Name: 3d multicolor dna fish tool to study nuclear architecture in human primary cells
Uploaded: 2020-01-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells at JoVE.com

लेखक 3डी मल्टीकलर डीएनए फिश छवियों के दौरान सहायता के लिए विशेष रूप से सी कॉर्डिग्नेरी में इंग्म इमेजिंग फैसिलिटी (इस्टूटो नाजिओनेल डी जेनेटिका मोल्कोलारे "रोमियो एड एनरिका इनवर्नेज़ी" (INGM), मिलान, इटली की तकनीकी सहायता स्वीकार करते हैं अधिग्रहण. इस काम को बी बी को निम्नलिखित अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया है: एपिजेन इतालवी फ्लैगशिप प्रोग्राम, एसोसिएशन फ्रैंकोइस कॉन्ट्रे लेस मायोपैथीज (एएफएम-टेलीथॉन, ग्रांट एनआर 18754) और जियोवानी राइसरकाटोरी, इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय (जीआर-2011-02349383)। इस काम को F.M.: फोंडाजिओन कैरिप्लो (बंदो जियोवानी, अनुदान एनआर 2018-0321) को निम्नलिखित अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है।

1. डीएनए जांच की तैयारी और निक अनुवाद के साथ लेबलिंग प्रक्रियाओं
<ol><li>बैक्टीरियल कृत्रिम गुणसूत्रों (BACs), प्लाज्मिड या पीसीआर उत्पादों को विशिष्ट किट(सामग्री की तालिका)के साथ शुद्ध और साफ करें, डीड?...

<ol>
	<li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+territories,+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells.">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture.">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li><li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+3D+genome.">Organization and function of the 3D genome.</a> Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).</li><li>van Steensel, B., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+transcription+in+shaping+the+spatial+organization+of+the+genome.">The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).</li><li>Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+genome+organization+and+cognition.">Spatial genome organization and cognition.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).</li><li>Pombo, A., Dillon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+genome+architecture:+players+and+mechanisms.">Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).</li><li>Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+contact+permits+transcription+between+coregulated+genes.">Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes.</a> Cell. 155 (3), 606-620 (2013).</li><li>Therizols, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+decondensation+is+sufficient+to+alter+nuclear+organization+in+embryonic+stem+cells.">Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells.</a> Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).</li><li>Gonzalez-Sandoval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinuclear+Anchoring+of+H3K9-Methylated+Chromatin+Stabilizes+Induced+Cell+Fate+in+C.+elegans+Embryos.">Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos.</a> Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).</li><li>Hubner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+nuclear+landscapes+during+human+myelopoietic+cell+differentiation+maintains+co-aligned+active+and+inactive+nuclear+compartments.">Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).</li><li>Aymard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+long-range+contacts+unveils+clustering+of+DNA+double-strand+breaks+at+damaged+active+genes.">Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).</li><li>Sellou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poly(ADP-ribose)-dependent+chromatin+remodeler+Alc1+induces+local+chromatin+relaxation+upon+DNA+damage.">The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).</li><li>Krijger, P. H., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome.">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).</li><li>Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+TADs:+How+Alterations+of+Chromatin+Domains+Result+in+Disease.">Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease.</a> Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).</li><li>Cortesi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4q-D4Z4+chromatin+architecture+regulates+the+transcription+of+muscle+atrophic+genes+in+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy.">4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy.</a> Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).</li><li>Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+and+divergence+of+regulatory+strategies+at+Hox+Loci+and+the+origin+of+tetrapod+digits.">Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits.</a> PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).</li><li>Woltering, J. M., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrapod+axial+evolution+and+developmental+constraints;+Empirical+underpinning+by+a+mouse+model.">Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model.</a> Mechanisms of Development. 138, 64-72 (2015).</li><li>de Laat, W., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3C-based+technologies+to+study+the+shape+of+the+genome.">3C-based technologies to study the shape of the genome.</a> Methods. 58 (3), 189-191 (2012).</li><li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+decade+of+3C+technologies:+detailed+insights+into+nuclear+organization.">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes &amp; Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li><li>Finn, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Heterogeneity+and+Intrinsic+Variation+in+Spatial+Genome+Organization.">Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization.</a> Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).</li><li>Zheng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+chromatin+interactions+with+single-molecule+precision.">Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision.</a> Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).</li><li>Solovei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+on+tissue+cryosections.">Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections.</a> Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).</li><li>Cremer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+3D+fluorescence+in+situ+hybridization+for+imaging+interphase+chromosomes.">Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+three-dimensional+localization+microscopy+across+large+volumes.">High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes.</a> Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).</li><li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT.">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+genomic+loci+in+living+human+cells+by+an+optimized+CRISPR/Cas+system.">Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system.</a> Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).</li><li>Nelles, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+RNA+Tracking+in+Live+Cells+with+CRISPR/Cas9.">Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9.</a> Cell. 165 (2), 488-496 (2016).</li><li>Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifaceted+FISH+approach+to+study+endogenous+RNAs+and+DNAs+in+native+nuclear+and+cell+structures.">A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures.</a> Current Protocol of Human Genetics. , 15 (2013).</li><li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).</li><li>Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+nuclear+positioning+of+the+monoallelically+expressed+astrocyte+marker+GFAP.">Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP.</a> Genes &amp; Development. 22 (4), 489-498 (2008).</li><li>Kraus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+structured+illumination+microscopy+of+nuclear+structures.">Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures.</a> Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).</li><li>Solovei, I., Cremer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-FISH+on+cultured+cells+combined+with+immunostaining.">3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).</li><li>Skinner, B. M., Johnson, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+morphologies:+their+diversity+and+functional+relevance.">Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance.</a> Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).</li><li>Schoenfelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pluripotent+regulatory+circuitry+connecting+promoters+to+their+long-range+interacting+elements.">The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements.</a> Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).</li><li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling.">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).</li><li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+super-resolution+imaging+of+chromosomes+and+in+situ+haplotype+visualization+using+Oligopaint+FISH+probes.">Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes.</a> Nature Communication. 6, 7147 (2015).</li><li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+design+and+synthesis+platform+for+visualizing+genomes+with+Oligopaint+FISH+probes.">Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).</li><li>Samacoits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+framework+to+study+sub-cellular+RNA+localization.">A computational framework to study sub-cellular RNA localization.</a> Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).</li><li>Cardozo Gizzi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy-Based+Chromosome+Conformation+Capture+Enables+Simultaneous+Visualization+of+Genome+Organization+and+Transcription+in+Intact+Organisms.">Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms.</a> Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).</li><li>Mateo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+DNA+folding+and+RNA+in+embryos+at+single-cell+resolution.">Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution.</a> Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).</li><li>Nir, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Walking+along+chromosomes+with+super-resolution+imaging,+contact+maps,+and+integrative+modeling.">Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling.</a> PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).</li><li>Bintu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+chromatin+tracing+reveals+domains+and+cooperative+interactions+in+single+cells.">Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li></ol>

वर्तमान विधि मानव प्राथमिक कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला पर 3 डी बहुरंगी डीएनए मछली प्रदर्शन करने के लिए कदम प्रोटोकॉल द्वारा एक कदम का वर्णन करती है। हालांकि डीएनए मछली व्यापक उपयोग में एक तकनीक है...

उच्च यूकेरियोट्स को नाभिक1,2, 3,4के 3डी अंतरिक्ष में व्यवस्थित रूप से गाढ़ा और कॉम्पैक्ट करने की आवश्यकता होती है । आज, हम जानते हैं कि जीनोम को डिब्बों और टोपिलॉजिकल रूप से जुड़े डोमेन5 में स्थानिक रूप से आदेश दिया जाता है और डीएनए तह के कई स्तर विभिन्न जीनोमिक क्षेत्रों के बीच संपर्क उत्पन्न करते हैं जिसमें क्रोमेटिन लूप गठन6,7शामिल हो सकता है। क्रोमेटिन की 3डी डायनेमिक लूपिंग कई विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं जैसे ट्रांसक्रिप्शन8,9, विभेदन और विकास10,11,डीएनए मरम्मत12,13को प्रभावित कर सकती है, जबकि इसकी क्षोभ विभिन्न बीमारियों में शामिल हैं14,15,16 और विकासात्मक दोष15,17,18.
3डी जीनोम संगठन का अध्ययन करने के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। गुणसूत्र संरचना पर कब्जा आधारित प्रौद्योगिकियों (सी-टेक्नोलॉजीज, 3सी, 4C, 5C, हाय-सी और डेरिवेटिव) को फिक्स्ड कोशिकाओं3,4,19,20में जीनोम संगठन का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है । इस तरह के दृष्टिकोण भौतिक निकटता में जीनोमिक लोकी के बीच संपर्क आवृत्तियों पर कब्जा करने की क्षमता पर आधारित हैं। सी-टेक्नोलॉजीज, उनकी जटिलता के आधार पर, वैश्विक 3 डी जीनोम संगठन और एक सेल जनसंख्या3,4,19,20के परमाणु टोपोलॉजी को पकड़ते हैं। फिर भी, 3 डी इंटरैक्शन समय और स्थान में गतिशील होते हैं, मल्टीप्लेक्स इंटरैक्शन से मिलकर व्यक्तिगत कोशिकाओं के बीच अत्यधिक परिवर्तनशील होते हैं, और बड़े पैमाने पर विषम21,22होते हैं।
सीटू संकरण (मछली) में 3डी बहुरंगी डीएनए फ्लोरेसेंस एक तकनीक है जो एक ही कोशिका स्तर पर विशिष्ट जीनोमिक लोकी के दृश्य की अनुमति देती है, जिससे सी-प्रौद्योगिकियों के पूरक तरीके से 3डी परमाणु वास्तुकला की सीधी जांच सक्षम होती है। यह वर्तमान में सी-परिणामों को स्पष्ट रूप से मान्य करने के लिए उपयोग की जाने वाली तकनीक का प्रतिनिधित्व करता है। 3 डी बहुरंगी डीएनए मछली फ्लोरोसेंटी लेबल जांच का उपयोग करता है जो हितों के जीनोमिक लोकी के पूरक हैं। विभिन्न फ्लोरोफोरस और उपयुक्त माइक्रोस्कोपी उपकरणों के उपयोग से परमाणु अंतरिक्ष23,24के भीतर कई लक्ष्यों के समकालीन दृश्य की अनुमति मिल जाती है । हाल के वर्षों में, मछली को माइक्रोस्कोपी में तकनीकी प्रगति के साथ जोड़ा गया है ताकि लाइव इमेजिंग27,28में न्यूक्लिक एसिड के दृश्य के लिए उच्च संकल्प25,26 या CRISPR-कैस दृष्टिकोणों पर ठीक पैमाने की संरचनाओं का दृश्य प्राप्त किया जा सके। व्यापक गोद लेने के बावजूद, 3 डी बहुरंगी डीएनए मछली दृष्टिकोण अभी भी कई प्रयोगशालाओं में मुश्किल माना जाता है क्योंकि जैविक सामग्री का इस्तेमाल किया अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
यहां, हम मानव प्राथमिक कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू 3डी बहुरंगी डीएनए मछली (सेल/जांच तैयारी से डेटा विश्लेषण तक) के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जिससे कई जीनोमिक लोकी के दृश्य को सक्षम किया जा सकता है और न्यूक्लिकी की 3डी संरचना को संरक्षित किया जा सकता है । परमाणु वास्तुकला का अध्ययन करने के लिए, नाभिक की 3 डी संरचना को संरक्षित किया जाना चाहिए। इस कारण से, अन्य मौजूदा प्रोटोकॉल29,30,31के विपरीत, हम अल्कोहल ढाल के उपयोग और अल्कोहल में कवरस्लिप के भंडारण से बचते हैं जो क्रोमेटिन संरचना32को प्रभावित कर सकता है। विधि संरक्षित 3 डी डीएनए मछली प्रोटोकॉल24,33 से अनुकूलित किया जाता है मानव प्राथमिक कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जाना है, दोनों अलग पूर्व वीवो या विट्रो में सुसंस्कृत । विभिन्न परमाणु आकृति विज्ञान और साइटोलॉजिकल विशेषताओं (जैसे, परमाणु कॉम्पैक्टेशन की विभिन्न डिग्री, साइटोस्केलेटन बहुतायत)34के लिए पार्मेबिलाइजेशन और डिप्रोटीनाइजेशन पैरामीटर हैं। इन मापदंडों को अक्सर अन्य प्रोटोकॉल24,33में वर्णित किया जाता है, विभिन्न सेल प्रकारों के भीतर प्रक्रिया का स्पष्ट भेदभाव प्रदान किए बिना। इसके अलावा, हमने 16 में NuCLεD (3D में परमाणु संपर्क लोकेटर)16नाम का एक विशिष्ट उपकरण विकसित किया है, जो डेटा विश्लेषण के लिए सिद्धांत प्रदान करता है जो स्वचालित तरीके से परमाणु अंतरिक्ष के भीतर विभिन्न लोकी और उनके परमाणु स्थलीय वितरण के बीच 3डी निकटता में सुधार करेगा।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin 488</td>
			<td>DBA</td>
			<td>DI7488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin 11 d-UTP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverlsips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>117500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CY3 d-UTP</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA53022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D21490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate (powder)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-203917A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin 11 d-UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093088910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21969-035 500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18010-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AMPD1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (C-G-A-T)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>BL0423A/C/G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644.2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Hyclone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutammine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15279-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278-5 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennycillin/Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070-063 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>P6887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhasePrep BAC DNA Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NA0100-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Gel Extraction &#38; PCR Purification Combo Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K220001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K210010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubbercement</td>
			<td>Bostik</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidina Alexa fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S21374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1110379026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d multicolor dna fish tool to study nuclear architecture in human primary cells

सेल जीव विज्ञान में एक बड़ा सवाल परमाणु अंतरिक्ष के भीतर जीनोमिक संगठन है और कैसे क्रोमेटिन वास्तुकला जीन अभिव्यक्ति, सेल पहचान और भेदभाव जैसी प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकता है। जीनोम के 3डी वास्तुकला का अध्ययन करने के लिए विकसित कई दृष्टिकोणों को दो पूरक श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है: गुणसूत्र संरचना कैप्चर आधारित प्रौद्योगिकियों (सी-टेक्नोलॉजीज) और इमेजिंग। जबकि पूर्व निश्चित कोशिकाओं की आबादी में गुणसूत्र संरचना और समीपस्थ डीएनए बातचीत पर कब्जा करने पर आधारित है, बाद, 3 डी संरक्षित नाभिक पर सीटू संकरण (मछली) में डीएनए फ्लोरेसेंस के आधार पर, समकालीन दृश्य की अनुमति देता है एक ही कोशिका स्तर (बहुरंगी) पर कई लोकी, नाभिक (3 डी बहुरंगी डीएनए मछली) के भीतर उनकी बातचीत और वितरण की जांच करती है। 3 डी मल्टीकलर डीएनए फिश की तकनीक में केवल कुछ पूर्व निर्धारित लोकी की कल्पना करने की सीमा है, जो परमाणु वास्तुकला के व्यापक विश्लेषण की अनुमति नहीं देता है। हालांकि, इसके परिणामों की मजबूती को देखते हुए, 3डी-माइक्रोस्कोपी और छवि पुनर्निर्माण के संयोजन में 3डी बहुरंगी डीएनए मछली सी-प्रौद्योगिकी आधारित परिणामों को मान्य करने और विशिष्ट लोकी की स्थिति और संगठन का स्पष्ट रूप से अध्ययन करने के लिए एक संभावित तरीका है एक ही सेल स्तर पर। यहां, हम मानव प्राथमिक कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त 3डी बहुरंगी डीएनए मछली की चरण विधि के कदम से एक कदम का प्रस्ताव करते हैं और एक सफल और सूचनात्मक 3डी मल्टीकलर प्राप्त करने के लिए आवश्यक सभी व्यावहारिक कार्यों, महत्वपूर्ण कदमों, 3डी इमेजिंग की धारणाओं और डेटा विश्लेषण पर चर्चा करते हैं विभिन्न जैविक संदर्भों के भीतर डीएनए मछली।

इस लेख में वर्णित 3डी बहुरंगी डीएनए मछली की विधि संरक्षित 3 डी नाभिक(चित्रा 1बी)के भीतर विभिन्न जीनोमिक लोकी के समकालीन दृश्य की अनुमति देती है। यह प्रोटोकॉल एलील्स और विभिन्न जीनोमिक ?...

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3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

3डी मल्टीकलर डीएनए फिश 3डी संरक्षित नाभिक के भीतर कई जीनोमिक लोकी की कल्पना करने के लिए एक उपकरण का प्रतिनिधित्व करती है, जो एक ही कोशिका स्तर पर परमाणु अंतरिक्ष के भीतर उनकी पारस्परिक बातचीत और स्थानीयकरण को स्पष्ट रूप से परिभाषित करती है। यहां, मानव प्राथमिक कोशिकाओं के एक विस्तृत स्पेक्ट्रम के लिए कदम दर कदम प्रोटोकॉल वर्णित है।

मानव प्राथमिक कोशिकाओं में परमाणु वास्तुकला का अध्ययन करने के लिए 3डी बहुरंगी डीएनए मछली उपकरण

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...

3 डी मल्टीकलर डीएनए फिश संरक्षित नाभिक के भीतर कई जीनोमिक लोकी के दृश्य को एकल कोशिका स्तर पर उनकी पारस्परिक बातचीत और स्थानीयकरण को अस्पष्ट रूप से परिभाषित करने में सक्षम बनाता है। 3 डी मल्टीकलर डीएनए फिश परमाणु वास्तुकला की सीधी जांच की अनुमति देता है। सामान्य तौर पर, यह गुणसूत्र कैप्चर-आधारित प्रौद्योगिकियों के साथ मिलकर काम करता है जिससे तकनीक एकल कोशिकाओं के भीतर सी डेटा सत्यापन के लिए एक उपलब्ध उपकरण बना रही है।प्रक्रिया का प्रदर्शन फेडरिका मारास्का होगा । वह मेरी प्रयोगशाला में एक पोस्टडॉक है। शुरू डीएनए सामग्री की लंबाई के अनुसार 16 डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मल मिक्सर में निक अनुवाद मिश्रण इनक्यूबेटिंग द्वारा शुरू करते हैं ।इनक्यूबेशन के अंत में, 2.2% एगर उठे जेल पर जांच के आकार की जांच करें। प्रत्येक डीएनए मछली प्रयोग के लिए, शुरू डीएनए सामग्री के अनुसार जांच की उचित मात्रा में उपजी जिसमें से जांच डबल आसुत पानी के १५० माइक्रोलीटर में उत्पादित किया गया, 20 माइक्रोग्राम अवेलेबल सामन शुक्राणु डीएनए, ३.५ माइक्रोग्राम प्रजातियां विशिष्ट खाट-1 डीएनए, १००% इथेनॉल की तीन मात्रा, और शून्य से ८० डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए तीन मोलर सोडियम एसीटेट की 1/10 वीं मात्रा । इनक्यूबेशन के अंत में, चार डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए अधिकतम गति से नमूना अपकेंद्रित्र ।सुपरनेट को छोड़ने के बाद, 70% इथेनॉल के 500 माइक्रोलीटर के साथ दो बार गोली धोएं। दूसरे धोने के बाद, 100% फॉर्मामाइड के दो माइक्रोलीटर में गोली को फिर से खर्च करें और 20% डेक्सट्रान सल्फेट में 4X नमकीन सोडियम साइट्रेट की बराबर मात्रा जोड़ने से पहले 40 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए जांच को हिलाएं। छोटे नाभिक और साइटोप्लाज्म की कम मात्रा के साथ छोटी कोशिकाओं के निर्धारण पूर्व उपचार और पारमेबिलाइजेशन के लिए, पहले पीबीएस के 200 माइक्रोलीटर में छठी कोशिकाओं में दो गुना 10 सीधे 24-अच्छी प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में ग्लास कवरलिप पर जोड़ें और कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें।इनक्यूबेशन के अंत में, जल्दी से 0.1% ट्वीन 20 के साथ पूरक हौसले से तैयार 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 300 माइक्रोलीटर के साथ पीबीएस की जगह। 10 मिनट के बाद, कमरे के तापमान पर प्रति धोने पांच मिनट के लिए 0.05% टीपीबीएस के 300 माइक्रोलीटर में तीन बार तय कोशिकाओं को धोएं। पिछले धोने के बाद, 37 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए पीबीएस में 1:100 पतला RNAse कॉकटेल के 250 माइक्रोलीटर प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं के इलाज से पहले कमरे के तापमान पर 0.5% TPBS के 300 माइक्रोलीटर के साथ टी कोशिकाओं को पार करें।इनक्यूबेशन के अंत में, पीबीएस के 300 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को कुल्ला करें और पीबीएस में 20% ग्लाइसरोल के 300 माइक्रोलीटर को चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेशन के साथ प्रत्येक कुएं में जोड़ें। अगली सुबह, कमरे के तापमान पर नमूनों को धीरे-धीरे विगलन करने से पहले कोशिकाओं को फ्रीज करने के लिए 15 से 30 सेकंड के लिए सूखी बर्फ पर ग्लास रखें और उन्हें 30 सेकंड के लिए पीबीएस में 20% ग्लाइसेरोल के 300 माइक्रोलीटर में भिगोने से पहले। फ्रीज के बाद/कोशिकाओं को तीन बार विगलन के रूप में सिर्फ प्रदर्शन किया, कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए ०.५% TPBS के ३०० माइक्रोलीटर में नमूने धोने, ०.०५% टीपीबीएस के ३०० माइक्रोलीटर में दो वॉश के बाद कमरे के तापमान पर धोने के प्रति पांच मिनट के लिए ।अंतिम धोने के बाद, कमरे के तापमान पर 12 मिनट के लिए 0.1 सामान्य हाइड्रोक्लोरिक एसिड के 300 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं का इलाज करें, इसके बाद खारा सोडियम साइट्रेट के 300 माइक्रोलीटर में दो कुल्ला करें। फिर कमरे के तापमान पर 2X खारा सोडियम साइट्रेट में 50% फॉर्ममाइड के 300 माइक्रोलीटर में रात भर नमूनों को ठीक करें। निर्धारण के लिए, पूर्व उपचार और साइटोप्लाज्म की एक उच्च राशि के साथ बड़ी कोशिकाओं के पारीपन, ठीक, पूर्व इलाज और कोशिकाओं को पार करने के रूप में मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं के लिए प्रदर्शन किया और ०.००२५% पेप्सिन के ३०० माइक्रोलीटर के साथ नमूनों का इलाज ०.०१ सामांय हाइड्रोक्लोरिक एसिड में कुछ सेकंड के लिए पांच मिनट तक ।एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें और 50 मिलीमोलर मैग्नीशियम क्लोराइड के 300 माइक्रोलीटर में दो पांच मिनट की वॉश के साथ प्रतिक्रिया को रोकें जैसे ही नाभिक साइटोप्लाज्म से मुक्त होता है लेकिन नाभिक अभी भी दिखाई देता है और बरकरार है। 3 डी मल्टीकलर डीएनए फिश के लिए, पांच मिनट के लिए ८० डिग्री सेल्सियस पर संकरण जांच विकृत और तुरंत बर्फ पर जांच जगह है । जांच को एक साफ माइक्रोस्कोप स्लाइड पर लोड करें और जांच की प्रत्येक बूंद पर कोशिकाओं के एक कवरस्लिप रखें।रबर सीमेंट के साथ कवरस्लिप किनारों को सील करें। जब सीमेंट पूरी तरह से सूख गया है, एक ७५ डिग्री सेल्सियस हीटिंग ब्लॉक पर नमूनों को विकृत । चार मिनट के बाद, पानी के स्नान में तैरते धातु के बक्से में रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को हाइड्रिडाइज करें ।अगली सुबह, रबर सीमेंट को छील लें और 2X नमकीन सोडियम साइट्रेट में डूबे स्लाइडों के साथ ध्यान से कवरस्लिप को उठाएं। प्रत्येक कवरलिप को छह-अच्छी तरह से प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में रखें जिसमें 25 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ताजा नमकीन सोडियम साइट्रेट के दो मिलीलीटर होते हैं, जो प्रति मिनट 90 क्रांतियों पर मिलाते हुए होते हैं। इनक्यूबेशन के अंत में, 4X खारा सोडियम साइट्रेट में 0.2% ट्वीन 20 के दो मिलीलीटर में कवरस्लिप संक्षेप में कुल्ला।3 डी मल्टीकलर डीएनए फिश डिटेक्शन के लिए, कवरस्लिप को एक नई 24-अच्छी प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में स्थानांतरित करें और 37 डिग्री सेल्सियस और प्रति मिनट 20 क्रांतियों पर 20 मिनट के लिए बफर को अवरुद्ध करने के 300 माइक्रोलीटर में किसी भी गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को अवरुद्ध करें। इनक्यूबेशन के अंत में, ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक अंधेरे और गीले कक्ष में ३५ मिनट के लिए बफर अवरुद्ध में पतला विरोधी digoxigenin और/या streptavidin की उचित एकाग्रता के साथ नमूनों का इलाज । इनक्यूबेशन के अंत में, नमूनों को छह-अच्छी प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में स्थानांतरित करें और नमूनों को 0.2% ट्वीन 20 और 4X नमकीन सोडियम साइट्रेट के दो मिलीलीटर में तीन बार 90 क्रांतियों प्रति मिनट पर मिलाते हुए प्रति धोने के लिए धोएं।अंतिम धोने के बाद, पीबीएस के दो मिलीलीटर में नमूनों को एक नई 24-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करने से पहले नमूनों को बराबर करें, जो कमरे के तापमान पर दो मिनट के लिए पीबीएस में 2% फॉर्मलडिहाइड के ३०० माइक्रोलीटर में फिक्सिंग के लिए है । PBS के ३०० माइक्रोलीटर में पांच बार संक्षेप में तय कोशिकाओं को धोएं, इसके बाद कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए पीबीएस के ३०० माइक्रोलीटर में एक नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर पर पतला DAPI के साथ धुंधला । पीबीएस में पांच बार कवरस्लिप धोएं और नमूनों को एक उपयुक्त बढ़ते माध्यम के साथ माउंट करें।फिर माइक्रोस्कोप सिस्टम के साथ 3D छवियों को प्राप्त करें। 3डी मल्टीकलर डीएनए फिश संरक्षित 3डी नाभिक के भीतर विभिन्न जीनोमिक लोकी के समकालीन दृश्य की अनुमति देता है। डीएनए जांच की तैयारी के लिए, २०० से कम आधार जोड़े का एक जांच आकार एक सफल 3 डी मल्टीकलर डीएनए मछली प्रक्रिया सुनिश्चित करता है ।निक अनुवाद द्वारा उत्पादित सबऑप्टिमल डीएनए फिश जांच आंशिक रूप से या अधिक पचा जा सकता है। उपाख्यानों पर जांच संकरण में विशिष्टता की हानि और पृष्ठभूमि की एक परिणामी वृद्धि के कारण एक गैर विशिष्ट संकेत में परिणामी होगा । मानव प्राथमिक टी लिम्फोसाइट्स और छोटे नाभिक और साइटोप्लाज्म की कम मात्रा वाली छोटी कोशिकाओं के लिए, डीएनए जांच के लिए नाभिक पहुंच को बढ़ावा देने और परमाणु अखंडता को बनाए रखने के लिए 12 मिनट 0.1 सामान्य हाइड्रोक्लोरिक एसिड उपचार की सिफारिश की जाती है।छोटी कोशिकाओं में डीएनए फिश अच्छा संकेत प्राप्त करने के लिए साइटोप्लाज्मिक पेप्सिन पाचन की आवश्यकता नहीं है। मानव प्राथमिक मायोब्लास्ट और कोशिकाओं के लिए जिनमें बड़े नाभिक और प्रचुर मात्रा में साइटोप्लाज्म होते हैं, हालांकि, पेप्सिनीकरण कदम मौलिक है। एक छोटे और उप-ोप्टिमल साइटोस्केलेटन पेप्सिनीकरण डीएनए फिश सिग्नल के अभाव में समाप्त होने वाले नाभिक की जांच के प्रवेश में बाधा उत्पन्न करेगा ।हालांकि, यदि कोशिकाएं पेप्सिनीकृत हो जाती हैं, तो नाभिक अपनी 3डी संरचना को खोने के लिए बरकरार नहीं रहेगा। एक सफल 3 डी मल्टीकलर डीएनए फिश के परिणामस्वरूप नाभिक के भीतर सिग्नल की उपस्थिति होगी। मैं ताजा जैविक सामग्री के साथ काम करने का सुझाव देता हूं, 3 डी मल्टीकलर डीएनए फिश करने से पहले जांच का परीक्षण करना, नए समाधान तैयार करना और इनक्यूबेशन बार और तापमान के साथ सटीक होना।याद रखें कि फॉर्ममाइड और एचसीएल खतरनाक पदार्थ हैं और हमेशा उचित डिस्पोजेबल सामग्रियों के साथ रासायनिक धुएं हुड में उपयोग किया जाना चाहिए।

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

मानव प्राथमिक सेल संस्कृतियों में circadian घड़ी जीन अभिव्यक्ति और हार्मोन के स्राव के समानांतर मापन

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

इंजिनियरिंग कृत्रिम कारक विशेष रूप से मानव कोशिकाओं में वैकल्पिक स्पष्टीकरण में हेरफेर करने के लिए

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

लेजर Microirradiation Vivo में अध्ययन करने के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं सरल और जटिल डीएनए क्षति

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

डीएनए संशोधनों के लिए Immunostaining: फोकल छवियों की गणना विश्लेषण

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq परख के साथ कम Mitochondrial डीएनए संदूषण प्राथमिक मानव सीडी 4 + टी लिम्फोसाइटों से

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

बढ़ाया खमीर एक संकर स्क्रीन मानव डीएनए दृश्यों के लिए प्रतिलेखन कारक की पहचान करने के लिए

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

मल्टीप्लेक्स पीसीआर और कैपिलरी इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा मछली-रोगजनक जीवाणु येर्सिनिया रूकी के मल्टी-लोक्स चर-संख्या टैंडम-रिपीट विश्लेषण

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

MARRVEL नेविगेट, एक वेब आधारित उपकरण है कि मानव जीनोमिक्स और मॉडल जीव आनुवंशिकी जानकारी एकीकृत करता है

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

रोग से जुड़े दुर्लभ मानव वेरिएंट Drosophila का उपयोग कर के Vivo कार्यात्मक अध्ययन में

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

आरएनए-सेक्यू विश्लेषण द्वारा मानव प्राथमिक केराटिनोसाइट्स के इन विट्रो भेदभाव का लक्षण वर्णन

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...