Name: 3d multicolor dna fish tool to study nuclear architecture in human primary cells
Uploaded: 2020-01-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells at JoVE.com

著者らは、3D多色DNA FISH画像の間の支援のために、INGMイメージング施設(イシティト・ナツィオナーレ・ディ・ジェネティスタ・モレコラレ「ロミオ・エド・エンリカ・インヴェルニッツィ」(INGM)、ミラノ、ミラノ、特にC.コルディグリエリの技術的支援を認める取得。この作品は、B.B.への助成金、EPIGENイタリアの旗艦プログラム、協会フランセーズ・コントル・レ・ミオパシー(AFM-Telethon、助成金nr 18754)、イタリア保健省のジョヴァニ・リセルカトリ(GR-2011-02349383)に支えられてきました。この作品は、F.M.への以下の助成金によって支えられてきました:フォンダツィオーネ・カリプロ(バンド・ジョヴァーニ、グラントnr 2018-0321)。

ニック翻訳によるDNAプローブ調製とラベリング手順
<ol><li>細菌人工染色体(BAC)、プラスミドまたはPCR製品を特定のキット(材料表)で精製し、精製し、アガロースゲル上の電気泳動でチェックし、定量します。</li>
	<li>表1に従って0.5 mLの低結合DNAチューブに全ての試薬を混合することにより、ステップ1.1から50μLの最終体積で1.5-2μgのDNAにニック翻訳を行う。<br...

<ol>
	<li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+territories,+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells.">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture.">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li><li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+3D+genome.">Organization and function of the 3D genome.</a> Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).</li><li>van Steensel, B., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+transcription+in+shaping+the+spatial+organization+of+the+genome.">The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).</li><li>Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+genome+organization+and+cognition.">Spatial genome organization and cognition.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).</li><li>Pombo, A., Dillon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+genome+architecture:+players+and+mechanisms.">Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).</li><li>Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+contact+permits+transcription+between+coregulated+genes.">Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes.</a> Cell. 155 (3), 606-620 (2013).</li><li>Therizols, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+decondensation+is+sufficient+to+alter+nuclear+organization+in+embryonic+stem+cells.">Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells.</a> Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).</li><li>Gonzalez-Sandoval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinuclear+Anchoring+of+H3K9-Methylated+Chromatin+Stabilizes+Induced+Cell+Fate+in+C.+elegans+Embryos.">Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos.</a> Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).</li><li>Hubner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+nuclear+landscapes+during+human+myelopoietic+cell+differentiation+maintains+co-aligned+active+and+inactive+nuclear+compartments.">Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).</li><li>Aymard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+long-range+contacts+unveils+clustering+of+DNA+double-strand+breaks+at+damaged+active+genes.">Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).</li><li>Sellou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poly(ADP-ribose)-dependent+chromatin+remodeler+Alc1+induces+local+chromatin+relaxation+upon+DNA+damage.">The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).</li><li>Krijger, P. H., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome.">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).</li><li>Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+TADs:+How+Alterations+of+Chromatin+Domains+Result+in+Disease.">Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease.</a> Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).</li><li>Cortesi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4q-D4Z4+chromatin+architecture+regulates+the+transcription+of+muscle+atrophic+genes+in+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy.">4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy.</a> Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).</li><li>Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+and+divergence+of+regulatory+strategies+at+Hox+Loci+and+the+origin+of+tetrapod+digits.">Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits.</a> PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).</li><li>Woltering, J. M., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrapod+axial+evolution+and+developmental+constraints;+Empirical+underpinning+by+a+mouse+model.">Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model.</a> Mechanisms of Development. 138, 64-72 (2015).</li><li>de Laat, W., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3C-based+technologies+to+study+the+shape+of+the+genome.">3C-based technologies to study the shape of the genome.</a> Methods. 58 (3), 189-191 (2012).</li><li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+decade+of+3C+technologies:+detailed+insights+into+nuclear+organization.">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes &amp; Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li><li>Finn, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Heterogeneity+and+Intrinsic+Variation+in+Spatial+Genome+Organization.">Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization.</a> Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).</li><li>Zheng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+chromatin+interactions+with+single-molecule+precision.">Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision.</a> Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).</li><li>Solovei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+on+tissue+cryosections.">Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections.</a> Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).</li><li>Cremer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+3D+fluorescence+in+situ+hybridization+for+imaging+interphase+chromosomes.">Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+three-dimensional+localization+microscopy+across+large+volumes.">High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes.</a> Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).</li><li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT.">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+genomic+loci+in+living+human+cells+by+an+optimized+CRISPR/Cas+system.">Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system.</a> Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).</li><li>Nelles, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+RNA+Tracking+in+Live+Cells+with+CRISPR/Cas9.">Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9.</a> Cell. 165 (2), 488-496 (2016).</li><li>Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifaceted+FISH+approach+to+study+endogenous+RNAs+and+DNAs+in+native+nuclear+and+cell+structures.">A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures.</a> Current Protocol of Human Genetics. , 15 (2013).</li><li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).</li><li>Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+nuclear+positioning+of+the+monoallelically+expressed+astrocyte+marker+GFAP.">Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP.</a> Genes &amp; Development. 22 (4), 489-498 (2008).</li><li>Kraus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+structured+illumination+microscopy+of+nuclear+structures.">Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures.</a> Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).</li><li>Solovei, I., Cremer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-FISH+on+cultured+cells+combined+with+immunostaining.">3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).</li><li>Skinner, B. M., Johnson, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+morphologies:+their+diversity+and+functional+relevance.">Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance.</a> Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).</li><li>Schoenfelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pluripotent+regulatory+circuitry+connecting+promoters+to+their+long-range+interacting+elements.">The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements.</a> Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).</li><li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling.">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).</li><li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+super-resolution+imaging+of+chromosomes+and+in+situ+haplotype+visualization+using+Oligopaint+FISH+probes.">Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes.</a> Nature Communication. 6, 7147 (2015).</li><li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+design+and+synthesis+platform+for+visualizing+genomes+with+Oligopaint+FISH+probes.">Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).</li><li>Samacoits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+framework+to+study+sub-cellular+RNA+localization.">A computational framework to study sub-cellular RNA localization.</a> Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).</li><li>Cardozo Gizzi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy-Based+Chromosome+Conformation+Capture+Enables+Simultaneous+Visualization+of+Genome+Organization+and+Transcription+in+Intact+Organisms.">Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms.</a> Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).</li><li>Mateo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+DNA+folding+and+RNA+in+embryos+at+single-cell+resolution.">Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution.</a> Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).</li><li>Nir, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Walking+along+chromosomes+with+super-resolution+imaging,+contact+maps,+and+integrative+modeling.">Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling.</a> PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).</li><li>Bintu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+chromatin+tracing+reveals+domains+and+cooperative+interactions+in+single+cells.">Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li></ol>

現在の方法は、ヒト一次細胞の広い範囲で3D多色DNA FISHを実行するためのステップバイステッププロトコルを記述する。DNA FISHは広く使用されている技術ですが、保存された3Dの相間核上の3D多色DNA FISHは、主に23、24を使用するサンプルの特性のために、多くの研究室で行うことが困難です。
プローブニック翻訳は、成功した3Dマ...

高い真核生物は、核1、2、3、4の分の3D空間で、膨大な量の遺伝情報を体系的に凝縮し、コンパクト化する必要があります。今日、我々は、ゲノムが区画およびトポロジー関連ドメイン5において空間的に秩序化され、DNAフォールディングの複数のレベルがクロマチンループ形成6、7を伴う可能性のある異なるゲノム領域間の接触を生成することを知っている。クロマチンの3D動的ループは、転写8、9、分化および現像10、11、DNA修復12、13、その摂動が様々な疾患14、15、16および発達欠陥15、17、18に関与している間、多くの異なる生物学的プロセスに影響を及ぼし得る。
3Dゲノム組織を研究するために多くのアプローチが開発されています。染色体コンフォメーションキャプチャベースの技術(C技術、3C、4C、5C、Hi-Cおよび誘導体)は、固定細胞3、4、19、20のゲノム組織を研究するために開発された。このようなアプローチは、物理的近接でゲノム遺伝子座間の接触周波数を捕捉する能力に基づいている。C-技術は、その複雑さに応じて、細胞集団3、4、19、20のグローバル3Dゲノム組織と核トポロジーをキャッチします。それにもかかわらず、3D相互作用は時間および空間において動的であり、多重相互作用からなる個々の細胞間で高度に可変であり、かつ広範囲に異種21、22である。
3D多色DNA蛍光インシトゥハイブリダイゼーション(FISH)は、特定のゲノム軌跡を単一細胞レベルで可視化し、C技術に対して3D核アーキテクチャを補完的に直接調査することを可能にする技術です。これは、C-結果を明確に検証するために現在使用されている技術を表します。3DマルチカラーDNA FISHは、興味のゲノム遺伝子座に相補的な蛍光標識プローブを使用しています。異なる蛍光発光器および適切な顕微鏡装置の使用は核空間23、24内の複数のターゲットの現代的な視覚化を可能にする。近年、FISHは、マイクロスコピーの技術進歩と組み合わされ、高解像度25、26、またはCRISPR-Cas法による微細スケール構造の可視化を得て、ライブイメージング27,28で核酸の可視化を行っている。広く採用されているにもかかわらず、3D多色DNA FISHアプローチは、使用される生物学的材料を適応しなければならないため、多くの研究室では依然として困難であると考えられている。
ここでは、幅広いヒト一次細胞に適用できる3D多色DNA FISH(細胞/プローブ調製からデータ解析まで)の包括的なプロトコルを提供し、多重ゲノム軌跡の可視化を可能にし、核の3D構造を維持します。核建築を研究するためには、核の3D構造を維持しなければならない。このため、他の既存のプロトコル29、30、31とは対照的に、クロマチン構造32に影響を与えるアルコールのアルコール勾配およびカバースリップの貯蔵の使用を避ける。この方法は、保存された3D DNA FISHプロトコル24、33から、広範囲のヒト一次細胞に適用されるように適合され、両方とも単離されたエクスビボまたはインビトロで培養される。異なる核形態および細胞学的特性に対する透過性および脱蛋白パラメータ(例えば、異なる核圧縮度、細胞骨格量)34がある。これらのパラメータは、一般に、異なる細胞型内での手順の明確な識別を提供することなく、他のプロトコル24、33で説明される。さらに、核空間内の異なる軌跡とその核トポロジー分布の3D近接性を自動で改善するデータ解析の原理を提供する、NuCLεD(3Dにおける核接触ロケータ)16という特定のツールを開発しました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin 488</td>
			<td>DBA</td>
			<td>DI7488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin 11 d-UTP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverlsips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>117500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CY3 d-UTP</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA53022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D21490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate (powder)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-203917A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin 11 d-UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093088910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21969-035 500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18010-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AMPD1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (C-G-A-T)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>BL0423A/C/G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644.2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Hyclone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutammine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15279-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278-5 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennycillin/Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070-063 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>P6887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhasePrep BAC DNA Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NA0100-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Gel Extraction &#38; PCR Purification Combo Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K220001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K210010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubbercement</td>
			<td>Bostik</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidina Alexa fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S21374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1110379026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d multicolor dna fish tool to study nuclear architecture in human primary cells

細胞生物学における大きな問題は、核空間内のゲノム組織と、クロマチンアーキテクチャが遺伝子発現、細胞同一性、分化などのプロセスにどのような影響を与えるかです。ゲノムの3Dアーキテクチャを研究するために開発された多くのアプローチは、染色体立体構造キャプチャベースの技術(C技術)とイメージングの2つの相補的なカテゴリーに分けることができます。前者は固定細胞集団における染色体立体構造と近位DNA相互作用を捉えるが、後者は3D保存核上のその場ハイブリダイゼーション(FISH)におけるDNA蛍光に基づいて、現代的な視覚化を可能にする単一の細胞レベル(多色)で複数の遺伝子座を有し、核内での相互作用と分布を調べる(3D多色DNA FISH)。3D多色DNA FISHの技術は、少数の所定の座位座のみを可視化するという制限があり、核アーキテクチャの包括的な分析を許さない。しかし、その結果の堅牢性を考えると、3D多色DNA FISHと3D顕微鏡と画像再構成を組み合わせて、C技術ベースの結果を検証し、特定の遺伝子座の位置と組織を明確に研究する方法です。1 つのセル レベルで。ここでは、幅広いヒト初等細胞に適した3D多色DNA FISHのステップバイステップ方式を提案し、成功した有益な3Dマルチカラーを得るために必要なすべての実用的な行動、重要なステップ、3Dイメージングの概念、およびデータ分析について議論するDNA FISH 異なる生物学的文脈の中で.

本稿で説明した3D多色DNA FISHの方法により、保存された3D核内の異なるゲノム軌跡を現代的に視覚化することができます(図1B)。このプロトコルは、対立遺伝子と、それらの空間的近接性を評価するために異なるゲノム遺伝子座との間の距離の測定を可能にし、かつ、核空間内の位置(例えば、心積心または核の周囲からの軌跡距離)16を評価す...

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3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

3DマルチカラーDNA FISHは、3D保存核内の複数のゲノム軌跡を視覚化するツールを表し、核空間内での相互相互作用と局在性を単一の細胞レベルで明確に定義します。ここで、ヒト一次細胞の広いスペクトルについて段階的にプロトコルをステップごとに説明する。

ヒト初等細胞の核アーキテクチャを研究する3D多色DNA FISHツール

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...

3D多色DNA FISHは、保存された核内の複数のゲノム座を可視化し、相互相互作用と局在化を単一細胞レベルであいまいに定義することを可能にする。3D多色DNA FISHは核建築の直接調査を可能にする。一般に、染色体キャプチャベースの技術と連携して動作し、この技術を単一セル内のCデータ検証用のツールとして利用できます。手順を実証することはフェデリカ・マラスカになります。彼女は私の研究室のポスドクです。開始DNA材料の長さに応じて摂氏16度の熱ミキサーでニック翻訳ミックスをインキュベートすることから始めます。インキュベーションの終わりに、2.2%のアガロースゲルでプローブのサイズを確認します。DNA FISH実験ごとに、150マイクロリットルの二重蒸留水でプローブを製造した出発DNA材料、標識されていないサケ精子DNA20マイクログラム、種特異的なコット1DNAの3.5マイクログラム、100%エタノールの3つの体積、および1時間から1/10モル酢酸ナトリウムの1/10体積に応じて適切な量のプローブを沈殿させる。インキュベーションの終わりに、摂氏4度で1時間、最高速度でサンプルを遠心分離します。上清を捨て、ペレットを70%エタノールの500マイクロリットルで2回洗浄します。2回目の洗浄後、ペレットを100%ホルムアミドの2マイクロリットルに再び懸濁し、プローブを摂氏40度で30分間振ってから、20%デキストラン硫酸塩にクエン酸4倍のクエン酸ナトリウムを等量加えます。小さな核と少量の細胞質を持つ小さな細胞の固定前処理と透過性については、まずPBSの200マイクロリットルの6番目の細胞に2倍の10を24ウェルプレートの個々のウェルのガラスカバーリップに直接加え、細胞が室温で30分間落ち着くようにします。インキュベーションの終了時に、PBSを300マイクロリットルの新たに調製した4%パラホルムアルデヒドを0.1%Tween 20で補います。10分後、固定細胞を0.05%TPBSの300マイクロリットルで室温で5分間洗浄します。最後の洗浄後、室温で10分間0.5%TPBSの300マイクロリットルでT細胞を透過させ、37°CでPBSで1時間希釈したRNAAseカクテルのウェルあたり250マイクロリットルで細胞を処理します。インキュベーションの終わりに、PBSの300マイクロリットルで細胞をすすい、4°Cで一晩インキュベーションで各井戸にPBSで20%グリセロールの300マイクロリットルを追加します。翌朝、ガラスをドライアイスの上に15〜30秒間置いて細胞を凍結させ、サンプルを室温で徐々に解凍し、PBSで300マイクロリットルの20%グリセロールに30秒間浸漬します。ちょうど実証したように細胞を3回凍結/解凍した後、室温で5分間0.5%TPBSの300マイクロリットルでサンプルを洗浄し、続いて室温で5分間0.05%TPBSの300マイクロリットルで2回洗浄します。最後の洗浄後、通常の塩酸を300マイクロリットルの0.1で室温で12分間処理し、続いて300マイクロリットルのクエン酸生理食塩水ナトリウムで2リンスを処理します。その後、室温でクエン酸2X生理食塩水ナトリウムに50%ホルムアミドの300マイクロリットルで一晩サンプルを固定します。固定のために、細胞質の高い量の大細胞の前処理および透過性は、ヒト初等T細胞に対して示されているように細胞を固定し、前処理し、透過し、0.01通常の塩酸中の0.0025%ペプシンの300マイクロリットルで0.0025%ペプシンを0.01秒から5分間治療する。光学顕微鏡下で細胞を観察し、核が細胞質から解放されるとすぐに50ミリモル塩化マグネシウムの300マイクロリットルで2回の5分間のスケで反応を止めるが、核子は依然として見えてそのままである。3D多色DNA FISHの場合、ハイブリダイゼーションプローブを摂氏80度で5分間変性させ、すぐにプローブを氷の上に置きます。プローブをクリーンな顕微鏡スライドに積み込み、細胞のカバースリップをプローブの各ドロップに1つ置きます。カバースリップの縁をゴムセメントで密封します。セメントが完全に乾燥したら、75°Cの加熱ブロックでサンプルを変性させます。4分後、水浴に浮かぶ金属製の箱の中で一晩摂氏37度でサンプルを水分補給します。翌朝、ゴムセメントを剥がし、スライドを2X生理塩水ナトリウムに浸してカバースリップを慎重に持ち上げます。各カバースリップを、1回あたり2ミリリットルの新鮮な生理食塩水ナトリウムクエン酸を含む6ウェルプレートの個々の井戸に入れ、毎分90回転で揺れ動かして摂氏37度で2回の5分間の打ち打ちを行います。インキュベーションの終わりに、4X生理食塩水ナトリウムクエン酸で0.2%Tween 20の2ミリリットルでカバーリップを短時間すすぎます。3D多色DNA FISH検出の場合、カバーリップを新しい24ウェルプレートの個々の井戸に移し、300マイクロリットルのブロッキングバッファ内の非特異的結合を摂氏37度で20分、毎分20回転でブロックします。インキュベーションの終わりに、37°Cの暗くて湿ったチャンバーで35分間ブロッキングバッファに希釈された抗ジゴキシゲニンおよび/またはストレプトアビジンの適切な濃度でサンプルを扱います。インキュベーションの終わりに、サンプルを6ウェルプレートの個々の井戸に移し、0.2%Tween 20と4X生理食塩水ナトリウムを1回5分間、毎分90回転で振って2ミリリットルでサンプルを3回洗浄します。最後の洗浄の後、PBSの2ミリリットルでサンプルを平衡化してから、カバーリップを新しい24ウェルプレートに移し、PBSで2%ホルムアルデヒドを300マイクロリットルで2%ホルムアルデヒドを室温で2分間固定します。固定細胞をPBSの300マイクロリットルで5回短時間洗浄し、続いて室温で5分間PBSの300マイクロリットルで1ミリリットル当たり1ナノグラムで希釈したDAPIで染色する。PBSでさらに5回カバーリップを洗い、適切な取り付け媒体でサンプルを取り付けます。その後、顕微鏡システムで3D画像を取得します。3D多色DNA FISHは保存された3D核の中で異なったゲノムのlociの現代的な視覚化を可能にする。DNAプローブ調製の場合、200塩基対未満のプローブサイズは、3D多色DNA FISHの手順を成功させます。ニック翻訳によって生成される最適でないDNA FISHプローブは、部分的または過剰に消化され得る。オーバー消化プローブは、ハイブリダイゼーションの特異性の喪失と結果的に背景の増加のために非特異的な信号をもたらす。ヒトの初等Tリンパ球および小さな核と細胞質の少ない細胞の場合、DNAプローブへの核のアクセスを促進し、核の完全性を維持するために、12分間0.1の正常な塩酸処理が推奨されます。細胞質ペプシン消化は、小細胞でのDNA FISH良いシグナルを得るために必要とされない。しかし、ヒトの原発性筋芽細胞や細胞質が豊富な細胞にとって、ペプシニンゼーションの工程は基本的なものです。短く、最適でない細胞骨格ペプシニンゼーションは、DNA FISHシグナルの不在で終わる核へのプローブの侵入を妨げる。しかし、細胞がペプシン化を超えている場合、核は3D構造を失ったままではありません。成功した 3D 多色 DNA FISH は、核内のシグナルの存在になります。私は新鮮な生物学的材料を使用して、3D多色DNA FISHを実行する前にプローブをテストし、新鮮な溶液を準備し、インキュベーション時間と温度を正確に行くことをお勧めします。formamideおよびHCLは有害物質であり、適切な使い捨て材料を含む化学ヒュームフードで常に使用する必要があることを覚えておいてください。

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

具体的にはヒト細胞における選択的スプライシングを操作するために工学人工要因

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

生体内で単純および複雑な DNA 損傷に対する細胞応答を研究するレーザー Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

主なヒト cd4 陽性 T リンパ球から低ミトコンドリア DNA 汚染 ATAC seq 試金

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

人間の DNA 配列に結合する転写因子を識別するために強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーン

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

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多重PCRと毛細血管電気泳動による魚病原性細菌エルシニアラッケリの多軌変動数のカンデム繰り返し分析

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

人間のゲノムとモデル生物遺伝学情報を統合するWebベースのツール、MARRVELのナビゲート

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

ショウジョウバエを用した疾患関連希少ヒト変異体の生体内機能的研究

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

RNA-Seq解析によるヒト原発性角化細胞のインビトロ分化の特徴

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...