Name: 3d multicolor dna fish tool to study nuclear architecture in human primary cells
Uploaded: 2020-01-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells at JoVE.com

Forfatterne erkjenner teknisk assistanse fra INGM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM), Milano, Italia), spesielt C. Cordiglieri, for hjelp under 3D flerfarget DNA FISH-bilder Oppkjøpet. Dette arbeidet har blitt støttet av følgende tilskudd til B.B.: EPIGEN italiensk flaggskipprogram, Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon, grant nr 18754) og Giovani Ricercatori, italiensk helsedepartement (GR-2011-02349383). Dette arbeidet har blitt støttet av følgende tilskudd til F.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321).

1. DNA sonde forberedelse og merking prosedyrer med nick oversettelse
<ol><li>Renog rengjør bakterielle kunstige kromosomer (BACer), plasmider eller PCR-produkter med spesifikke sett (Materialtabell),resuspender i ddH2O, sjekk med elektroforese på en agarosegel og kvantifiser.</li>
	<li>Utfør nick oversettelse på 1,5-2 μg DNA fra trinn 1.1 i et endelig volum på 50 μL ved å blande alle reagensene i en 0,5 ml lavbinding DNA-rør i henhold til tabell 1. MERK: Direkte...

<ol>
	<li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+territories,+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells.">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture.">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li><li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+3D+genome.">Organization and function of the 3D genome.</a> Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).</li><li>van Steensel, B., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+transcription+in+shaping+the+spatial+organization+of+the+genome.">The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).</li><li>Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+genome+organization+and+cognition.">Spatial genome organization and cognition.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).</li><li>Pombo, A., Dillon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+genome+architecture:+players+and+mechanisms.">Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).</li><li>Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+contact+permits+transcription+between+coregulated+genes.">Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes.</a> Cell. 155 (3), 606-620 (2013).</li><li>Therizols, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+decondensation+is+sufficient+to+alter+nuclear+organization+in+embryonic+stem+cells.">Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells.</a> Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).</li><li>Gonzalez-Sandoval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinuclear+Anchoring+of+H3K9-Methylated+Chromatin+Stabilizes+Induced+Cell+Fate+in+C.+elegans+Embryos.">Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos.</a> Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).</li><li>Hubner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+nuclear+landscapes+during+human+myelopoietic+cell+differentiation+maintains+co-aligned+active+and+inactive+nuclear+compartments.">Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).</li><li>Aymard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+long-range+contacts+unveils+clustering+of+DNA+double-strand+breaks+at+damaged+active+genes.">Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).</li><li>Sellou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poly(ADP-ribose)-dependent+chromatin+remodeler+Alc1+induces+local+chromatin+relaxation+upon+DNA+damage.">The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).</li><li>Krijger, P. H., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome.">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).</li><li>Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+TADs:+How+Alterations+of+Chromatin+Domains+Result+in+Disease.">Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease.</a> Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).</li><li>Cortesi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4q-D4Z4+chromatin+architecture+regulates+the+transcription+of+muscle+atrophic+genes+in+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy.">4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy.</a> Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).</li><li>Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+and+divergence+of+regulatory+strategies+at+Hox+Loci+and+the+origin+of+tetrapod+digits.">Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits.</a> PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).</li><li>Woltering, J. M., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrapod+axial+evolution+and+developmental+constraints;+Empirical+underpinning+by+a+mouse+model.">Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model.</a> Mechanisms of Development. 138, 64-72 (2015).</li><li>de Laat, W., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3C-based+technologies+to+study+the+shape+of+the+genome.">3C-based technologies to study the shape of the genome.</a> Methods. 58 (3), 189-191 (2012).</li><li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+decade+of+3C+technologies:+detailed+insights+into+nuclear+organization.">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes &amp; Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li><li>Finn, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Heterogeneity+and+Intrinsic+Variation+in+Spatial+Genome+Organization.">Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization.</a> Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).</li><li>Zheng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+chromatin+interactions+with+single-molecule+precision.">Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision.</a> Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).</li><li>Solovei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+on+tissue+cryosections.">Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections.</a> Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).</li><li>Cremer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+3D+fluorescence+in+situ+hybridization+for+imaging+interphase+chromosomes.">Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+three-dimensional+localization+microscopy+across+large+volumes.">High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes.</a> Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).</li><li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT.">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+genomic+loci+in+living+human+cells+by+an+optimized+CRISPR/Cas+system.">Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system.</a> Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).</li><li>Nelles, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+RNA+Tracking+in+Live+Cells+with+CRISPR/Cas9.">Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9.</a> Cell. 165 (2), 488-496 (2016).</li><li>Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifaceted+FISH+approach+to+study+endogenous+RNAs+and+DNAs+in+native+nuclear+and+cell+structures.">A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures.</a> Current Protocol of Human Genetics. , 15 (2013).</li><li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).</li><li>Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+nuclear+positioning+of+the+monoallelically+expressed+astrocyte+marker+GFAP.">Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP.</a> Genes &amp; Development. 22 (4), 489-498 (2008).</li><li>Kraus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+structured+illumination+microscopy+of+nuclear+structures.">Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures.</a> Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).</li><li>Solovei, I., Cremer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-FISH+on+cultured+cells+combined+with+immunostaining.">3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).</li><li>Skinner, B. M., Johnson, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+morphologies:+their+diversity+and+functional+relevance.">Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance.</a> Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).</li><li>Schoenfelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pluripotent+regulatory+circuitry+connecting+promoters+to+their+long-range+interacting+elements.">The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements.</a> Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).</li><li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling.">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).</li><li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+super-resolution+imaging+of+chromosomes+and+in+situ+haplotype+visualization+using+Oligopaint+FISH+probes.">Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes.</a> Nature Communication. 6, 7147 (2015).</li><li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+design+and+synthesis+platform+for+visualizing+genomes+with+Oligopaint+FISH+probes.">Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).</li><li>Samacoits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+framework+to+study+sub-cellular+RNA+localization.">A computational framework to study sub-cellular RNA localization.</a> Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).</li><li>Cardozo Gizzi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy-Based+Chromosome+Conformation+Capture+Enables+Simultaneous+Visualization+of+Genome+Organization+and+Transcription+in+Intact+Organisms.">Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms.</a> Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).</li><li>Mateo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+DNA+folding+and+RNA+in+embryos+at+single-cell+resolution.">Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution.</a> Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).</li><li>Nir, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Walking+along+chromosomes+with+super-resolution+imaging,+contact+maps,+and+integrative+modeling.">Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling.</a> PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).</li><li>Bintu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+chromatin+tracing+reveals+domains+and+cooperative+interactions+in+single+cells.">Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li></ol>

Den nåværende metoden beskriver en trinnvis protokoll for å utføre 3D flerfarget DNA FISH på et bredt spekter av menneskelige primære celler. Selv om DNA FISH er en teknologi i bred bruk, er 3D flerfarget DNA FISH på bevarte 3D-interfasekjerner fortsatt vanskelig å utføre i mange laboratorier, hovedsakelig på grunn av egenskapene til prøvene som brukes23,24.
Probe nick oversettelse er et grunnleggende skritt for vellykket 3D...

Høyere eukaryoter må systematisk kondensere og komprimere en stor mengde genetisk informasjon i minuttet 3D-rommet i kjernen1,2,3,4. I dag vet vi at genomet er romlig bestilt i rom og toologisk tilknyttede domener5, og at de flere nivåene av DNA-folding genererer kontakter mellom forskjellige genomiske regioner som kan innebære kromatinsløyfedannelse6,7. 3D dynamisk looping av kromatin kan påvirke mange forskjellige biologiske prosesser som transkripsjon8,9, differensiering og utvikling10,11, DNA reparasjon12,13, mens perturbations er involvert i ulike sykdommer14,15,16 og utviklingsdefekter15,17,18.
Mange tilnærminger har blitt utviklet for å studere 3D genom organisasjon. Kromosom konformasjonfangstbaserte teknologier (C-teknologier, 3C, 4C, 5C, Hi-C og derivater) er utviklet for å studere genomorganisasjon i faste celler3,4,19,20. Slike tilnærminger er basert på evnen til å fange kontaktfrekvensene mellom genomisk loci i fysisk nærhet. C-teknologier, avhengig av deres kompleksitet, fange den globale 3D genom organisasjon og kjernefysisk topologi av en cellepopulasjon3,4,19,20. Likevel er 3D-interaksjoner dynamiske i tid og rom, svært variabel mellom individuelle celler som består av multipleksinteraksjoner, og er omfattende heterogene21,22.
3D multicolor DNA fluorescens in situ hybridization (FISH) er en teknikk som gjør det mulig å visualisere spesifikke genomiske loci på et enkelt cellenivå, slik at direkte undersøkelse av 3D kjernefysisk arkitektur på en komplementær måte til C-teknologier. Det representerer en teknologi som for tiden brukes til å utvetydig validere C-resultater. 3D flerfarget DNA FISH bruker fluorescerende merkede sonder komplementære til genomiske loci av interesser. Bruk av forskjellige fluoropforer og egnet mikroskopiutstyr tillater moderne visualisering av flere mål innenfor kjernefysisk rom23,24. De siste årene har FISH blitt kombinert med teknologiske fremskritt i mikroskopi for å oppnå visualisering av finskala strukturer med høy oppløsning25,26 eller med CRISPR-Cas tilnærminger for visualisering av nukleinsyrer i live imaging27,28. Til tross for bred adopsjon, 3D flerfarget DNA FISH tilnærming er fortsatt ansett vanskelig i mange laboratorier fordi det biologiske materialet som brukes må tilpasses.
Her gir vi en omfattende protokoll for 3D flerfarget DNA FISH (fra celle / probe forberedelse til dataanalyse) som gjelder for et bredt spekter av menneskelige primære celler, slik at visualisering av flere genomiske loci og bevare 3D-strukturen av kjerner. For å studere kjernefysisk arkitektur må 3D-strukturen av kjerner bevares. Av denne grunn, kontrasterende fra andre eksisterende protokoller29,30,31, unngår vi bruk av en alkoholgradient og lagring av coverslips i alkohol som kan påvirke kromatinstruktur32. Metoden er tilpasset fra bevarte 3D DNA FISH protokoller24,33 som skal brukes på et bredt spekter av menneskelige primære celler, både isolert ex vivo eller kultivert in vitro. Det er permeabilisering sparameme- og deproteiniseringsparametere for ulike nuklekjernemorfologi og cytologiske egenskaper (f.eks. forskjellige grader av kjernefysisk komprimering, cytoskeleton overflod)34. Disse parametrene er ofte generelt beskrevet i andre protokoller24,33, uten å gi en klar diskriminering av prosedyren innenfor ulike celletyper. Videre utviklet vi et spesifikt verktøy kalt NuCLεD (kjernefysisk kontaktlokator i 3D)16, og gir prinsipper for dataanalyse som vil forbedre 3D-nærheten mellom ulike loci og deres kjernefysiske totoologiske distribusjon innen atomrommet på en automatisert måte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin 488</td>
			<td>DBA</td>
			<td>DI7488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin 11 d-UTP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverlsips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>117500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CY3 d-UTP</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA53022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D21490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate (powder)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-203917A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin 11 d-UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093088910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21969-035 500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18010-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AMPD1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (C-G-A-T)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>BL0423A/C/G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644.2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Hyclone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutammine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15279-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278-5 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennycillin/Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070-063 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>P6887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhasePrep BAC DNA Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NA0100-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Gel Extraction &#38; PCR Purification Combo Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K220001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K210010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubbercement</td>
			<td>Bostik</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidina Alexa fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S21374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1110379026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d multicolor dna fish tool to study nuclear architecture in human primary cells

Et stort spørsmål i cellebiologi er genomisk organisasjon innen atomrommet og hvordan kromatinarkitektur kan påvirke prosesser som genuttrykk, celleidentitet og differensiering. Mange tilnærminger utviklet for å studere 3D-arkitekturen i genomet kan deles inn i to komplementære kategorier: kromosomkonformasjon fangst basert teknologi (C-teknologier) og bildebehandling. Mens den tidligere er basert på å fange kromosomkonformasjonen og proksimale DNA-interaksjoner i en populasjon av faste celler, tillater sistnevnte, basert på DNA-fluorescens i situ hybridisering (FISH) på 3D-bevarte kjerner, moderne visualisering av flere loci på et enkelt cellenivå (flerfarget), undersøke deres interaksjoner og distribusjon i kjernen (3D flerfarget DNA FISH). Teknikken for 3D flerfarget DNA FISH har en begrensning av å visualisere bare noen få forhåndsbestemte loci, ikke tillater en omfattende analyse av kjernefysisk arkitektur. Men gitt robustheten av resultatene, er 3D flerfarget DNA FISH i kombinasjon med 3D-mikroskopi og bilderekonstruksjon en mulig metode for å validere C-teknologibaserte resultater og å entydig studere posisjonen og organiseringen av spesifikke loci på ett enkelt cellenivå. Her foreslår vi en trinnvis metode for 3D flerfarget DNA FISH egnet for et bredt spekter av menneskelige primærceller og diskutere alle praktiske handlinger, avgjørende trinn, forestillinger om 3D-avbildning og dataanalyse som trengs for å oppnå en vellykket og informativ 3D flerfarget DNA FISH innenfor ulike biologiske sammenhenger.

Metoden for 3D flerfarget DNA FISH beskrevet i denne artikkelen tillater moderne visualisering av ulike genomiske loci innenfor bevarte 3D-kjerner (Figur 1B). Denne protokollen tillater måling av avstander mellom alleler, og ulike genomiske loci for å evaluere deres romlige nærhet, og å vurdere deres plassering innenfor kjernefysiskplass (f.eks. loci avstand fra centroid eller periferien av kjernene)16. Det er imidlertid mange viktige trinn som m?...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells at JoVE.com

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

3D flerfarget DNA FISH representerer et verktøy for å visualisere flere genomiske loci innen 3D bevarte kjerner, utvetydig definere sine gjensidige interaksjoner og lokalisering i kjernefysisk plass på et enkelt cellenivå. Her er en trinnvis protokoll beskrevet for et bredt spekter av menneskelige primærceller.

3D flerfarget DNA FISH verktøy for å studere kjernefysisk arkitektur i menneskelige primære celler

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...

3D flerfarget DNA FISH muliggjør visualisering av flere genomiske loci i bevarte kjerner å tvetydig definere deres gjensidige interaksjon og lokalisering på enkeltcellenivå. 3D flerfarget DNA FISH tillater direkte undersøkelse av kjernefysisk arkitektur. Generelt fungerer det sammen med kromosomfangstbaserte teknologier som gjør teknikken til et tilgjengelig verktøy for C-datavalidering i enkeltceller.Å demonstrere prosedyren vil være Federica Marasca. Hun er postdoktor i laboratoriet mitt. Begynn med å inkubere nickoversettelsesblandingen i en termisk mikser ved 16 grader Celsius i henhold til lengden på start-DNA-materialet.På slutten av inkubasjonen, sjekk størrelsen på sondene på en 2,2% agarose gel. For hvert DNA FISH-eksperiment, utfell riktig mengde sonde i henhold til start-DNA-materialet som sondene ble produsert i 150 mikroliter dobbelt destillert vann, 20 mikrogram umerket laks sperm DNA, 3,5 mikrogram arter spesifikke Cot-1 DNA, tre volumer av 100% etanol, og en 1/10th volum av tre molar natriumacetat i en time på minus 80 grader Celsius. På slutten av inkubasjonen sentrifuger prøven ved maksimal hastighet i en time ved fire grader Celsius.Etter å ha kastet supernatanten, vask pelleten to ganger med 500 mikroliter på 70% etanol. Etter den andre vasken, resuspend pellet i to mikroliter på 100% formamid og riste sonden i 30 minutter ved 40 grader Celsius før du legger til et likt volum av 4X saltvann natriumsitrat i 20% dextransulfat. For fiksering forbehandling og permeabilisering av små celler med små kjerner og en lav mengde cytoplasma, legg først to ganger 10 til de sjette cellene i 200 mikroliter PBS direkte på glassdeksler i individuelle brønner av en 24-brønnsplate og la cellene bosette seg i 30 minutter ved romtemperatur.På slutten av inkubasjonen, raskt erstatte PBS med 300 mikroliter av nylaget 4% paraformaldehyd supplert med 0,1% Tween 20. Etter 10 minutter vasker du de faste cellene tre ganger i 300 mikroliter på 0,05% TPBS i fem minutter per vask ved romtemperatur. Etter siste vask, gjennomsyre T-cellene med 300 mikroliter på 0,5% TPBS i 10 minutter ved romtemperatur før du behandler cellene med 250 mikroliter per brønn med RNAse cocktail fortynnet 1:100 i PBS i en time ved 37 grader Celsius.På slutten av inkubasjonen, skyll cellene i 300 mikroliter PBS og tilsett 300 mikroliter på 20% glyserol i PBS til hver brønn med en overnattingsinkubasjon ved fire grader Celsius. Neste morgen, plasser glasset på tørris i 15 til 30 sekunder for å fryse cellene før du gradvis tiner prøvene ved romtemperatur og soaking dem i 300 mikroliter på 20% glyserol i PBS i 30 sekunder. Etter fryse /tining cellene tre ganger som nettopp demonstrert, vask prøvene i 300 mikroliter på 0,5% TPBS i fem minutter ved romtemperatur, etterfulgt av to vasker i 300 mikroliter på 0,05% TPBS i fem minutter per vask ved romtemperatur.Etter siste vask, behandle cellene med 300 mikroliter med 0,1 normal saltsyre i 12 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av to skyll i 300 mikroliter saltvannsnatriumsitrat. Deretter fikse prøvene over natten i 300 mikroliter på 50% formamid i 2X saltvann natriumsitrat ved romtemperatur. For fiksering, pre-behandling og permeabilisering av store celler med en høy mengde cytoplasma, fikse, pre-behandle og gjennomsyre cellene på samme måte som demonstrert for menneskelige primære T-celler og behandle prøvene med 300 mikroliter på 0,0025% pepsin i 0,01 normal saltsyre i noen sekunder opptil fem minutter.Observer cellene under et optisk mikroskop og stopp reaksjonen med to fem minutters vasker i 300 mikroliter på 50 millimolar magnesiumklorid så snart kjernene er fri for cytoplasma, men nucleoli er fortsatt synlige og intakte. For 3D flerfarget DNA FISH, denature hybridisering sonder på 80 grader Celsius i fem minutter og umiddelbart plassere sondene på is. Legg sondene på et rent mikroskopsklie og plasser en dekkslipp av celler på hver sondedråpe.Forsegle dekkglasskantene med gummisement. Når sementen har tørket helt, denature prøvene på en 75 grader Celsius varmeblokk. Etter fire minutter hydridiserer prøvene ved 37 grader Celsius over natten i en metallisk boks som flyter i et vannbad.Neste morgen, skrelle av gummisement og med lysbildene nedsenket i 2X saltvann natrium citrate forsiktig løfte av dekslene. Plasser hver dekkslip i individuelle brønner av en seks-brønns plate som inneholder to milliliter fersk saltvann natriumsitrat per brønn i to fem minutters vasker ved 37 grader Celsius med risting ved 90 omdreininger per minutt. På slutten av inkubasjonen, skyll dekkglassene kort i to milliliter på 0,2% Tween 20 i 4X saltvannnatriumsitrat.For 3D flerfarget DNA FISH-deteksjon, overfør dekkglassene til individuelle brønner av en ny 24-brønnsplate og blokker eventuelle uspesifikke bindinger i 300 mikroliter blokkerer buffer i 20 minutter ved 37 grader Celsius og 20 omdreininger per minutt. På slutten av inkubasjonen, behandle prøvene med riktig konsentrasjon av anti-digoksigenin og / eller streptavidin fortynnet i blokkerende buffer i 35 minutter i et mørkt og vått kammer ved 37 grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, overføre prøvene til individuelle brønner av en seks-brønns plate og vaske prøvene tre ganger i to milliliter på 0,2% Tween 20 og 4X saltvann natrium citrate i fem minutter per vask med risting på 90 omdreininger per minutt.Etter siste vask, likevekt prøvene i to milliliter PBS før overføring av dekkglass til en ny 24-brønns plate for etterfiksing i 300 mikroliter på 2% formaldehyd i PBS per brønn i to minutter ved romtemperatur. Vask de faste cellene fem ganger kort i 300 mikroliter PBS, etterfulgt av farging med DAPI fortynnet ved ett nanogram per milliliter i 300 mikroliter PBS i fem minutter ved romtemperatur. Vask dekkglassene fem ganger til i PBS og monter prøvene med et passende monteringsmedium.Deretter får du 3D-bilder med et mikroskopsystem. 3D flerfarget DNA FISH tillater moderne visualisering av ulike genomiske loci innenfor bevarte 3D-kjerner. For DNA-sondeforberedelse sikrer en sondestørrelse på mindre enn 200 basispar en vellykket 3D flerfarget DNA FISH-prosedyre.Suboptimale DNA FISH sonder produsert av nick oversettelse kan være delvis eller over fordøyd. Over fordøyde sonder vil resultere i et uspesifikt signal på grunn av tap av spesifisitet i hybridiseringen og en påfølgende økning av bakgrunnen. For humane primære T-lymfocytter og små celler med små kjerner og en lav mengde cytoplasma, anbefales en 12-minutters 0,1 normal saltsyrebehandling for å fremme nukleitilgjengelighet for DNA-sondene og for å bevare kjernefysisk integritet.Cytoplasmatisk pepsin fordøyelse er ikke nødvendig for å få et DNA FISH godt signal i små celler. For menneskelige primære myoblaster og celler som har store kjerner og rikelig cytoplasma, er pepsiniseringstrinnet grunnleggende. En kort og suboptimal cytoskeleton pepsinization vil hemme inntreden av sonden i kjernene som slutter i fravær av et DNA FISH signal.Men hvis cellene er over pepsinized, vil kjernene ikke forbli intakte å miste sin 3D-struktur. En vellykket 3D flerfarget DNA FISH vil resultere i tilstedeværelse av signal i kjernene. Jeg foreslår at du arbeider med ferskt biologisk materiale, tester sonder før du utfører 3D flerfarget DNA FISH, forbereder nye løsninger og er presise med inkubasjonstider og temperaturer.Husk at formamid og HCL er farlige stoffer og bør alltid brukes i en kjemisk røykhette med passende engangsmaterialer.

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallell Måling av biologiske klokke genekspresjon og hormon i Human primære cellekulturer

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Ingeniør Kunstige Faktorer å Spesifikt Manipulere alternativ spleising i humane celler

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation å studere i Vivo mobilnettet Svar å enkle og komplekse DNA skade

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining for DNA modifikasjoner: beregningsorientert analyse av AC Confocal bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq analysen med lav Mitokondrielt DNA forurensning fra primære menneskelige CD4 + T-lymfocytter

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Forbedret gjær ett-hybrid-skjermer å identifisere transkripsjon faktor Binding til menneskelig DNA-sekvenser

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-geometrisk variabel-nummer tandem-gjenta analyse av fisk-patogene bakterien Yersinia ruckeri av multiplex PCR og kapillær elektroforese

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

Navigering MARRVEL, en Web-basert verktøy som integrerer Human Genomics og modell organisme genetikk informasjon

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In vivo funksjonell studie av sykdom-Associated sjeldne Human varianter bruke Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Karakterisering av In Vitro differensiering av humane primære keratinocytter ved RNA-Seq Analyse

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...