecture in human primary cells
Uploaded: 2020-01-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells at JoVE.com

De auteurs erkennen de technische bijstand van de INGM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM), Milaan, Italië), in het bijzonder C. Cordiglieri, voor hulp bij 3D multicolor DNA FISH-beelden Verwerving. Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies aan B.B.: EPIGEN Italiaans vlaggenschipprogramma, Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon, grant nr 18754) en Giovani Ricercatori, Italiaans ministerie van Volksgezondheid (GR-2011-02349383). Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidie aan F.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321).

1. DNA-sondevoorbereidings- en etiketteringsprocedures met nick-vertaling
<ol><li>Zuiveren en reinigen van bacteriële kunstmatige chromosomen (BACs), plasmiden of PCR producten met specifieke kits (Tabel van materialen), resuspend in ddH2O, controleren door elektroforese op een agarose gel en kwantificeren.</li>
	<li>Voer nick vertaling op 1,5−2 μg DNA uit stap 1.1 in een laatste volume van 50 μL door het mengen van alle reagentia in een 0,5 mL lage binding S-buis volgens tabel ...

<ol>
	<li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+territories,+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells.">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture.">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li><li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+3D+genome.">Organization and function of the 3D genome.</a> Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).</li><li>van Steensel, B., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+transcription+in+shaping+the+spatial+organization+of+the+genome.">The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).</li><li>Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+genome+organization+and+cognition.">Spatial genome organization and cognition.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).</li><li>Pombo, A., Dillon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+genome+architecture:+players+and+mechanisms.">Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).</li><li>Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+contact+permits+transcription+between+coregulated+genes.">Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes.</a> Cell. 155 (3), 606-620 (2013).</li><li>Therizols, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+decondensation+is+sufficient+to+alter+nuclear+organization+in+embryonic+stem+cells.">Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells.</a> Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).</li><li>Gonzalez-Sandoval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinuclear+Anchoring+of+H3K9-Methylated+Chromatin+Stabilizes+Induced+Cell+Fate+in+C.+elegans+Embryos.">Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos.</a> Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).</li><li>Hubner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+nuclear+landscapes+during+human+myelopoietic+cell+differentiation+maintains+co-aligned+active+and+inactive+nuclear+compartments.">Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).</li><li>Aymard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+long-range+contacts+unveils+clustering+of+DNA+double-strand+breaks+at+damaged+active+genes.">Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).</li><li>Sellou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poly(ADP-ribose)-dependent+chromatin+remodeler+Alc1+induces+local+chromatin+relaxation+upon+DNA+damage.">The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).</li><li>Krijger, P. H., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome.">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).</li><li>Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+TADs:+How+Alterations+of+Chromatin+Domains+Result+in+Disease.">Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease.</a> Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).</li><li>Cortesi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4q-D4Z4+chromatin+architecture+regulates+the+transcription+of+muscle+atrophic+genes+in+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy.">4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy.</a> Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).</li><li>Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+and+divergence+of+regulatory+strategies+at+Hox+Loci+and+the+origin+of+tetrapod+digits.">Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits.</a> PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).</li><li>Woltering, J. M., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrapod+axial+evolution+and+developmental+constraints;+Empirical+underpinning+by+a+mouse+model.">Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model.</a> Mechanisms of Development. 138, 64-72 (2015).</li><li>de Laat, W., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3C-based+technologies+to+study+the+shape+of+the+genome.">3C-based technologies to study the shape of the genome.</a> Methods. 58 (3), 189-191 (2012).</li><li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+decade+of+3C+technologies:+detailed+insights+into+nuclear+organization.">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes &amp; Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li><li>Finn, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Heterogeneity+and+Intrinsic+Variation+in+Spatial+Genome+Organization.">Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization.</a> Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).</li><li>Zheng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+chromatin+interactions+with+single-molecule+precision.">Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision.</a> Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).</li><li>Solovei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+on+tissue+cryosections.">Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections.</a> Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).</li><li>Cremer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+3D+fluorescence+in+situ+hybridization+for+imaging+interphase+chromosomes.">Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+three-dimensional+localization+microscopy+across+large+volumes.">High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes.</a> Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).</li><li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT.">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+genomic+loci+in+living+human+cells+by+an+optimized+CRISPR/Cas+system.">Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system.</a> Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).</li><li>Nelles, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+RNA+Tracking+in+Live+Cells+with+CRISPR/Cas9.">Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9.</a> Cell. 165 (2), 488-496 (2016).</li><li>Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifaceted+FISH+approach+to+study+endogenous+RNAs+and+DNAs+in+native+nuclear+and+cell+structures.">A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures.</a> Current Protocol of Human Genetics. , 15 (2013).</li><li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).</li><li>Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+nuclear+positioning+of+the+monoallelically+expressed+astrocyte+marker+GFAP.">Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP.</a> Genes &amp; Development. 22 (4), 489-498 (2008).</li><li>Kraus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+structured+illumination+microscopy+of+nuclear+structures.">Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures.</a> Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).</li><li>Solovei, I., Cremer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-FISH+on+cultured+cells+combined+with+immunostaining.">3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).</li><li>Skinner, B. M., Johnson, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+morphologies:+their+diversity+and+functional+relevance.">Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance.</a> Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).</li><li>Schoenfelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pluripotent+regulatory+circuitry+connecting+promoters+to+their+long-range+interacting+elements.">The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements.</a> Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).</li><li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling.">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).</li><li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+super-resolution+imaging+of+chromosomes+and+in+situ+haplotype+visualization+using+Oligopaint+FISH+probes.">Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes.</a> Nature Communication. 6, 7147 (2015).</li><li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+design+and+synthesis+platform+for+visualizing+genomes+with+Oligopaint+FISH+probes.">Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).</li><li>Samacoits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+framework+to+study+sub-cellular+RNA+localization.">A computational framework to study sub-cellular RNA localization.</a> Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).</li><li>Cardozo Gizzi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy-Based+Chromosome+Conformation+Capture+Enables+Simultaneous+Visualization+of+Genome+Organization+and+Transcription+in+Intact+Organisms.">Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms.</a> Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).</li><li>Mateo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+DNA+folding+and+RNA+in+embryos+at+single-cell+resolution.">Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution.</a> Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).</li><li>Nir, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Walking+along+chromosomes+with+super-resolution+imaging,+contact+maps,+and+integrative+modeling.">Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling.</a> PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).</li><li>Bintu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+chromatin+tracing+reveals+domains+and+cooperative+interactions+in+single+cells.">Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li></ol>

De huidige methode beschrijft een stap voor stap protocol om 3D multicolor DNA FISH uit te voeren op een breed scala van menselijke primaire cellen. Hoewel DNA FISH een technologie is in breed gebruik, is 3D-multicolor DNA VIS op bewaarde 3D-interfasekernen nog steeds moeilijk uit te voeren in veel laboratoria, voornamelijk vanwege de kenmerken van de gebruikte monsters23,24.
Probe nick vertaling is een fundamentele stap voor succesvol...

Hogere eukaryoten moeten systematisch condenseren en compacteen enorme hoeveelheid genetische informatie in de minuut 3D-ruimte van de kern1,2,3,4. Vandaag de dag weten we dat het genoom ruimtelijk wordt geordend in compartimenten en topologische geassocieerde domeinen5 en dat de vele niveaus van DNA vouwen contacten genereren tussen verschillende genomische regio's die chromatine lusvorming kunnen betrekken6,7. De 3D dynamische lus van chromatine kan invloed hebben op veel verschillende biologische processen, zoals transcriptie8,9, differentiatie en ontwikkeling10,11, DNA-reparatie12,13, terwijl de verstoringen zijn betrokken bij verschillende ziekten14,15,16 en ontwikkelingsfouten15,17,18.
Er zijn veel benaderingen ontwikkeld om de 3D-genoomorganisatie te bestuderen. Chromosoom conformatie capture-gebaseerde technologieën (C-technologieën, 3C, 4C, 5C, Hi-C en derivaten) zijn ontwikkeld om genoom organisatie te bestuderen in vaste cellen3,4,19,20. Dergelijke benaderingen zijn gebaseerd op de mogelijkheid om de contactfrequenties tussen genomische loci in fysieke nabijheid vast te leggen. C-technologieën, afhankelijk van hun complexiteit, vangen de wereldwijde 3D-genoomorganisatie en nucleaire topologie van een celpopulatie3,4,19,20. Niettemin zijn 3D-interacties dynamisch in tijd en ruimte, zeer variabel tussen individuele cellen bestaande uit multiplex interacties, en zijn op grote schaal heterogeen21,22.
3D multicolor DNA fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is een techniek die het mogelijk maakt de visualisatie van specifieke genomic loci op een cell niveau, waardoor direct onderzoek van de 3D nucleaire architectuur op een complementaire manier aan C-technologieën. Het vertegenwoordigt een technologie die momenteel wordt gebruikt om c-resultaten ondubbelzinnig te valideren. 3D multicolor DNA FISH maakt gebruik van fluorescerende gelabelde sondes die complementair zijn aan de genomische loci van belangen. Het gebruik van verschillende fluorophores en geschikte microscopieapparatuur maken het mogelijk om meerdere doelen binnen de nucleaire ruimte23,24, op een eigentijdse manier te visualiseren. In de afgelopen jaren is FISH gecombineerd met technologische vooruitgang in microscopie om de visualisatie van fijnschaalstructuren te verkrijgen bij hoge resolutie25,26 of met CRISPR-Cas benaderingen voor de visualisatie van de nucleïnezuren in live imaging27,28. Ondanks de brede adoptie wordt de 3D-multicolor DNA FISH-benadering in veel laboratoria nog steeds als moeilijk beschouwd omdat het gebruikte biologische materiaal moet worden aangepast.
Hier bieden we een uitgebreid protocol voor 3D-multicolor DNA FISH (van cel/sondevoorbereiding tot data-analyse) die van toepassing is op een breed scala aan menselijke primaire cellen, waardoor de visualisatie van meerdere genomische loci mogelijk is en de 3D-structuur van kernen behouden blijft. Om de nucleaire architectuur te bestuderen, moet de 3D-structuur van kernen behouden blijven. Om deze reden vermijden we, in tegenstelling tot andere bestaande protocollen29,30,31, het gebruik van een alcoholgradiënt en de opslag van de afdekkingen in alcohol die chromatinestructuur32kunnen beïnvloeden . De methode is aangepast van bewaarde 3D DNA FISH protocollen24,33 die moeten worden toegepast op een breed scala van menselijke primaire cellen, zowel geïsoleerd ex vivo of gekweekt in vitro. Er zijn permeabilisatie- en deproteinisatieparameters voor verschillende nucleaire morfologie en cytologische kenmerken (bijvoorbeeld verschillende graden van nucleaire verdichting, cytoskeletovervloed)34. Deze parameters worden vaak over het algemeen beschreven in andere protocollen24,33, zonder een duidelijke discriminatie van de procedure binnen verschillende celtypen. Verder hebben we een specifiek instrument ontwikkeld genaamd NuCLεD (nuclear contacts locator in 3D)16, die principes biedt voor data-analyse die de 3D-nabijheid tussen verschillende loci en hun nucleaire topologische distributie binnen de nucleaire ruimte op een geautomatiseerde manier zullen verbeteren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin 488</td>
			<td>DBA</td>
			<td>DI7488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin 11 d-UTP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverlsips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>117500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CY3 d-UTP</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA53022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D21490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate (powder)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-203917A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin 11 d-UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093088910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21969-035 500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18010-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AMPD1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (C-G-A-T)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>BL0423A/C/G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644.2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Hyclone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutammine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15279-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278-5 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennycillin/Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070-063 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>P6887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhasePrep BAC DNA Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NA0100-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Gel Extraction &#38; PCR Purification Combo Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K220001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K210010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubbercement</td>
			<td>Bostik</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidina Alexa fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S21374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1110379026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d multicolor dna fish tool to study nuclear architecture in human primary cells

Een belangrijke vraag in de celbiologie is genomische organisatie binnen de nucleaire ruimte en hoe chromatinearchitectuur processen zoals genexpressie, celidentiteit en differentiatie kan beïnvloeden. Veel benaderingen ontwikkeld om de 3D-architectuur van het genoom te bestuderen, kunnen worden onderverdeeld in twee complementaire categorieën: chromosoom-conformatie capture gebaseerde technologieën (C-technologieën) en beeldvorming. Terwijl de eerste is gebaseerd op het vastleggen van de chromosoom-conformatie en proximale DNA-interacties in een populatie van vaste cellen, de laatste, gebaseerd op DNA fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) op 3D-bewaarde kernen, maakt hedendaagse visualisatie van meerdere loci op een enkelcelniveau (veelkleurig), het onderzoeken van hun interacties en distributie binnen de kern (3D multicolor DNA FISH). De techniek van 3D multicolor DNA FISH heeft een beperking van het visualiseren van slechts een paar vooraf bepaalde loci, niet toestaan dat een uitgebreide analyse van de nucleaire architectuur. Echter, gezien de robuustheid van de resultaten, 3D multicolor DNA FISH in combinatie met 3D-microscopie en beeldreconstructie is een mogelijke methode om C-technologie gebaseerde resultaten te valideren en ondubbelzinnig de positie en organisatie van specifieke loci te bestuderen op één celniveau. Hier stellen we een stapsgewijze methode voor van 3D multicolor DNA FISH die geschikt is voor een breed scala aan menselijke primaire cellen en bespreken we alle praktische acties, cruciale stappen, noties van 3D-beeldvorming en data-analyse die nodig zijn om een succesvolle en informatieve 3D-multicolor te verkrijgen DNA VIS binnen verschillende biologische contexten.

De methode van 3D multicolor DNA FISH beschreven in dit artikel maakt hedendaagse visualisatie van verschillende genomische loci binnen bewaard 3D-kernen(Figuur 1B) mogelijk. Dit protocol maakt het mogelijk afstanden tussen allelen en verschillende genomic loci meten te meten om de ruimtelijke nabijheid ervan te evalueren en de ligging ervan in de nucleaire ruimte te beoordelen (bijvoorbeeld loci-afstand van de centroid of de periferie van de kernen)16</sup...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells at JoVE.com

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

3D multicolor DNA FISH vertegenwoordigt een hulpmiddel om meerdere genomische loci binnen 3D bewaarde kernen te visualiseren, ondubbelzinnig definiëren d.m.v. hun wederzijdse interacties en lokalisatie binnen de nucleaire ruimte op één celniveau. Hier wordt een stap voor stap protocol beschreven voor een breed spectrum van menselijke primaire cellen.

3D Multicolor DNA FISH Tool om nucleaire architectuur in menselijke primaire cellen te bestuderen

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...

3D multicolor DNA FISH maakt het mogelijk om meerdere genomische loci binnen bewaarde kernen te visualiseren om hun wederzijdse interactie en lokalisatie op eencellig niveau te definiëren. 3D multicolor DNA FISH maakt het directe onderzoek van de nucleaire architectuur mogelijk. In het algemeen werkt het in combinatie met op chromosoom vastgelegde technologieën die de techniek een beschikbaar hulpmiddel maken voor C-gegevensvalidatie binnen enkele cellen.Het aantonen van de procedure zal Federica Marasca zijn. Ze is postdoc in mijn laboratorium. Begin met het uitbroeden van de nick vertaling mix in een thermische mixer op 16 graden Celsius volgens de lengte van het beginnende DNA-materiaal.Controleer aan het einde van de incubatie de grootte van de sondes op een 2,2%agarose gel. Voor elk DNA FISH-experiment moet de juiste hoeveelheid sonde worden neergeslagen volgens het uitgangs-DNA-materiaal waaruit de sondes zijn geproduceerd in 150 microliters dubbel gedestilleerd water; 20 microgram ongelabeld zalm sperma DNA, 3,5 microgram soort specifieke Cot-1 DNA, drie volumes van 100% ethanol, en een 1/10e volume van drie molar natriumacetaat gedurende een uur bij min 80 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, centrifugeren het monster op maximale snelheid gedurende een uur op vier graden Celsius.Na het weggooien van de supernatant, was de pellet twee keer met 500 microliters van 70% ethanol. Na de tweede wasbeurt, resuspend de pellet in twee microliters van 100%formamide en schud de sonde gedurende 30 minuten bij 40 graden Celsius alvorens een gelijk volume van 4x zout natriumcitraat toe te voegen in 20% dextranulfaat. Voor de fixatie voorbehandeling en permeabilisatie van kleine cellen met kleine kernen en een lage hoeveelheid cytoplasma, voeg eerst twee keer 10 aan de zesde cellen in 200 microliters van PBS direct op glaskappen in individuele putten van een 24-put plaat en laat de cellen om zich te vestigen voor 30 minuten bij kamertemperatuur.Vervang aan het einde van de incubatie snel de PBS door 300 microliter vers bereide 4%paraformaldehyde aangevuld met 0,1%Tween 20. Na 10 minuten was je de vaste cellen drie keer in 300 microliters van 0,05%TPBS gedurende vijf minuten per wasbeurt bij kamertemperatuur. Na de laatste wasbeurt, permeabiliseren de T-cellen met 300 microliters van 0,5%TPBS gedurende 10 minuten op kamertemperatuur voor de behandeling van de cellen met 250 microliters per put van RNAse cocktail verdund 1:100 in PBS gedurende een uur op 37 graden Celsius.Aan het einde van de incubatie, spoel de cellen in 300 microliter van PBS en voeg 300 microliters van 20%glycerol in PBS aan elke put met een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius. De volgende ochtend, plaats het glas op droog ijs voor 15 tot 30 seconden om de cellen te bevriezen alvorens geleidelijk ontdooien van de monsters bij kamertemperatuur en weken ze in 300 microliters van 20%glycerol in PBS gedurende 30 seconden. Na het bevriezen/ontdooien van de cellen nog drie keer zoals net aangetoond, was de monsters in 300 microliters van 0,5%TPBS gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door twee wasbeurten in 300 microliter van 0,05%TPBS gedurende vijf minuten per wasbeurt bij kamertemperatuur.Behandel de cellen na de laatste wasbeurt gedurende 12 minuten bij kamertemperatuur met 300 microliter van 0,1 normaal zoutzuur, gevolgd door twee spoelingen in 300 microliter zoutnatriumcitraat. Bevestig vervolgens de monsters 's nachts in 300 microliters van 50% formamide in 2X zout natriumcitraat bij kamertemperatuur. Voor de fixatie, voorbehandeling en permeabilisatie van grote cellen met een hoge hoeveelheid cytoplasma, fix, pre-treat en permeabilize de cellen op dezelfde manier als aangetoond voor menselijke primaire T-cellen en behandelen de monsters met 300 microliter van 0,0025%pepsine in 0,01 normale zoutzuur gedurende een paar seconden tot vijf minuten.Observeer de cellen onder een optische microscoop en stop de reactie met twee vijf minuten wasbeurten in 300 microliter van 50 millimolar magnesiumchloride zodra de kernen vrij zijn van het cytoplasma, maar de kernen zijn nog steeds zichtbaar en intact. Voor 3D multicolor DNA FISH, denature de hybridisatie sondes op 80 graden Celsius gedurende vijf minuten en onmiddellijk plaats de sondes op ijs. Laad de sondes op een schone microscoopdia en plaats één coverslip van cellen op elke druppel sonde.Verzegel de randen van de coverslip met rubbercement. Wanneer het cement volledig is gedroogd, denatureren de monsters op een 75 graden Celsius verwarming blok. Na vier minuten, hydridize de monsters op 37 graden Celsius 's nachts in een metalen doos drijvend in een waterbad.De volgende ochtend, schil het rubbercement en met de glijbanen ondergedompeld in 2X zout natrium citraat voorzichtig til de coverslips. Plaats elke coverslip in individuele putten van een zes-put plaat met twee milliliter verse zout natrium citraat per put voor twee vijf minuten wast op 37 graden Celsius met schudden op 90 omwentelingen per minuut. Spoel de covers aan het einde van de incubatie kort in twee milliliters van 0,2%Tween 20 in 4X zout natriumcitraat.Voor 3D multicolor DNA FISH detectie, breng de coverslips in individuele putten van een nieuwe 24-well plaat en blokkeer elke niet-specifieke binding in 300 microliters van het blokkeren buffer gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius en 20 omwentelingen per minuut. Behandel de monsters aan het einde van de incubatie met de juiste concentratie anti-digoxigenine en/of streptavidin die gedurende 35 minuten in een donkere en natte kamer bij 37 graden Celsius wordt verdund in een blokkeerbuffer. Breng aan het einde van de incubatie de monsters over op afzonderlijke putten van een zesputige plaat en was de monsters drie keer in twee milliliters van 0,2% Tween 20 en 4X zout natriumcitraat gedurende vijf minuten per wasbeurt met schudden bij 90 omwentelingen per minuut.Na de laatste wasbeurt, equilibrate de monsters in twee milliliter PBS alvorens de covers over te brengen naar een nieuwe 24-well plaat voor nabevestigen in 300 microliters van 2% formaldehyde in PBS per put gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Was de vaste cellen vijf keer kort in 300 microliter pbs, gevolgd door vlekken met DAPI verdund op een nanogram per milliliter in 300 microliter PBS gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Was de covers nog vijf keer in PBS en monteer de monsters met een geschikt montagemedium.Dan verwerven 3D-beelden met een microscoop systeem. 3D multicolor DNA FISH maakt de hedendaagse visualisatie van verschillende genomische loci binnen bewaarde 3D-kernen mogelijk. Voor dna-sonde voorbereiding, een sonde grootte van minder dan 200 basisparen zorgt voor een succesvolle 3D multicolor DNA FISH procedure.Suboptimale DNA FISH sondes geproduceerd door nick vertaling kan gedeeltelijk of over verteerd. Over verteerde sondes zal resulteren in een niet-specifiek signaal als gevolg van een verlies van specificiteit in de hybridisatie en een daaruit voortvloeiende toename van de achtergrond. Voor menselijke primaire T-lymfocyten en kleine cellen met kleine kernen en een lage hoeveelheid cytoplasma wordt een normale behandeling van 0,1 minuut 0,1 aanbevolen om de toegankelijkheid van kernen voor de DNA-sondes te bevorderen en de nucleaire integriteit te behouden.Cytoplasmische pepsine spijsvertering is niet nodig om een DNA FISH goed signaal in kleine cellen te verkrijgen. Voor menselijke primaire myoblasten en cellen met grote kernen en overvloedig cytoplasma is de pepsinisatiestap echter fundamenteel. Een korte en suboptimale cytoskelet pepsinization zal belemmeren de binnenkomst van de sonde in de kernen eindigend bij afwezigheid van een DNA FISH signaal.Echter, als de cellen zijn meer dan pepsinized, zullen de kernen niet intact blijven verliezen hun 3D-structuur. Een succesvolle 3D multicolor DNA FISH zal resulteren in de aanwezigheid van signaal in de kernen. Ik stel voor om te werken met vers biologisch materiaal, het testen van sondes voor het uitvoeren van de 3D multicolor DNA FISH, het voorbereiden van nieuwe oplossingen en nauwkeurig zijn met incubatietijden en de temperaturen.Vergeet niet dat formamide en HCL gevaarlijke stoffen zijn en altijd moeten worden gebruikt in een chemische rookkap met geschikte wegwerpmaterialen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallel Meting van de circadiane klok genexpressie en hormoon in Human primaire celculturen

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Engineering Kunstmatige Factoren om specifiek manipuleren alternatieve splitsing in menselijke cellen

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation om te studeren In Vivo cellulaire reacties op eenvoudige en complexe DNA-schade

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunokleuring voor DNA wijzigingen: computationele analyse van Confocal beelden

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq Assay met lage mitochondriaal DNA besmetting van primaire menselijke CD4 + T lymfocyten

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Verbeterde gist One-hybride schermen te identificeren van de transcriptiefactor binden aan menselijke DNA-sequenties

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-Locus variabele-nummer tandem-herhaling analyse van de vis-pathogene bacterie Yersinia ruckeri door multiplex PCR en capillaire elektroforese

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

Navigeren MARRVEL, een web-based tool die Human Genomics en model organisme genetica informatie integreert

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In vivo functionele studie van ziekten-geassocieerde zeldzame menselijke varianten met behulp van Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Karakterisering van in vitro differentiatie van de menselijke primaire keratinocyten door RNA-Seq Analyse

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...